CN110621779A - 具有溶菌酶活性的多肽、编码其的多核苷酸以及其用途和组合物 - Google Patents
具有溶菌酶活性的多肽、编码其的多核苷酸以及其用途和组合物 Download PDFInfo
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Abstract
披露了包含一种或多种具有溶菌酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂。披露了具有溶菌酶活性的多肽，编码这些多肽的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用这些多肽的方法。
Description
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发明背景
技术领域
本发明涉及具有溶菌酶活性的新颖LYS多肽，编码这些多肽的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，连同产生这些多肽的方法。本发明还涉及包含LYS多肽的组合物，特别是动物饲料，以及LYS多肽在动物饲料中的用途。
背景技术
溶菌酶是一种由许多生物作为对抗细菌的防御性机制而产生的O-糖基水解酶。该酶通过切割肽聚糖的糖苷键引起细菌细胞壁的水解；肽聚糖是细菌中的一种重要的结构分子。在细菌的细胞壁被溶菌酶作用弱化后，由不平衡的渗透压导致细菌细胞溶解。
溶菌酶天然存在于许多生物中，例如病毒、植物、昆虫、鸟类、爬行动物以及哺乳动物。在哺乳动物中，已经从鼻腔分泌物、唾液、眼泪、肠内容物、尿和乳中分离出溶菌酶。该酶切割N-乙酰胞壁酸的1号碳与N-乙酰-D-葡糖胺的4号碳之间的糖苷键。在体内，这两种碳水化合物聚合以形成许多微生物的细胞壁多糖。
目前已经将溶菌酶分类为七种不同的糖苷水解酶(GH)家族(CAZy，www.cazy.org)：GH18、GH19、鸡蛋清溶菌酶(GH22)、鹅蛋清溶菌酶(GH23)、噬菌体T4溶菌酶(GH24)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)鞭毛蛋白(GH73)以及拟鞘孢属(Chalaropsis)溶菌酶(GH25)。
从鸡蛋清提取的溶菌酶是在商业市场可获得的主要产品，但不切割例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁中的N,6-O-二乙酰胞壁酸并且因此尤其不能溶解这一重要的人类病原体(Masschalck B,Deckers D,Michiels CW(2002),“Lytic andnonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by lysozymeunder atmospheric and high hydrostatic pressure[在大气压和高流体静力压下由溶菌酶灭活革兰氏阳性细菌的溶解和非溶解机制]”,J Food Prot.[食品保护杂志]65(12):1916-23)。
已经提出了溶菌酶在动物饲料(参见例如WO 00/21381和WO 04/026334)，在乳酪生产(参见例如WO 05/080559)、食品保藏(Hughey和Johnson(1987)Appl EnvironMicrobiol[应用与环境微生物学]53:2165)、洗涤剂(参见例如US 5,041,236和EP0425016)、口腔护理(参见例如US 4,355,022、WO 04/017988和WO 08/124764)、美容和皮肤学、避孕、泌尿学、以及妇科(参见例如WO 08/124764)中的用途。
传统上，抗微生物生长促进剂(AGP)已经用于动物的生长促进，并且可能通过防止病原体例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的低水平感染来起作用。然而，AGP越来越多地被禁止在全世界范围内使用，并且因此促进动物生长但不是AGP的新解决方案是有利益性的。
发明内容
诸位发明人发现了一类具有溶菌酶活性的全新多肽。因此，本发明涉及一种组合物，该组合物包含至少0.01mg LYS多肽/千克组合物，其中该多肽(a)具有溶菌酶活性，并且(b)包含一个或多个LAD催化结构域；其中，当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model，HMM)查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为180。通常，通过利用HMM确定LAD催化结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询。
本发明进一步涉及具有溶菌酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少94％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少87％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少81％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少87％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少96.2％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少81％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(o)SEQ ID NO:3的多肽的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(p)SEQ ID NO:6的多肽的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:36，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(r)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:21、SEQID NO:24、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:42，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(s)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(t)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:39，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(u)SEQ ID NO:30的多肽的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7或8位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(v)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)或(u)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(w)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)或(u)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸的多肽；以及
(x)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)或(u)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％。
本发明还涉及包含本发明的LYS多肽的动物饲料添加剂或动物饲料；LYS多肽的溶菌酶在以下方面的用途：在动物饲料中，在动物饲料添加剂中，在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中，用于改善动物中的一个或多个性能参数。本发明进一步涉及改善动物的性能参数和制备动物饲料的方法；编码本发明多肽的分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞以及产生本发明LYS多肽的方法。本发明进一步涉及本发明的组合物在以下方面的用途：在动物饲料中；在动物饲料添加剂中；在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；用于改善动物饲料的营养价值；用于提高动物饲料的消化率；和/或用于改善动物中的一个或多个性能参数。
序列表概述
SEQ ID NO:1是从简青霉(Penicillium simplicissimum)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:2是从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是来自简青霉的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是从Penicillium vasconiae分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:5是从SEQ ID NO:4推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是来自Penicillium vasconiae的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是从解蛋白篮状菌(Talaromyces proteolyticus)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:8是从SEQ ID NO:7推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是来自解蛋白篮状菌的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是从曲霉属物种(Aspergillus sp.)XZ2668分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:11是从SEQ ID NO:10推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是来自曲霉属物种XZ2668的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是从南极青霉(Penicillium antarcticum)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:14是从SEQ ID NO:13推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是来自南极青霉的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是从Ovatospora brasiliensis分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:17是从SEQ ID NO:16推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是来自Ovatospora brasiliensis的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是从惠灵顿青霉(Penicillium wellingtonense)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:20是从SEQ ID NO:19推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是来自惠灵顿青霉的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是从玫瑰紫青霉(Penicillium roseopurpureum)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:23是从SEQ ID NO:22推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是来自玫瑰紫青霉的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是从帚青霉(Penicillium virgatum)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:26是从SEQ ID NO:25推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是来自帚青霉的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是从霉白曲霉(Aspergillus niveus)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:29是从SEQ ID NO:28推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是来自霉白曲霉的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是从毛壳菌属物种(Chaetomium sp.)ZY369分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:32是从SEQ ID NO:31推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是来自毛壳菌属物种ZY369的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是从Talaromyces atricola分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:35是从SEQ ID NO:34推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是来自Talaromyces atricola的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是从粗糙短梗蠕孢(Trichocladium asperum)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:38是从SEQ ID NO:37推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是来自粗糙短梗蠕孢的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40是从肉色绿僵菌(Metarhizium carneum)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:41是从SEQ ID NO:40推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是来自肉色绿僵菌的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43是从土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)分离的LYS多肽的cDNA序列。
SEQ ID NO:44是从SEQ ID NO:43推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45是来自土生梭孢壳霉的成熟LYS多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46是来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)的SWISSPROT:A1C4L9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47是来自热带盐孢菌(Salinispora tropica)的SWISSPROT:A4X6S9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48是来自海洋放线菌(Salinispora arenicola)的SWISSPROT:A8M1H3的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49是来自红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的SWISSPROT:Q3L9Z6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50是来自分枝杆菌(Mycobacterium)噬菌体Pacc40的SWISSPROT:B5U576的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是来自产红青霉(Penicillium rubens)的SWISSPROT:B6GZX8的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52是来自橙黄小单孢菌(Micromonospora aurantiaca)的SWISSPROT:D1S6X5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53是来自橙黄小单孢菌的SWISSPROT:D1S8J3的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:54是来自橙黄小单孢菌的SWISSPROT:D1SH66的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:55是来自黑孢块菌(Tuber melanosporum)的SWISSPROT:D5GBH0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:56是来自Hypocrea atroviridis的SWISSPROT:G9P583的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57是来自蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)的SWISSPROT:E9ED38的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:58是来自罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)的SWISSPROT:E9FAK9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:59是来自海洋疣孢菌(Verrucosispora maris)的SWISSPROT:F4F8N8的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:60是来自海洋疣孢菌的SWISSPROT:F4FI59的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61是来自球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的SWISSPROT:J4USU4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:62是来自土生梭孢壳霉的SWISSPROT:G2QV10的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:63是来自Micromonospora peucetia的SWISSPROT:A0A1C6W4S6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:64是来自产左聚糖微杆菌(Microbacterium laevaniformans)的SWISSPROT:H8E7T0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:65是来自脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)的SWISSPROT:I0PF45的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:66是来自羽扇豆小单孢菌(Micromonospora lupini)菌株Lupac的SWISSPROT:I0L0M9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:67是来自羽扇豆小单孢菌菌株Lupac的SWISSPROT:I0L3A4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:68是来自白色绿僵菌(Metarhizium album)的SWISSPROT:A0A0B2X541的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:69是来自粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis)的SWISSPROT:A0A168BML7的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:70是来自白色绿僵菌的SWISSPROT:A0A0B2WV75的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:71是来自布氏虫草(Cordyceps brongniartii)的SWISSPROT:A0A167BWW4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:72是来自莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)的SWISSPROT:A0A167ECQ5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:73是来自粗糙虫草(Cordyceps confragosa)的SWISSPROT:A0A162JZ16的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:74是来自粗糙虫草的SWISSPROT:A0A168DNP6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:75是来自粗糙虫草的SWISSPROT:A0A168D0L5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:76是来自玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)的SWISSPROT:A0A168BQC6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:77是来自玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)的SWISSPROT:A0A167XCS5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:78是来自玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)的SWISSPROT:A0A167NNI6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:79是来自淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)的SWISSPROT:A0A179H6H8的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:80是来自厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)的SWISSPROT:A0A179FH10的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:81是来自厚垣孢普可尼亚菌的SWISSPROT:A0A179F665的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:82是来自厚垣孢普可尼亚菌的SWISSPROT:A0A179F1Q1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:83是来自草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)的SWISSPROT:S7ZNE7的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:84是来自金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的SWISSPROT:A0A0D9PBV5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:85是来自金龟子绿僵菌的SWISSPROT:A0A0D9NPP1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:86是来自娄地青霉(Penicillium roqueforti)的SWISSPROT:W6QNL2的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87是来自冰岛篮状菌(Talaromyces islandicus)的SWISSPROT:A0A0U1M0W5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:88是来自扩展青霉(Penicillium expansum)的SWISSPROT:A0A0A2I9P6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:89是来自产黄支顶孢菌(Acremonium chrysogenum)的SWISSPROT:A0A086T4C8的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:90是来自龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)的SWISSPROT:X8ERY9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:91是来自分枝杆菌属物种TKK的SWISSPROT:A0A081HTU5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:92是来自半翅目虫壳(Torrubiella hemipterigena)的SWISSPROT:A0A0A1TMJ0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:93是来自半翅目虫壳的SWISSPROT:A0A0A1TNZ8的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:94是来自节杆菌属物种(Arthrobacter sp)PAMC的SWISSPROT:A0A0A1D149的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:95是来自犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)的SWISSPROT:A0A0A6UNI9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:96是来自大孢绿僵菌(Metarhizium majus)的SWISSPROT:A0A0B4I0X1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:97是来自碳样小单孢菌(Micromonospora carbonacea)的SWISSPROT:A0A0D0WU99的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:98是来自免疫原性分枝杆菌(Mycobacterium immunogenum)的SWISSPROT:A0A0D1LTE6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:99是来自明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)的SWISSPROT:A0A0F8A5E8的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:100是来自明尼苏达被毛孢的SWISSPROT:A0A0F8A6I7的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:101是来自巴西青霉(Penicillium brasilianum)的SWISSPROT:A0A0F7TVL0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:102是来自长瓣弯颈霉(Tolypocladium ophioglossoides)的SWISSPROT:A0A0L0N1U6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:103是来自足马杜拉分枝菌(Madurella mycetomatis)的SWISSPROT:A0A0M0UGY1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:104是来自Aspergillus udagawae的SWISSPROT:A0A0K8L1J1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:105是来自皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)的SWISSPROT:A0A0H5NX60的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:106是来自小单孢菌属物种(Micromonospora sp)HK10的SWISSPROT:A0A0M2RBW0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:107是来自小单孢菌属物种HK10的SWISSPROT:A0A0M2RKI6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:108是来自穆尔西亚青霉(Penicillium murcianum)的SWISSPROT:A0A1F5LVD8的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:109是来自小单孢菌属物种的SWISSPROT:A0A0M8XNG9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:110是来自盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii)的SWISSPROT:A0A0W7W0M4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:111是来自节杆菌属物种Soil761的SWISSPROT:A0A0Q9MHJ4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:112是来自节杆菌属物种Soil736的SWISSPROT:A0A0Q9MU26的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:113是来自微杆菌属物种(Microbacterium sp)No 7的SWISSPROT:A0A0P0DUT5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:114是来自节杆菌属物种Soil762的SWISSPROT:A0A0Q9N9Z1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:115是来自盐生小单孢菌(Micromonospora halophytica)的SWISSPROT:A0A1C6RVB7的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:116是来自黑色小单孢菌(Micromonospora nigra)的SWISSPROT:A0A1C6SUA9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:117是来自展青霉(Penicillium patulum)的SWISSPROT:A0A135LMU8的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:118是来自节杆菌属物种Leaf69的SWISSPROT:A0A0S9BYR1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:119是脓肿分枝杆菌的SWISSPROT:A0A0U0ZSQ6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:120是来自Mycobacterium canariasense的SWISSPROT:A0A100WIQ1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:121是来自利福霉素小单孢菌(Micromonospora rifamycinica)的SWISSPROT:A0A109IP50的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:122是来自利福霉素小单孢菌的SWISSPROT:A0A109IHN3的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:123是来自高山节杆菌(Arthrobacter alpinus)的SWISSPROT:A0A0S2M353的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:124是来自人微杆菌(Microbacterium hominis)的SWISSPROT:A0A134DEL4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:125是来自戈登菌属(Gordonia)噬菌体Obliviate的SWISSPROT:A0A142KAG2的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:126是来自串珠样小单孢菌(Micromonospora rosaria)的SWISSPROT:A0A136PN50的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:127是来自Tsukamurella pseudospumae的SWISSPROT:A0A138A7X6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:128是来自串珠样小单孢菌的SWISSPROT:A0A136PTZ6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:129是来自黑麦草腥黑穗病菌(Tilletia walkeri)的SWISSPROT:A0A177U5Z0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:130是来自小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa)的SWISSPROT:A0A177VGU0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:131是来自厚垣孢普可尼亚菌170的SWISSPROT:A0A179G202的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:132是来自厚垣孢普可尼亚菌170的SWISSPROT:A0A179G1N9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:133是来自厚垣孢普可尼亚菌170的SWISSPROT:A0A179FEB3的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:134是来自淡紫紫孢菌的SWISSPROT:A0A179HTK7的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:135是来自Paraphaeosphaeria sporulosa的SWISSPROT:A0A177C655的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:136是来自布氏虫草RCEF 3172的SWISSPROT:A0A167GE76的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:137是来自戈登菌属噬菌体Utz的SWISSPROT:A0A160DID3的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:138是来自嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)的SWISSPROT:A0A175J866的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:139是来自Mycobacterium conceptionense的SWISSPROT:A0A1A1X5E5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:140是来自那拉提瓦小单孢菌(Micromonospora narathiwatensis)的SWISSPROT:A0A1A8ZCI7的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:141是来自那拉提瓦小单孢菌的SWISSPROT:A0A1A8Z6H4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:142是来自Micromonospora auratinigra的SWISSPROT:A0A1A8Z6S5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:143是来自分枝杆菌属物种E1747的SWISSPROT:A0A1A2MHG1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:144是来自Micromonospora sediminicola的SWISSPROT:A0A1A9BD29的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:145是来自微杆菌属物种H83的SWISSPROT:A0A196L8B1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:146是来自马桑内酯小单孢菌(Micromonospora coriariae)的SWISSPROT:A0A1C4X8A3的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:147是来自柠檬色小单孢菌(Micromonospora citrea)的SWISSPROT:A0A1C6U2J5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:148是来自Micromonospora peucetia的SWISSPROT:A0A1C6V2H5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:149是来自杨浦小单孢菌(Micromonospora yangpuensis)的SWISSPROT:A0A1C6VFJ6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:150是来自根际小单孢菌(Micromonospora rhizosphaerae)的SWISSPROT:A0A1C6S481的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:151是来自棘橙小单孢菌(Micromonospora echinaurantiaca)的SWISSPROT:A0A1C5K5N0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:152是来自肌醇小单孢菌(Micromonospora inositola)的SWISSPROT:A0A1C5K0N2的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:153是来自肌醇小单孢菌的SWISSPROT:A0A1C5JUR0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:154是来自Micromonospora coxensis的SWISSPROT:A0A1C5JX99的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:155是来自Micromonospora mirobrigensis的SWISSPROT:A0A1C4ZAM5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:156是来自Micromonospora viridifaciens的SWISSPROT:A0A1C4Z5B4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:157是海口小单孢菌(Micromonospora haikouensis)的SWISSPROT:A0A1C4YQ99的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:158是来自Micromonospora peucetia的SWISSPROT:A0A1C6W5T7的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:159是来自柠檬色小单孢菌的SWISSPROT:A0A1C6W1B9的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:160是来自Micromonospora saelicesensis的SWISSPROT:A0A1C5A7S5的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:161是来自棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的SWISSPROT:A0A1C5A2Q7的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:162是来自产紫色小单孢菌(Micromonospora purpureochromogenes)的SWISSPROT:A0A1C4ZJ35的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:163是来自棘暗小单孢菌(Micromonospora echinofusca)的SWISSPROT:A0A1C5G758的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:164是来自棘橙小单孢菌的SWISSPROT:A0A1C5HSB2的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:165是来自柠檬色小单孢菌的SWISSPROT:A0A1C6TPW2的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:166是来自棘橙小单孢菌的SWISSPROT:A0A1C5IVI4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:167是来自苍白小单孢菌(Micromonospora pallida)的SWISSPROT:A0A1C6SEC0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:168是来自根际小单孢菌的SWISSPROT:A0A1C6SF84的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:169是来自苍白小单孢菌的SWISSPROT:A0A1C6SQT8的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:170是来自甲米小单孢菌(Micromonospora krabiensis)的SWISSPROT:A0A1C3N2H1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:171是来自甲米小单孢菌的SWISSPROT:A0A1C3N0X1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:172是来自分枝杆菌噬菌体Tonenili的SWISSPROT:A0A1C9EHM2的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:173是来自分枝杆菌噬菌体Tonenili的SWISSPROT:A0A1C9EHF6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:174是来自假诺卡氏菌属物种(Pseudonocardia sp)SCN 72-86的SWISSPROT:A0A1E4IB54的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:175是来自多疣微杆菌(Microbacterium pygmaeum)的SWISSPROT:A0A1G8AK84的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:176是来自假诺卡氏菌属物种SCN 73-27的SWISSPROT:A0A1E4NTZ4的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:177是来自分枝杆菌噬菌体Lukilu的SWISSPROT:A0A1J0MA43的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:178是来自Micromonospora avicenniae的SWISSPROT:A0A1N6R3C0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:179是来自脓肿分枝杆菌脓肿亚种(Mycobacterium abscessus subspabscessus)的SWISSPROT:A0A1N0VNN7的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:180是来自脓肿分枝杆菌脓肿亚种的SWISSPROT:A0A1N4DHL3的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:181是来自脓肿分枝杆菌脓肿亚种的SWISSPROT:A0A1N4RVY0的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:182是来自Micromonospora avicenniae的SWISSPROT:A0A1N6X5P6的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:183是来自脓肿分枝杆菌脓肿亚种的SWISSPROT:A0A1N2VK68的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:184是来自脓肿分枝杆菌脓肿亚种的SWISSPROT:A0A1N1GK82的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:185是来自脓肿分枝杆菌脓肿亚种的SWISSPROT:A0A1N1EP78的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:186是来自脓肿分枝杆菌脓肿亚种的SWISSPROT:A0A1N1G9F3的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:187是来自假诺卡氏菌属物种Ae717_Ps2的SWISSPROT:A0A1Q8LJS1的LAD结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:188是来自柄孢霉(Podospora anserina)的SWISSPROT:B2ASY2的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:189是来自产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的SWISSPROT:B6GZX8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:190是来自赤球丛赤壳菌(Nectria haematococca)的SWISSPROT:C7ZQ22的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:191是来自蝗绿僵菌的SWISSPROT:E9DSA6的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:192是来自罗伯茨绿僵菌的SWISSPROT:E9F1Z9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:193是来自罗伯茨绿僵菌的SWISSPROT:E9FC42的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:194是来自尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)的SWISSPROT:F9F2K5的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:195是来自尖孢镰孢菌的SWISSPROT:F9GF09的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:196是来自土生梭孢壳霉的SWISSPROT:G2QV10的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:197是来自土生梭孢壳霉的SWISSPROT:G2QV26的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:198是来自阿氏丝孢酵母阿氏变种(Trichosporon asahiivar.Asahii)的SWISSPROT:J5TH48的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:199是来自阿氏丝孢酵母阿氏变种的SWISSPROT:J4UH35的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:200是来自尖孢镰孢菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Lycopersici)的SWISSPROT:J9NQ28的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:201是来自尖孢镰孢菌番茄专化型的SWISSPROT:J9NQW0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:202是来自阿氏丝孢酵母阿氏变种的SWISSPROT:K1VMN5的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:203是来自阿氏丝孢酵母阿氏变种的SWISSPROT:K1WL46的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:204是来自尖孢镰孢菌甜瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Melonis)的SWISSPROT:W9Z045的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:205是来自尖孢镰孢菌甜瓜专化型的SWISSPROT:X0A5V9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:206是来自尖孢镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Cubense)的SWISSPROT:N1S551的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:207是来自尖孢镰孢菌古巴专化型的SWISSPROT:N4UD22的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:208是来自尖孢镰孢菌古巴专化型的SWISSPROT:N4UT47的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:209是来自尖孢镰孢菌的SWISSPROT:W9KWW4的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:210是来自尖孢镰孢菌枯萎病专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Vasinfectum)的SWISSPROT:X0MM97的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:211是来自串珠状赤霉(Gibberella moniliformis)的SWISSPROT:W7N5Q6的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:212是来自尖孢镰孢菌萝卜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Raphani)的SWISSPROT:X0BE07的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:213是来自尖孢镰孢菌的SWISSPROT:X0BII8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:214是来自尖孢镰孢菌豌豆专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Pisi)的SWISSPROT:W9NW59的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:215是来自尖孢镰孢菌豌豆专化型的SWISSPROT:W9NXR4的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:216是来自草酸青霉菌的SWISSPROT:S7ZNE7的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:217是来自草酸青霉菌的SWISSPROT:S7Z5Z6的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:218是来自尖孢镰孢菌番茄专化型的SWISSPROT:W9LDD0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:219是来自尖孢镰孢菌的SWISSPROT:W9HEM8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:220是来自尖孢镰孢菌的SWISSPROT:W9JDH4的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:221是来自藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)的SWISSPROT:S0EPI6的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:222是来自娄地青霉的SWISSPROT:W6QNL2的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:223是来自烧土火丝菌(Pyronema omphalodes)的SWISSPROT:U4LJD9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:224是来自烧土火丝菌的SWISSPROT:U4LG64的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:225是来自高大假裸囊菌(Pseudogymnoascus pannorum)的SWISSPROT:A0A094AK50的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:226是来自尖孢镰孢菌的SWISSPROT:W9JIH2的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:227是来自尖孢镰孢菌番茄根专化型(Fusarium oxysporumf.sp.radicis-lycopersici)的SWISSPROT:X0FW82的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:228是来自产黄支顶孢菌的SWISSPROT:A0A086TBY7的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:229是来自产黄支顶孢菌的SWISSPROT:A0A086T755的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:230是来自产黄支顶孢菌的SWISSPROT:A0A086T4C8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:231是来自金龟子绿僵菌的SWISSPROT:A0A086NNR4的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:232是来自金龟子绿僵菌的SWISSPROT:A0A086NFK5的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:233是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094FY19的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:234是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094G1N0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:235是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094GEA0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:236是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094GJR5的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:237是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094G660的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:238是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A093YBN4的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:239是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094FSZ5的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:240是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094FBW1的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:241是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094H0G2的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:242是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094H7M1的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:243是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A093Y8W3的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:244是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094GYN9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:245是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A093XAD4的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:246是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094H7J6的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:247是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094E0I1的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:248是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094CC50的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:249是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094II95的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:250是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094IAA0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:251是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094IBC0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:252是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094E946的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:253是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094A3A0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:254是来自棒曲霉的SWISSPROT:A1C4L9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:255是来自棒曲霉的SWISSPROT:A1CBV9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:256是来自费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)的SWISSPROT:A1DA80的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:257是来自费希新萨托菌的SWISSPROT:A1DBW2的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:258是来自费希新萨托菌的SWISSPROT:A1DDF2的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:259是来自土曲霉(Aspergillus terreus)的SWISSPROT:Q0CED1的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:260是来自土曲霉的SWISSPROT:Q0CED2的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:261是来自土曲霉的SWISSPROT:Q0CV85的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:262是来自球毛壳菌(Chaetomium globosum)的SWISSPROT:Q2GND8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:263是来自球毛壳菌的SWISSPROT:Q2GND9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:264是来自球毛壳菌的SWISSPROT:Q2H6W7的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:265是来自烟新萨托菌(Neosartorya fumigata)的SWISSPROT:Q4WAY2的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:266是来自烟新萨托菌的SWISSPROT:Q4WBR4的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:267是来自烟新萨托菌的SWISSPROT:Q4WVY3的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:268是来自产黄青霉的SWISSPROT:B6H9X5的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:269是来自产黄青霉的SWISSPROT:B6HR38的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:270是来自赤球丛赤壳菌的SWISSPROT:C7Z8W0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:271是来自赤球丛赤壳菌的SWISSPROT:C7ZQ20的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:272是来自红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的SWISSPROT:G0RP87的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:273是来自土生梭孢壳霉的SWISSPROT:G2RG69的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:274是来自异宗梭孢壳菌(Thielavia heterothallica)的SWISSPROT:G2QNE9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:275是来自红褐肉座菌的SWISSPROT:G0RM22的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:276是来自嗜热毛壳菌嗜热变种(Chaetomium thermophilumvar.Thermophilum)的SWISSPROT:G0SG36的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:277是来自嗜热毛壳菌嗜热变种的SWISSPROT:G0RZV3的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:278是来自尖孢镰孢菌番茄专化型的SWISSPROT:J9NQV9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:279是来自异宗梭孢壳菌的SWISSPROT:G2QD02的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:280是来自异宗梭孢壳菌的SWISSPROT:G2QNF0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:281是来自绿色肉座菌(Hypocrea virens)的SWISSPROT:G9MHR1的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:282是来自罗伯茨绿僵菌的SWISSPROT:E9ELX9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:283是来自尖孢镰孢菌的SWISSPROT:F9F2K4的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:284是来自嗜热毛壳菌嗜热变种的SWISSPROT:G0RZV2的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:285是来自土生梭孢壳霉的SWISSPROT:G2RG70的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:286是来自尖孢镰孢菌甜瓜专化型的SWISSPROT:W9Z992的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:287是来自尖孢镰孢菌甜瓜专化型的SWISSPROT:W9ZZW9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:288是来自尖孢镰孢菌甜瓜专化型的SWISSPROT:W9ZAE8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:289是来自尖孢镰孢菌古巴专化型的SWISSPROT:N1RWA4的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:290是来自尖孢镰孢菌古巴专化型的SWISSPROT:N4UKT7的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:291是来自尖孢镰孢菌的SWISSPROT:W9KX02的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:292是来自尖孢镰孢菌萝卜专化型的SWISSPROT:X0B4J3的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:293是来自娄地青霉的SWISSPROT:W6QE02的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:294是来自娄地青霉的SWISSPROT:W6R4X8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:295是来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的SWISSPROT:A0A024S9B8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:296是来自金龟子绿僵菌的SWISSPROT:A0A086NN36的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:297是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094GA03的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:298是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094C8U1的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:299是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A093Z6Z8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:300是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094IML3的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:301是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094GY79的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:302是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A093XPZ7的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:303是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A093XAS9的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:304是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094I8J6的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:305是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094FTL0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:306是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094AT39的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:307是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A093XSP5的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:308是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094BAE6的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:309是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094IE25的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:310是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094HNM8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:311是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094ETJ5的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:312是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094EPJ7的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:313是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094E9W0的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:314是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094BWD6的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:315是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A094BTS1的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:316是来自高大假裸囊菌的SWISSPROT:A0A093ZTZ8的溶菌酶增强结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:317是保守基序I AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES。
SEQ ID NO:318是保守基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP。
SEQ ID NO:319是保守基序III[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN]。
SEQ ID NO:320是质粒pDAu770的合成DNA构建体。
SEQ ID NO:321是正向引物KKSC0972-F。
SEQ ID NO:322是反向引物KKSC0972-R。
SEQ ID NO:323是正向引物F1。
SEQ ID NO:324是反向引物F1。
SEQ ID NO:325是正向引物F3。
SEQ ID NO:326是反向引物F3。
SEQ ID NO:327，正向结合引物。
SEQ ID NO:328，反向结合引物。
SEQ ID NO:329是来自Ovatospora brasiliensis的截短LYA多肽的氨基酸序列。
附图说明
图1代表质粒pDAu770上包含的不同DNA特征的图谱。amy2基因座侧翼区(3’和5’)由白色框表示。对于pyrG、tef1和tpi基因的启动子区域，用绿色框表示启动子区。紫色框表示选择盒(针对氨苄青霉素抗性的ampR和针对乙酰胺选择的amdS)。对于niaD和amg基因的终止子区，用蓝色框表示终止子区。FLPase的编码区(sFLP)和pyrG基因的第一个外显子以橙色表示。pyrG内含子的5’区以灰色表示。质粒的复制起点由ORI表示。
图2是通过转化DNA(质粒pDAu724或衍生物或OverlapExtension PCR产物)转化宿主菌株DAu785的示意图。
上图代表amy2基因座，其中整合了由FRT-F和FRT-F3构成的FLP着陆垫、FLPase识别位点、以及amdS(乙酰胺)选择标记和FLPase表达盒。已经使用了分裂的PyrG标记，并且在amy2基因座处插入了pyrG标记的5'端。
中间图代表转化DNA，特别是通过FLPase介导的位点特异性重组而在FLP着陆垫处整合的区域。质粒或PCR产物必须含有FRT-F和F3位点以及pyrG标记的剩余3'部分。
下图代表在FRT位点之间转化DNA的位点特异性整合后所得的amy2基因座。已经将amdS和FLP盒与GOI表达盒和重构完整功能选择标记的pyrG标记的3’部分进行了交换。
定义
动物：术语“动物”是指除人以外的任何动物。动物的实例是单胃动物，包括但不限于猪(包括但不限于仔猪、成长猪、和母猪)；家禽，例如火鸡、鸭、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽子(包括乳鸽)和鸡(包括但不限于肉用仔鸡(本文称为肉鸡)、小鸡、下蛋鸡(本文称为蛋鸡))；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)，甲壳类动物(包括但不限于河虾和对虾)，以及鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、菖鲉(bocachico)、鲤科鱼、鲶鱼、卡叉马鱼(cachama)、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、瓜波特鱼(guapote)、大比目鱼、爪哇鱼(java)、野鲮属鱼、莱鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼(paco)、珍珠斑点鱼(pearlspot)、佩杰瑞鱼(pejerrey)、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼(sampa)、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼(shiner)、睡鲨(sleeper)、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼(sweetfish)、丁鲷、特罗尔鱼(terror)、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼和白鱼)。
动物饲料：术语“动物饲料”是指适合于或旨在用于由单胃动物摄入的任何化合物、制剂或混合物。用于单胃动物的动物饲料通常包含浓缩物以及维生素、矿物质、酶、直接饲喂微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)。
抗微生物活性：本文将术语“抗微生物活性”定义为一种杀死微生物或抑制微生物的生长的活性，这些微生物是例如藻类、古细菌、细菌、真菌和/或原生动物。抗微生物活性可以是例如意在杀死细菌的杀菌的或意在阻止细菌的生长的抑菌的。抗微生物活性可以包括催化在肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸与N-乙酰-D-葡糖胺残基之间以及在壳糊精中的N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-键的水解。抗微生物活性还可以包括LYS多肽结合在微生物的表面并抑制其生长。抗微生物作用还可以包括通过抑制或减少细菌毒素并且通过噬菌素作用使用本发明的LYS多肽作为免疫刺激剂激活细菌自溶素。
体增重：术语“体增重”意指在给定时间段期间动物的活重的增加，例如从第1天到第21天的体重增加。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
浓缩物：术语“浓缩物”意指具有高蛋白和能量浓度的饲料，例如鱼粉、糖蜜、低聚糖、高粱、种子和谷物(例如来自玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦的整体或由破碎、碾磨等制备的)、油籽滤饼(例如来自棉籽、红花、向日葵、大豆(例如豆粕)、油菜籽/卡诺拉(canola)、花生或落花生)、棕榈仁饼、酵母衍生材料和酒糟(例如湿酒糟(WDS)和具有可溶物的干酒糟(DDGS))。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
欧洲生产效能因子(EPEF)：“欧洲生产效能因子(European Production EfficacyFactor)”是一种比较动物性能的方法。这种单一数字有助于比较农场内部和农场之间的性能，并可用于评估环境、气候和管理变量。EPEF计算为[(存活率(％)×活体重(kg))/(耗竭时的年龄(天)×FCR)]×100，其中存活率是出栏时存活的动物的百分比，活体重是出栏时动物的平均体重，耗竭年龄是出栏时动物的年龄，并且FCR是出栏时的饲料转化率。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
饲料转化率(FCR)：FCR是动物将饲料质量转换为所需输出增加的效率的量度。饲养肉用动物-例如猪、家禽和鱼-输出是动物获得的质量。具体而言，FCR是遍及指定的时间段内，按照饲料摄入量除以增重计算的。FCR的改善意指FCR值的降低。FCR改善2％意为FCR降低2％。
饲料效率：术语“饲料效率”意指当动物在一段时间内被任意喂养或喂养指定量的食物时每单位饲料的增重的量。“增加的饲料效率”意味着根据本发明的饲料添加剂组合物在饲料中的使用导致与不用所存在的所述饲料添加剂组合物喂养的动物相比，每单位饲料摄入的增加的增重。
草料：如本文定义的术语“草料”还包括粗粮。草料是新鲜的植物物料，例如来自草料植物(禾草)和其他草料植物(海草、发芽谷物和豆类植物)或其任何组合的干草和青贮。草料植物的实例是紫花苜蓿(Alfalfa、lucerne)、百脉根、芸苔属植物(例如，羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉、芜菁甘蓝(瑞典芜菁)、萝卜)、三叶草(例如，杂三叶、红三叶、地三叶、白三叶)、禾草(例如，百慕大草、雀麦、伪燕麦草、羊茅、石南草(heath grass)、草地早熟禾、鸭茅(orchard grass)、黑麦草、梯牧草(Timothy-grass))、玉米(玉蜀黍)、小米、大麦、燕麦、黑麦、高粱、大豆和小麦和蔬菜(例如甜菜)。草料进一步包括来自谷物生产的作物残余物(例如玉米秸秆；来自小麦、大麦、燕麦、黑麦和其他谷物的秸秆)；来自蔬菜像甜菜缨(beettop)的残余物；来自油籽生产像来自大豆、油菜籽和其他豆科作物的茎和叶的残余物；以及来自用于动物或人消耗的谷物精制或来自燃料生产或其他行业的部分。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的LYS多肽；其中该片段具有溶菌酶活性。
在一方面，该片段包含成熟多肽长度的至少90％，例如SEQ ID NO:2的至少203个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少203个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少203个氨基酸、SEQ ID NO:6的至少203个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少200个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少200个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少273个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少273个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少205个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少205个氨基酸、SEQ ID NO:17的至少207个氨基酸、SEQID NO:18的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:20的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:21的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:23的至少208个氨基酸、SEQ ID NO:24的至少208个氨基酸、SEQ IDNO:26的至少205个氨基酸、SEQ ID NO:27的至少205个氨基酸、SEQ ID NO:29的至少205个氨基酸、SEQ ID NO:30的至少205个氨基酸、SEQ ID NO:32的至少203个氨基酸、SEQ ID NO:33的至少203个氨基酸、SEQ ID NO:35的至少202个氨基酸、SEQ ID NO:36的至少202个氨基酸、SEQ ID NO:38的至少202个氨基酸、SEQ ID NO:39的至少202个氨基酸、SEQ ID NO:41的至少273个氨基酸、SEQ ID NO:42的至少273个氨基酸、SEQ ID NO:44的至少204个氨基酸或SEQ ID NO:45的至少204个氨基酸。
在一方面，该片段包含成熟多肽长度的至少92％，例如SEQ ID NO:2的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:6的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少205个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少205个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少279个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少279个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少209个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少209个氨基酸、SEQ ID NO:17的至少211个氨基酸、SEQID NO:18的至少211个氨基酸、SEQ ID NO:20的至少211个氨基酸、SEQ ID NO:21的至少211个氨基酸、SEQ ID NO:23的至少213个氨基酸、SEQ ID NO:24的至少213个氨基酸、SEQ IDNO:26的至少209个氨基酸、SEQ ID NO:27的至少209个氨基酸、SEQ ID NO:29的至少209个氨基酸、SEQ ID NO:30的至少209个氨基酸、SEQ ID NO:32的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:33的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:35的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:36的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:38的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:39的至少207个氨基酸、SEQ ID NO:41的至少279个氨基酸、SEQ ID NO:42的至少279个氨基酸、SEQ ID NO:44的至少208个氨基酸或SEQ ID NO:45的至少208个氨基酸。
在一方面，该片段包含成熟多肽长度的至少94％，例如SEQ ID NO:2的至少212个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少212个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少212个氨基酸、SEQ ID NO:6的至少212个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少209个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少209个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少285个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少285个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少214个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少214个氨基酸、SEQ ID NO:17的至少216个氨基酸、SEQID NO:18的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:20的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:21的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:23的至少218个氨基酸、SEQ ID NO:24的至少218个氨基酸、SEQ IDNO:26的至少214个氨基酸、SEQ ID NO:27的至少214个氨基酸、SEQ ID NO:29的至少214个氨基酸、SEQ ID NO:30的至少214个氨基酸、SEQ ID NO:32的至少212个氨基酸、SEQ ID NO:33的至少212个氨基酸、SEQ ID NO:35的至少211个氨基酸、SEQ ID NO:36的至少211个氨基酸、SEQ ID NO:38的至少211个氨基酸、SEQ ID NO:39的至少211个氨基酸、SEQ ID NO:41的至少285个氨基酸、SEQ ID NO:42的至少285个氨基酸、SEQ ID NO:44的至少213个氨基酸或SEQ ID NO:45的至少213个氨基酸。
在一方面，该片段包含成熟多肽长度的至少96％，例如SEQ ID NO:2的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:6的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少214个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少214个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少291个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少291个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少218个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少218个氨基酸、SEQ ID NO:17的至少220个氨基酸、SEQID NO:18的至少220个氨基酸、SEQ ID NO:20的至少220个氨基酸、SEQ ID NO:21的至少220个氨基酸、SEQ ID NO:23的至少222个氨基酸、SEQ ID NO:24的至少222个氨基酸、SEQ IDNO:26的至少218个氨基酸、SEQ ID NO:27的至少218个氨基酸、SEQ ID NO:29的至少218个氨基酸、SEQ ID NO:30的至少218个氨基酸、SEQ ID NO:32的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:33的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:35的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:36的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:38的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:39的至少216个氨基酸、SEQ ID NO:41的至少291个氨基酸、SEQ ID NO:42的至少291个氨基酸、SEQ ID NO:44的至少217个氨基酸或SEQ ID NO:45的至少217个氨基酸。
在一方面，该片段包含成熟多肽长度的至少98％，例如SEQ ID NO:2的至少221个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少221个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少221个氨基酸、SEQ ID NO:6的至少221个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少218个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少218个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少297个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少297个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:17的至少225个氨基酸、SEQID NO:18的至少225个氨基酸、SEQ ID NO:20的至少225个氨基酸、SEQ ID NO:21的至少225个氨基酸、SEQ ID NO:23的至少227个氨基酸、SEQ ID NO:24的至少227个氨基酸、SEQ IDNO:26的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:27的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:29的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:30的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:32的至少221个氨基酸、SEQ ID NO:33的至少221个氨基酸、SEQ ID NO:35的至少220个氨基酸、SEQ ID NO:36的至少220个氨基酸、SEQ ID NO:38的至少220个氨基酸、SEQ ID NO:39的至少220个氨基酸、SEQ ID NO:41的至少297个氨基酸、SEQ ID NO:42的至少297个氨基酸、SEQ ID NO:44的至少222个氨基酸或SEQ ID NO:45的至少222个氨基酸。
在一方面，该片段包含成熟多肽长度的至少99％，例如SEQ ID NO:2的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:6的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少220个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少220个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少300个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少300个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少225个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少225个氨基酸、SEQ ID NO:17的至少227个氨基酸、SEQID NO:18的至少227个氨基酸、SEQ ID NO:20的至少227个氨基酸、SEQ ID NO:21的至少227个氨基酸、SEQ ID NO:23的至少229个氨基酸、SEQ ID NO:24的至少229个氨基酸、SEQ IDNO:26的至少225个氨基酸、SEQ ID NO:27的至少225个氨基酸、SEQ ID NO:29的至少225个氨基酸、SEQ ID NO:30的至少225个氨基酸、SEQ ID NO:32的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:33的至少223个氨基酸、SEQ ID NO:35的至少222个氨基酸、SEQ ID NO:36的至少222个氨基酸、SEQ ID NO:38的至少222个氨基酸、SEQ ID NO:39的至少222个氨基酸、SEQ ID NO:41的至少300个氨基酸、SEQ ID NO:42的至少300个氨基酸、SEQ ID NO:44的至少224个氨基酸或SEQ ID NO:45的至少224个氨基酸。
融合多肽：术语“融合多肽”是其中一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端融合的多肽。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
杂合多肽：术语“杂合多肽”是指包含来自两个或更多个多肽的结构域的多肽，例如，来自一个多肽的结合结构域和来自另一个多肽的催化结构域。这些结构域可以在N-末端或C-末端融合。
分离的：术语“分离的”是指以在自然界中不存在的形式的物质或处于在自然界中不存在该物质的环境中的该物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
溶菌酶活性：术语“溶菌酶活性”意指肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-键的水解，导致溶菌作用。溶菌酶属于EC 3.2.1.17酶类。溶菌酶活性通常通过溶菌酶对滕黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 4698的裂解作用来测量。在适当的实验条件下，这些变化与培养基中溶菌酶的量成比例(c.f.联合国粮食及农业组织联合食品添加剂规格综合纲要(the Combined Compendium of Food AdditiveSpecifications of the Food and Agriculture Organisation of the UN)的INS 1105(www.fao.org))。出于本发明的目的，根据实例1中所述的还原末端测定法(“使用还原末端测定法测定溶菌酶活性”)来测定溶菌酶活性。如果该多肽对滕黄微球菌ATCC 4698具有活性，则该多肽具有溶菌酶活性。
在一方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:12的至少50％，例如优选至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、或最优选至少100％的溶菌酶活性，优选其中如实例1所述测定溶菌酶活性。在一方面，本发明的多肽具有SEQ IDNO:12的至少50％，例如优选至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、或最优选至少100％的溶菌酶活性，其中如下测定溶菌酶活性：将LYS多肽(在磷酸盐缓冲液(5mM柠檬酸盐、5mM K2HPO4、0.01％TritonX-100、pH 5.0)中的50μL0.7μg/mL LYS多肽)与溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)溶液(在milli-Q水中的450μL 1％冻干的溶壁微球菌，ATCC号4698)混合，并且伴随振荡(500rpm)在40℃下孵育45分钟；将样品离心(4000g，5分钟)；将上清液(100μL)与HCl(50μL 3.2M)混合并在95℃下孵育80分钟；添加NaOH(50μL，3.5M)并将150μL的样品添加到在酒石酸K-Na/NaOH缓冲液(75μL的50g/L K-Na酒石酸盐+20g/L NaOH)中的4-羟基苯甲酰肼里；将该混合物在95℃下孵育10分钟；并且在405nm处测量光密度。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等)之后处于其最终形式的多肽。
在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至226，并且SEQ ID NO:2的氨基酸-19至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸1至226。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸1至226，并且SEQ ID NO:5的氨基酸-19至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸1至226。在一方面，该成熟多肽是SEQ IDNO:8的氨基酸1至223，并且SEQ ID NO:8的氨基酸-20至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸1至223。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:11的氨基酸1至304，并且SEQ ID NO:11的氨基酸-20至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:12的氨基酸1至304。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸1至228，并且SEQ IDNO:14的氨基酸-19至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:15的氨基酸1至228。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:17的氨基酸1至230，并且SEQ ID NO:17的氨基酸-20至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:18的氨基酸1至230。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:20的氨基酸1至230，并且SEQ ID NO:20的氨基酸-21至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:21的氨基酸1至230。在一方面，该成熟多肽是SEQ IDNO:23的氨基酸1至232，并且SEQ ID NO:23的氨基酸-22至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:24的氨基酸1至232。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:26的氨基酸1至228，并且SEQ ID NO:26的氨基酸-20至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:27的氨基酸1至228。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:29的氨基酸1至228，并且SEQ IDNO:29的氨基酸-20至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:30的氨基酸1至228。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:32的氨基酸1至226，并且SEQ ID NO:32的氨基酸-19至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:33的氨基酸1至226。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:35的氨基酸1至225，并且SEQ ID NO:35的氨基酸-20至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:36的氨基酸1至225。在一方面，该成熟多肽是SEQ IDNO:38的氨基酸1至225，并且SEQ ID NO:38的氨基酸-19至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:39的氨基酸1至225。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:41的氨基酸1至304，并且SEQ ID NO:41的氨基酸-19至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:42的氨基酸1至304。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:44的氨基酸1至227，并且SEQ IDNO:44的氨基酸-19至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:45的氨基酸1至227。
在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞以不同的方式加工多肽，且因此表达多核苷酸的一种宿主细胞当与表达相同多核苷酸的另一种宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有溶菌酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
获得自或可获得自：术语“获得自或可获得自”是指多肽可以在来自特定分类等级的生物中发现。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自真菌界，其中术语界是分类等级。在一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自子囊菌门(Ascomycota)，其中术语门是分类等级。在另一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自盘菌亚门(Pezizomycotina)，其中术语亚门是分类等级。
如果多肽的分类等级未知，则它可以容易地由本领域普通技术人员通过进行多肽的BLASTP检索(使用例如国家生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information，NCIB)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)并将其与最接近的同系物进行比较来确定。作为已知多肽的片段的未知多肽被认为是属于相同的分类物种。包括在多达10个位置中的取代、缺失和/或插入的未知天然多肽或人工变体被认为来自与已知多肽相同的分类物种。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
粗粮：术语“粗粮”意指具有高水平纤维的干植物物料，例如来自种子和谷物以及作物残余物(例如秸秆、干椰肉(copra)、稻草、谷壳、甜菜废料)的纤维、麸、苞叶。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。Needle标注的“最长同一性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比同一性，并且如下计算：
(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。Needle标注的“最长同一性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比同一性，并且如下计算：
(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中子序列编码具有溶菌酶活性的片段。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指含有按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％的与其天然或重组地相关的其他多肽材料的制剂。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。
变体：术语“变体”意指包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个(若干个)氨基酸残基的改变(即，取代、插入、和/或缺失)的具有溶菌酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据该位置的氨基酸之后添加1、2、或3个氨基酸。
在一方面，根据本发明的变体可以包含从1至5；从1至10；从1至15；从1至20；从1至25；从1至30；从1至35；从1至40；从1至45；或1-50，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个改变。
在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:12的至少50％，例如优选至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、或最优选至少100％的溶菌酶活性，优选其中如实例1所述测定溶菌酶活性。在一方面，本发明的变体具有SEQ IDNO:12的至少50％，例如优选至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、或最优选至少100％的溶菌酶活性，其中如下测定溶菌酶活性：将LYS多肽(在磷酸盐缓冲液(5mM柠檬酸盐、5mM K2HPO4、0.01％TritonX-100、pH 5.0)中的50μL0.7μg/mL LYS多肽)与溶壁微球菌溶液(在milli-Q水中的450μL 1％冻干的溶壁微球菌，ATCC号4698)混合，并且伴随振荡(500rpm)在40℃下孵育45分钟；将样品离心(4000g，5分钟)；将上清液(100μL)与HCl(50μL 3.2M)混合并在95℃下孵育80分钟；添加NaOH(50μL，3.5M)并将150μL的样品添加到在酒石酸K-Na/NaOH缓冲液(75μL的50g/L K-Na酒石酸盐+20g/L NaOH)中的4-羟基苯甲酰肼里；将该混合物在95℃下孵育10分钟；并且在405nm处测量光密度。
在一方面，根据本发明的变体可以包含从1至5；从1至10；从1至15；从1至20；从1至25；从1至30；从1至35；从1至40；从1至45；或1-50，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个改变，并且具有SEQ ID NO:12的至少50％，例如优选至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、或最优选至少100％的溶菌酶活性，优选其中如实例1所述测定溶菌酶活性。
命名法
出于本发明的目的，命名法[E/Q]是指在该位置的氨基酸可以是谷氨酸(Glu，E)或谷氨酰胺(Gln，Q)。同样，命名[V/G/A/I]意指在此位置的氨基酸可以是缬氨酸(Val，V)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)或异亮氨酸(Ile，I)，对于如本文所述的其他组合，依次类推。除非进一步另有限制，否则氨基酸X被这样定义，使得它可以是20种天然氨基酸中的任一种。
具体实施方式
诸位发明人发现了一类具有溶菌酶活性的全新多肽。所述多肽在结构上与已知的溶菌酶相当不同。如下面的序列同一性矩阵所示，本发明的多肽均具有与WO 2013/076259中披露的现有技术序列相比小于45％的序列同一性，这表明这些新颖多肽可具有与已知溶菌酶不同的折叠模式。
本发明的多肽表现出典型的溶菌酶活性，例如在针对溶壁微球菌的传统OD下降测定法(参见实例14)或使用溶壁微球菌作为底物的还原末端测定法(参见实例13)中的活性。
具有溶菌酶活性的本发明的多肽在本文中被称为LYS多肽，并且包含一个或多个LAD(溶菌酶活性结构域)催化结构域和任选的一个或多个溶菌酶增强结构域(LED)。
包含具有溶菌酶活性的多肽的组合物
在第一方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含至少0.01mg LYS多肽/千克组合物，其中该多肽(a)具有溶菌酶活性，并且(b)包含一个或多个LAD催化结构域；其中，当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型(HMM)查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为180，并且其中通过利用HMM确定LAD催化结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询。
在一个实施例中，该多肽进一步包含一个或多个溶菌酶增强结构域(LED)。因此，本发明进一步涉及一种组合物，该组合物包含至少0.01mg LYS多肽/千克组合物，其中：
(a)该LYS多肽具有溶菌酶活性；
(b)该LYS多肽包含一个或多个LAD催化结构域；其中，当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型(HMM)查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为180，并且其中通过利用HMM确定LAD催化结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询；
(c)该多肽包含一个或多个LED结构域，其中当使用SEQ ID NO:188至316和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该LED的domT评分至少为100，并且其中使用hmmscan软件程序执行该查询。
如Durbin等人(Biological sequence analysis:probabilistic models ofproteins and nucleic acids[生物序列分析：蛋白质和核酸的概率模型],CambridgeUniversity Press[剑桥大学出版社],1998)和Krogh等人(1994J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]235:1501-1531)(均通过引用并入本文)所述的序型HMM背后的理论是基于蛋白质组比对中各氨基酸在各位置处出现的概率的蛋白质组的表征。
具体而言，序型HMM是多个序列比对或甚至单个序列的统计模型。它们捕获有关比对的各列的保守程度以及哪些残基是有可能的位置特异性信息。所有的序型方法或多或少都是多序列比对的共有性的统计描述。它们使用针对氨基酸或核苷酸(残基)的位置特异性评分，以及用于开放和延伸插入或缺失的位置特异性罚分。传统的成对比对(例如BLAST、FASTA或Smith/Waterman算法)使用与位置无关的评分参数。序型的这一特性捕获以下重要信息：多重比对中各个位置的保守程度以及空位和插入所允许的变化程度。
使用HMM的优点是HMM具有正规的概率基准。概率理论用于指导应如何设置所有评分参数。最重要的方面之一是HMM具有用于设置位置特异性空位和插入评分的一致理论。这些方法是一致的，因此具有高度的自动化性，可将数百种序型HMM应用于例如全基因组分析。蛋白质结构域模型数据库的一个实例是Pfam(Sonnhammer等人,1997,‘Acomprehensive database of protein families based on seed alignments[基于种子比对的蛋白质家族综合数据库]’,Proteins[蛋白质],28:405-420；Finn等人,2010,‘ThePfam protein families database[Pfam蛋白质家族数据库]’,Nucl.Acids Res.[核酸研究],38:D211-D222)，其是Interpro蛋白质结构域标注系统的重要部分。Pfam的构建和使用与HMMER软件包紧密相关(参见https://en.wikipedia.org/wiki/HMMER)。
LAD催化结构域以以下方式定义。使用具有默认设置的软件程序MUSCLE v3.8.31将SEQ ID NO:46至187(即Uniprot条目的部分序列，如本文的‘序列表概述’部分中所解释的)进行比对。使用此比对，为LAD催化结构域建立了隐马尔可夫模型(HMM)。使用软件包HMMER 3.0(2010年3月)(http://hmmer.org/)中的软件程序’hmmbuild’构建HMM，并使用默认设置启用该软件。
如果domT评分至少为170，则使用软件包HMMER 3.0(2010年3月)(http://hmmer.org/)中的软件程序’hmmscan’，使用默认设置，将LAD催化结构域定义为与上述HMM匹配。在一个优选的实施例中，domT评分是至少175，优选至少180，更优选至少185，甚至更优选至少190，甚至更优选至少195，或最优选至少200。
实例10给出了根据上述方法使用SEQ ID NO:46至187产生的LAD催化结构域的HMM序型。可以将HMM序型复制到文本文件中，然后将其加载到软件程序’hmmscan’中，以便可以测试其他多肽以查看所述多肽是否包含一个或多个LAD催化结构域。
溶菌酶增强结构域(LED)以以下方式定义。使用具有默认设置的软件程序MUSCLEv3.8.31将SEQ ID NO:188至316(即Uniprot条目的部分序列，如本文的‘序列表概述’部分中所解释的)进行比对。使用此比对，为LED建立了隐马尔可夫模型(HMM)。使用软件包HMMER3.0(2010年3月)(http://hmmer.org/)中的软件程序’hmmbuild’构建HMM，并使用默认设置启用该软件。
如果domT评分至少为100，则使用软件包HMMER 3.0(2010年3月)(http://hmmer.org/)中的软件程序’hmmscan’，使用默认设置，将LED定义为与上述HMM匹配。在一个优选的实施例中，domT评分是至少103，优选至少106，更优选至少109，更优选至少112，更优选至少115，更优选至少118，甚至更优选至少121，或最优选至少124。
实例11给出了根据上述方法使用SEQ ID NO:188至316产生的LED的HMM序型。可以将HMM序型复制到文本文件中，然后将其加载到软件程序’hmmscan’中，以便可以测试其他多肽以查看所述多肽是否包含一个或多个LED。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少175，LED的domT评分为至少100。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少180，LED的domT评分为至少100。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少185，LED的domT评分为至少100。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少190，LED的domT评分为至少100。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少195，LED的domT评分为至少100。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少200，LED的domT评分为至少100。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少175，LED的domT评分为至少103。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少180，LED的domT评分为至少103。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少185，LED的domT评分为至少103。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少190，LED的domT评分为至少103。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少195，LED的domT评分为至少103。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少200，LED的domT评分为至少103。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少175，LED的domT评分为至少106。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少180，LED的domT评分为至少106。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少185，LED的domT评分为至少106。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少190，LED的domT评分为至少106。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少195，LED的domT评分为至少106。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少200，LED的domT评分为至少106。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少175，LED的domT评分为至少109。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少180，LED的domT评分为至少109。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少185，LED的domT评分为至少109。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少190，LED的domT评分为至少109。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少195，LED的domT评分为至少109。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少200，LED的domT评分为至少109。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少175，LED的domT评分为至少112。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少180，LED的domT评分为至少112。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少185，LED的domT评分为至少112。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少190，LED的domT评分为至少112。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少195，LED的domT评分为至少112。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少200，LED的domT评分为至少112。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少175，LED的domT评分为至少115。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少180，LED的domT评分为至少115。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少185，LED的domT评分为至少115。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少190，LED的domT评分为至少115。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少195，LED的domT评分为至少115。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少200，LED的domT评分为至少115。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少175，LED的domT评分为至少118。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少180，LED的domT评分为至少118。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少185，LED的domT评分为至少118。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少190，LED的domT评分为至少118。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少195，LED的domT评分为至少118。在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分为至少200，LED的domT评分为至少118。
在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在第一方面的一个实施例中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽，其中将该多肽以至少0.01mg多肽/千克组合物给予，并且该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(r)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；以及
(s)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％。
在第一方面的一个实施例中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽，其中将该LYS多肽以至少0.01mg多肽/千克组合物给予，并且该LYS多肽包含选自由以下组成的组的LAD催化结构域：
(a)与SEQ ID NO:3的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的氨基酸81至220具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸161至304具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的氨基酸88至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的氨基酸87至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的氨基酸90至232具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的氨基酸83至222具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的氨基酸82至225具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸161至303具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；以及
(o)与SEQ ID NO:45的氨基酸85至227具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽。
在第一方面的一个实施例中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽，其中将该LYS多肽以至少0.01mg多肽/千克组合物给予，并且该LYS多肽包含选自由以下组成的组的LAD催化结构域：
(a)与SEQ ID NO:3的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的氨基酸81至220具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸161至304具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的氨基酸88至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的氨基酸87至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的氨基酸90至232具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的氨基酸83至222具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的氨基酸82至225具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸161至303具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；以及
(o)与SEQ ID NO:45的氨基酸85至227具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
并且其中该LYS多肽包含LED结构域且选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸1至72具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的氨基酸1至72具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸96至167具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；以及
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸96至168具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽。
在第一方面的任一部分的一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ IDNO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ IDNO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在第一方面的任一部分的一个实施例中，该多肽是真菌来源的。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自分类学子囊菌门，优选分类学盘菌亚门。
在第一方面的任一部分的一个实施例中，该组合物包含至少0.01mg的多肽(酶蛋白)/千克组合物，例如至少0.02mg、0.05mg、0.10mg、0.2mg、0.5mg、1.0mg、2mg、5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1.0g、2.5g、5g、7.5g、10g、25g、50g、75g或100g/千克组合物。在一个实施例中，该组合物包含至多250g的多肽/千克组合物，例如至多150g、100g、50g、40g、30g、20g、10g、7.5g、5g、2.5g、1.0g、750mg、500mg、250mg、100mg、50mg、25mg、10mg、5mg、2.5mg或1mg/千克组合物。在一个实施例中，该组合物包含在0.01mg和250g之间的多肽(酶蛋白质)/千克组合物，例如在0.02mg、0.05mg、0.10mg、0.2mg、0.5mg、1.0mg、2mg、5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1.0g、2.5g、5g、7.5g、10g、25g、50g、75g或100g/千克组合物和150g、100g、50g、40g、30g、20g、10g、7.5g、5g、2.5g、1.0g、750mg、500mg、250mg、100mg、50mg、25mg、10mg、5mg、2.5mg或1mg/千克组合物之间，或其任何组合。
在第一方面的任一部分的一个实施例中，该组合物包含一种或多种配制剂(例如本文描述的那些)，优选地选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土、麦芽糊精、环糊精、小麦、PVA、乙酸盐、磷酸盐和纤维素，优选地选自以下列表，该列表由以下组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。
在第一方面的任一部分的一个实施例中，该组合物包含一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶优选地选自由以下组成的组：乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、脂肪酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酶、果胶裂解酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
在第一方面的任一部分的一个实施例中，该组合物包含一种或多种益生菌。该一种或多种益生菌优选选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、双歧杆菌属物种、肉食杆菌属物种、丁酸梭菌、梭菌属物种、屎肠球菌、肠球菌属物种、乳杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属物种、明串珠菌属物种、埃氏巨型球菌、巨型球菌属物种、乳酸片球菌、片球菌属物种、特氏丙酸杆菌、丙酸杆菌属物种和链球菌属物种或其任何组合。
包含具有溶菌酶活性的多肽的颗粒
在第二方面，本发明涉及包含LYS多肽的颗粒，其中该多肽(a)具有溶菌酶活性，并且(b)包含一个或多个LAD催化结构域；其中，当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型(HMM)查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为180，并且其中通过利用HMM确定LAD催化结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询。在一个实施例中，该颗粒包含核心粒子和一个或多个包衣。在一个优选的实施例中，该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。优选的配制品披露在下文的配制品部分中。
在一个实施例中，该多肽进一步包含一个或多个溶菌酶增强结构域(LED)。因此，本发明进一步涉及包含LYS多肽的颗粒，其中：
(a)该LYS多肽具有溶菌酶活性；
(b)该LYS多肽包含一个或多个LAD催化结构域，其中当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为170，并且其中通过利用HMM确定LAD催化结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询；
(c)该多肽包含一个或多个LED结构域，其中当使用SEQ ID NO:188至316和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该LED的domT评分至少为100，并且典型地其中通过利用HMM确定溶菌酶增强结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询。
在一个实施例中，该颗粒包含核心粒子和一个或多个包衣。在一个优选的实施例中，该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。优选的配制品披露在下文的配制品部分中。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分是至少175，优选至少180，更优选至少185，甚至更优选至少190，甚至更优选至少195，或最优选至少200。在一个实施例中，LED的domT评分是至少103，优选至少106，更优选至少109，更优选至少112，更优选至少115，更优选至少118，甚至更优选至少121，或最优选至少124。domT评分的优选组合如本发明的第一方面中所披露。
在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在第二方面的一个实施例中，本发明涉及包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽的颗粒，其中该LYS多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(r)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；以及
(s)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％。
在一个实施例中，该颗粒包含核心粒子和一个或多个包衣。在一个优选的实施例中，该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。优选的配制品披露在下文的配制品部分中。
在第二方面的一个实施例中，本发明涉及包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽的颗粒，其中该LYS多肽包含LAD催化结构域且选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的氨基酸81至220具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸161至304具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的氨基酸88至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的氨基酸87至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的氨基酸90至232具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的氨基酸83至222具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的氨基酸82至225具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸161至303具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；以及
(o)与SEQ ID NO:45的氨基酸85至227具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽。
在第二方面的一个实施例中，本发明涉及包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽的颗粒，其中该LYS多肽包含LAD催化结构域且选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的氨基酸81至220具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸161至304具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的氨基酸88至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的氨基酸87至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的氨基酸90至232具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的氨基酸83至222具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的氨基酸82至225具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸161至303具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；以及
(o)与SEQ ID NO:45的氨基酸85至227具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
并且其中该LYS多肽包含LED结构域且选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸1至72具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的氨基酸1至72具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸96至167具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；以及
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸96至168具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽。
在一个实施例中，该颗粒包含核心粒子和一个或多个包衣。在一个优选的实施例中，该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。优选的配制品披露在下文的配制品部分中。
在第二方面的任一部分的一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ IDNO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ IDNO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在第二方面的任一部分的一个实施例中，该多肽是真菌来源的。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自分类学子囊菌门，优选分类学盘菌亚门。
在第一方面的任一部分的一个实施例中，该组合物包含至少0.01mg的多肽(酶蛋白)/千克组合物，例如至少0.02mg、0.05mg、0.10mg、0.2mg、0.5mg、1.0mg、2mg、5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1.0g、2.5g、5g、7.5g、10g、25g、50g、75g或100g/千克组合物。在一个实施例中，该组合物包含至多250g的多肽/千克组合物，例如至多150g、100g、50g、40g、30g、20g、10g、7.5g、5g、2.5g、1.0g、750mg、500mg、250mg、100mg、50mg、25mg、10mg、5mg、2.5mg或1mg/千克组合物。在一个实施例中，该组合物包含在0.01mg和250g之间的多肽(酶蛋白质)/千克组合物，例如在0.02mg、0.05mg、0.10mg、0.2mg、0.5mg、1.0mg、2mg、5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1.0g、2.5g、5g、7.5g、10g、25g、50g、75g或100g/千克组合物和150g、100g、50g、40g、30g、20g、10g、7.5g、5g、2.5g、1.0g、750mg、500mg、250mg、100mg、50mg、25mg、10mg、5mg、2.5mg或1mg/千克组合物之间，或其任何组合。
在第二方面的任一部分的一个实施例中，该颗粒包含一种或多种配制剂(例如本文描述的那些)，优选地选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土、麦芽糊精、环糊精、小麦、PVA、乙酸盐、磷酸盐和纤维素，优选地选自以下列表，该列表由以下组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。
在第二方面的任一部分的一个实施例中，该颗粒包含核心粒子和一个或多个包衣。在一个优选的实施例中，该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。优选的配制品披露在下文的配制品部分中。
在第二方面的任一部分的一个实施例中，该颗粒包含一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶优选地选自由以下组成的组：乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、脂肪酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酶、果胶裂解酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
在第二方面的任一部分的一个实施例中，该颗粒包含一种或多种益生菌。该一种或多种益生菌优选选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、双歧杆菌属物种、肉食杆菌属物种、丁酸梭菌、梭菌属物种、屎肠球菌、肠球菌属物种、乳杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属物种、明串珠菌属物种、埃氏巨型球菌、巨型球菌属物种、乳酸片球菌、片球菌属物种、特氏丙酸杆菌、丙酸杆菌属物种和链球菌属物种或其任何组合。
包含具有溶菌酶活性的多肽的液体配制品
在第三方面，本发明涉及液体配制品，其中该液体配制品包含：
(a)0.01％至25％w/w的LYS多肽，其中：
(i)该LYS多肽具有溶菌酶活性；
(ii)该LYS多肽包含一个或多个LAD催化结构域，其中当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为170，并且其中通过利用HMM确定LAD催化结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询；
(b)20％至80％w/w的多元醇；
(c)0.01％至2.0％w/w的防腐剂；以及
(d)水。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分是至少175，优选至少180，更优选至少185，甚至更优选至少190，甚至更优选至少195，或最优选至少200。在一个实施例中，LED的domT评分是至少103，优选至少106，更优选至少109，更优选至少112，更优选至少115，更优选至少118，甚至更优选至少121，或最优选至少124。domT评分的优选组合如本发明的第一方面中所披露。
在一个实施例中，该多肽进一步包含一个或多个溶菌酶增强结构域(LED)。因此，本发明进一步涉及液体配制品，其中该液体配制品包含：
(a)0.01％至25％w/w的LYS多肽，其中：
(i)该LYS多肽具有溶菌酶活性；
(ii)该LYS多肽包含一个或多个LAD催化结构域，其中当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为170，并且其中通过利用HMM确定LAD催化结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询；
(iii)该LYS多肽包含一个或多个LED结构域，其中当使用SEQ ID NO:188至316和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该LED的domT评分至少为100，并且其中通过利用HMM确定溶菌酶增强结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询；
(b)20％至80％w/w的多元醇；
(c)0.01％至2.0％w/w的防腐剂；以及
(d)水。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分是至少175，优选至少180，更优选至少185，甚至更优选至少190，甚至更优选至少195，或最优选至少200。在一个实施例中，LED的domT评分是至少103，优选至少106，更优选至少109，更优选至少112，更优选至少115，更优选至少118，甚至更优选至少121，或最优选至少124。domT评分的优选组合如本发明的第一方面中所披露。
在第三方面的一个实施例中，本发明涉及包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽的液体配制品，其中该液体配制品包含：
(A)0.01％至25％w/w的LYS多肽，其中该LYS多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)序列同一性的多肽；
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(r)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；以及
(s)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％；
(B)20％至80％w/w的多元醇；
(D)0.01％至2.0％w/w的防腐剂；以及
(D)水。
在第三方面的一个实施例中，本发明涉及包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽的液体配制品，其中该液体配制品包含：
(A)0.01％至25％w/w的LYS多肽，其中该LYS多肽包含LAD催化结构域且选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的氨基酸81至220具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸161至304具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的氨基酸88至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的氨基酸87至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的氨基酸90至232具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的氨基酸83至222具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的氨基酸82至225具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸161至303具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；以及
(o)与SEQ ID NO:45的氨基酸85至227具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(B)20％至80％w/w的多元醇；
(C)0.01％至2.0％w/w的防腐剂；以及
(D)水。
在第三方面的一个实施例中，本发明涉及包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽的液体配制品，其中该液体配制品包含：
(A)0.01％至25％w/w的LYS多肽，其中该LYS多肽包含LAD催化结构域且选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的氨基酸81至220具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸161至304具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的氨基酸88至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的氨基酸87至230具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的氨基酸90至232具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的氨基酸85至228具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的氨基酸84至226具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的氨基酸83至222具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的氨基酸82至225具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸161至303具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；以及
(o)与SEQ ID NO:45的氨基酸85至227具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(B)该LYS多肽包含LED结构域且选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸1至72具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的氨基酸1至72具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的氨基酸1至73具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的氨基酸96至167具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；以及
(n)与SEQ ID NO:42的氨基酸96至168具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、或至少95％)序列同一性的多肽；
(C)20％至80％w/w的多元醇；
(D)0.01％至2.0％w/w的防腐剂；以及
(E)水。
在第三方面的任一部分的一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ IDNO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ IDNO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在第三方面的任一部分的一个实施例中，该多肽是真菌来源的。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自分类学子囊菌门，优选分类学盘菌亚门。
在第三方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种配制剂(例如本文描述的那些)，优选地选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、PVA、乙酸盐和磷酸盐，优选地选自以下列表，该列表由以下组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。
在第三方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种多元醇，优选地是选自由以下组成的组的多元醇：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)，更优选地选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)或其任何组合。
在第三方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，优选地25％-75％的多元醇，更优选地30％-70％的多元醇，更优选地35％-65％的多元醇，或最优选地40％-60％的多元醇。在第三方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇，优选25％-75％的多元醇，更优选30％-70％的多元醇，更优选35％-65％的多元醇，或最优选40％-60％的多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)。在第三方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，优选25％-75％的多元醇，更优选30％-70％的多元醇，更优选35％-65％的多元醇，或最优选40％-60％的多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)。
在第三方面的任一部分的一个实施例中，该防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。在一个实施例中，该液体配制品包含0.02％至1.5％w/w的防腐剂，更优选0.05％至1.0％w/w的防腐剂，或最优选0.1％至0.5％w/w的防腐剂。在一个实施例中，该液体配制品包含0.01％至2.0％w/w的防腐剂(即防腐剂的总量)，优选0.02％至1.5％w/w的防腐剂，更优选0.05％至1.0％w/w的防腐剂，或最优选0.1％至0.5％w/w的防腐剂，其中该防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。
在第三方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含0.05％至20％w/w的LYS多肽，更优选0.2％至15％w/w的LYS多肽，更优选0.5％至15％w/w的LYS多肽，或最优选1.0％至10％w/w的LYS多肽。
在第三方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶优选地选自由以下组成的组：乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、脂肪酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酶、果胶裂解酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
在第三方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品一种或多种益生菌。该一种或多种益生菌优选选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、双歧杆菌属物种、肉食杆菌属物种、丁酸梭菌、梭菌属物种、屎肠球菌、肠球菌属物种、乳杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属物种、明串珠菌属物种、埃氏巨型球菌、巨型球菌属物种、乳酸片球菌、片球菌属物种、特氏丙酸杆菌、丙酸杆菌属物种和链球菌属物种或其任何组合。
具有溶菌酶活性的多肽
在第四方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达11个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸。
在第四方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:3具有至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3相差多达11个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:3的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:3长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸1至226或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第四方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第四方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:3的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ ID NO:3中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过11，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。在一个实施例中，在SEQ ID NO:3中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:3中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:3中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在第四方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:3的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基-末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。保守取代的其他实例是G至A；A至G、S；V至I、L、A、T、S；I至V、L、M；L至I、M、V；M至L、I、V；P至A、S、N；F至Y、W、H；Y至F、W、H；W至Y、F、H；R至K、E、D；K至R、E、D；H至Q、N、S；D至N、E、K、R、Q；E至Q、D、K、R、N；S至T、A；T至S、V、A；C至S、T、A；N至D、Q、H、S；Q至E、N、H、K、R。
可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的溶菌酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。也可以结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625中披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽或融合多肽。
在第五方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少94％，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差多达13个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸。
在第五方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:6具有至少94％，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6相差多达13个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:6具有至少94％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:6的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:6的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:5的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:6长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸1至226或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第五方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列具有至少94％，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第五方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:6的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ ID NO:6中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过13，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13。在一个实施例中，在SEQ ID NO:6中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:6中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:6中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第五方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:6的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第六方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:8的成熟多肽相差多达44个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44个氨基酸。
在第六方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:9具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:9相差多达44个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:9的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:9具有至少85％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:9的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:9具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:9的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:9具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:9的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:8的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:9长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸1至223或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第六方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第六方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:9的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ ID NO:9中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过44，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44。在一个实施例中，在SEQ ID NO:9中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:9中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:9中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第六方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:9的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第七方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。
在第七方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:12具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:12相差多达50个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:12的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:12具有至少85％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:12的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:12的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:12具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:12的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:11的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:12长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸1至304或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第七方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第七方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:12的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ ID NO:12中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在一个实施例中，在SEQ ID NO:12中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:12中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:12中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第七方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:12的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第八方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少87％，例如至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:14的成熟多肽相差多达29个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸。
在第八方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:15具有至少87％，例如至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:15相差多达29个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、或29个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:15具有至少87％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:15的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:15具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:15的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:15的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:14的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:15长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸1至228或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第八方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少87％，例如至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第八方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:15的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ ID NO:15中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过29，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。在一个实施例中，在SEQ ID NO:15中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQID NO:15中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:15中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第八方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:15的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第九方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:17的成熟多肽相差多达43个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43个氨基酸。
在第九方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:18具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:18相差多达43个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43个氨基酸。
在第九方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:18具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:239相差多达28个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:18具有至少81％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:18的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:18具有至少85％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:18的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:18具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:18的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:18具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:18的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:17的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:239的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:18长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸1至230或由其组成。在一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:18的氨基酸1至146或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第九方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第九方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:18的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ ID NO:18中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过43，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43。在一个实施例中，在SEQ ID NO:18中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:18中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:18中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第九方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:18的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第十方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:20的成熟多肽相差多达45个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸。
在第十方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:21具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:21相差多达45个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:21具有至少80％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:21具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:21具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:21的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:20的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:21长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸1至230或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第十方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第十方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:21的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ ID NO:21中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过45，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45。在一个实施例中，在SEQ ID NO:21中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:21中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:21中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第十方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:21的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第十一方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:23的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:23的成熟多肽相差多达46个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46个氨基酸。
在第十一方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:24具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:24相差多达46个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:24具有至少80％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:24具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:24具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:23的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:24长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸1至232或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第十一方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:22的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第十一方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:24的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:24中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过46，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46。在一个实施例中，在SEQ ID NO:24中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:24中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQID NO:24中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第十一方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:24的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第十二方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:26的成熟多肽具有至少87％，例如至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:26的成熟多肽相差多达29个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸。
在第十二方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:27具有至少87％，例如至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:27相差多达29个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:27具有至少87％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:27的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:27具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:27的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:27具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:27的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:26的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:27长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:27的氨基酸1至228或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第十二方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列具有至少87％，例如至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第十二方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:27的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:27中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过29，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。在一个实施例中，在SEQ ID NO:27中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:27中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:27中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第十二方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:27的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第十三方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:29的成熟多肽具有至少96％，例如至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:29的成熟多肽相差多达8个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸。
在第十三方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:30具有至少96％，例如至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:30相差多达8个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:30具有至少96％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:30的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:29的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:30长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸1至228或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第十三方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:28的成熟多肽编码序列具有至少96％，例如至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第十三方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:30的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:30中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过8，例如1、2、3、4、5、6、7或8。在一个实施例中，在SEQ ID NO:30中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过8，例如1、2、3、4、5、6、7或8。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:30中取代(优选保守取代)的数目不超过8，例如1、2、3、4、5、6、7或8。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第十三方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:30的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第十四方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:32的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:32的成熟多肽相差多达45个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸。
在第十四方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:33具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:33相差多达45个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:33具有至少80％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:33的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:33具有至少85％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:33的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:33具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:33的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:33具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:33的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:32的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:33长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:33的氨基酸1至226或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第十四方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第十四方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:33的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:33中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过45，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45。在一个实施例中，在SEQ ID NO:33中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:33中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ IDNO:33中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第十四方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:33的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第十五方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:35的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:35的成熟多肽相差多达44个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44个氨基酸。
在第十五方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:36具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:36相差多达44个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:36具有至少80％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:36的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:36的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:36具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:36的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:36具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:36的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:35的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:36长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:36的氨基酸1至225或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第十五方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:34的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第十五方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:36的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:36中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过44，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44。在一个实施例中，在SEQ ID NO:36中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:36中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:36中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第十五方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:36的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第十六方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:38的成熟多肽具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:38的成熟多肽相差多达42个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42个氨基酸。
在第十六方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:39具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:39相差多达42个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:39具有至少81％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:39的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:39具有至少85％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:39的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:39具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:39的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:39具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:39的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:38的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:39长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:39的氨基酸1至225或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第十六方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列具有至少81％，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第十六方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:39的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:39中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过42，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42。在一个实施例中，在SEQ ID NO:39中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:39中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:39中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第十六方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:39的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第十七方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:41的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:41的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。
在第十七方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:42具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:42相差多达50个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:42具有至少80％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:42的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:42具有至少85％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:42的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:42具有至少90％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:42的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:42具有至少95％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:42的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:41的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:42长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:42的氨基酸1至304或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第十七方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:40的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第十七方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:42的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:42中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在一个实施例中，在SEQ ID NO:42中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，在SEQ ID NO:42中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:42中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第十七方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:42的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在第十八方面，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ ID NO:44的成熟多肽具有至少100％，例如或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ IDNO:44的成熟多肽相差多达0个氨基酸，例如或1个氨基酸。
在第十八方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的多肽，这些多肽与SEQ IDNO:45具有至少100％，例如或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:45相差多达0个氨基酸，例如或1个氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及具有溶菌酶活性并且与SEQ ID NO:45具有至少100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:45的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:44的成熟多肽或由其组成。在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有SEQ ID NO:45长度的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:45的氨基酸1至227或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第十八方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有溶菌酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:43的成熟多肽编码序列具有至少100％，例如或100％的序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第十八方面的延续中，本发明涉及具有溶菌酶活性的SEQ ID NO:45的变体，这些变体包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:45中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过0，例如或1。在一个实施例中，在SEQ ID NO:45中取代和/或缺失和/或插入的数目不超过0，例如或1。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:45中保守取代的数目(优选保守取代)不超过0，例如或1。在本发明的第四方面中描述了氨基酸改变和保守取代的实例。
在第十八方面的一个实施例中，该变体具有SEQ ID NO:45的至少50％，例如至少75％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个实施例中，如实例1所述测定溶菌酶活性。
分类学和结构家族
在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在一个实施例中，该具有溶菌酶活性的多肽获得自或可获得自分类学子囊菌门，优选分类学盘菌亚门，并且优选地选自下组，该组选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45。
在一个实施例中，该具有溶菌酶活性的多肽获得自或可获得自分类学散囊菌纲(Eurotiomycetes)，优选分类学散囊菌目(Eurotiales)，并且更优选地选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:36。
在一个实施例中，该具有溶菌酶活性的多肽获得自或可获得自分类学散囊菌目，优选分类学曲霉科(Aspergillaceae)，并且更优选地选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:30。
在一个实施例中，该具有溶菌酶活性的多肽获得自或可获得自分类学散囊菌目，优选分类学发菌科(Trichocomaceae)，并且更优选地选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:36。
在一个实施例中，该具有溶菌酶活性的多肽获得自或可获得自分类学粪壳菌纲(Sordariomycetes)，并且优选地选自下组，该组选自：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:33、SEQID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:45。
在一个实施例中，该具有溶菌酶活性的多肽获得自或可获得自分类学粪壳菌目(Sordariales)，优选分类学毛壳菌科(Chaetomiaceae)，并且更优选地选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45。
在一个实施例中，该具有溶菌酶活性的多肽获得自或可获得自分类学肉座菌目(Hypocreales)，优选分类学麦角菌科(Clavicipitaceae)，并且更优选地选自由以下组成的组：SEQ ID NO:42。
具有溶菌酶活性的多肽的来源
本发明的具有溶菌酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是真菌多肽。在一方面，该多肽是来自散囊菌纲(例如来自散囊菌目，或来自曲霉科，或来自青霉属，或来自简青霉、Penicillium vasconiae、南极青霉、惠灵顿青霉、玫瑰紫青霉或帚青霉物种)的真菌的具有溶菌酶活性的多肽。
该多肽可以是真菌多肽。在一方面，该多肽是来自散囊菌纲(例如来自散囊菌目，或来自曲霉科，或来自曲霉属，或来自曲霉属物种XZ2668或霉白曲霉物种)的真菌的具有溶菌酶活性的多肽。
该多肽可以是真菌多肽。在一方面，该多肽是来自散囊菌纲(例如来自散囊菌目，或来自发菌科，或来自篮状菌属，或来自解蛋白篮状菌或Talaromyces atricola物种)的真菌的具有溶菌酶活性的多肽。
该多肽可以是真菌多肽。在一方面，该多肽是来自粪壳菌纲(例如来自肉座菌目，或来自麦角菌科，或来自绿僵菌属，或来自肉色绿僵菌物种)的真菌的具有溶菌酶活性的多肽。
该多肽可以是真菌多肽。在一方面，该多肽是来自粪壳菌纲(例如来自粪壳菌目，或来自毛壳菌科，或来自Ovatospora属，或来自Ovatospora brasiliensis物种)的真菌的具有溶菌酶活性的多肽。
该多肽可以是真菌多肽。在一方面，该多肽是来自粪壳菌纲(例如来自粪壳菌目，或来自毛壳菌科，或来自毛壳菌属，或来自毛壳菌物种ZY369)的真菌的具有溶菌酶活性的多肽。
该多肽可以是真菌多肽。在一方面，该多肽是来自粪壳菌纲(例如来自粪壳菌目，或来自毛壳菌科，或来自短梗蠕孢属，或来自粗糙短梗蠕孢物种)的真菌的具有溶菌酶活性的多肽。
该多肽可以是真菌多肽。在一方面，该多肽是来自粪壳菌纲(例如来自粪壳菌目，或来自毛壳菌科，或来自梭孢壳属，或来自土生梭孢壳霉物种)的真菌的具有溶菌酶活性的多肽。
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)分离或克隆多核苷酸。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，如本文中所述。在一个实施例中，编码本发明的多肽的多核苷酸已经被分离。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],AcademicPress[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由长毛盘菌属(Trichophaea)菌株或木霉属菌株或相关生物体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种类变体。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导该多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人,1992,同上描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
合适的mRNA稳定子区的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列，一种与多核苷酸3’-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加多腺苷酸残基的信号序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端可固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-端可包含对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替换天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,同上描述。
控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。
也可为希望的是添加调节序列，该调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标记包括但不限于：adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选地用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选地包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
在一些实施例中，多肽对重组宿主细胞是异源的。
在一些实施例中，一个或多个控制序列中的至少一个与编码多肽的多核苷酸异源。
在一些实施例中，重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸的至少两个拷贝，例如三个，四个或五个。
该宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或轭合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥]中定义的)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母及属于半知菌纲(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢菌、谷类镰孢菌、库威镰孢菌、大刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢菌、异孢镰孢菌、合欢木镰孢菌、尖孢镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌、拟丝孢镰孢菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的合适方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约)；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；和任选地(b)回收该多肽。
在一方面，该细胞是简青霉细胞。在一方面，该细胞是Penicillium vasconiae细胞。在一方面，该细胞是解蛋白篮状菌细胞。在一方面，该细胞是曲霉属物种XZ2668细胞。在一方面，该细胞是南极青霉细胞。在一方面，该细胞是Ovatospora brasiliensis细胞。在一方面，该细胞是惠灵顿青霉细胞。在一方面，该细胞是玫瑰紫青霉细胞。在一方面，该细胞是帚青霉细胞。在一方面，该细胞是霉白曲霉细胞。在一方面，该细胞是毛壳菌属物种ZY369细胞。在一方面，该细胞是Talaromyces atricola细胞。在一方面，该细胞是粗糙短梗蠕孢细胞。在一方面，该细胞是肉色绿僵菌细胞。在一方面，该细胞是土生梭孢壳霉细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。
宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据所公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从发酵培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多肽，从而以可回收的量表达和产生多肽或结构域。可以从该植物或植物部分回收该多肽或结构域。可替代地，含有该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改进食品或饲料的质量，例如改进营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)；饲用草，例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆科植物(例如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜、豌豆、菜豆和大豆)以及十字花科植物(十字花科)(例如花椰菜、油菜籽和紧密相关的模式生物体拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎以及包含这些部分的独立组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。
植物细胞和特定的植物细胞区室(例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质)也被认为是植物部分。
同样包含于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一些实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一些实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。
在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一些实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO2010/096673中所述的方法来产生。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含本发明的多肽。术语“富集”表示组合物的溶菌酶活性已增加，例如富集因子为至少1.1，例如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。
在一个优选的实施例中，该组合物包含一种或多种选自以下列表的具有溶菌酶活性的LYS多肽，该列表由以下组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:45。
在一个实施例中，该组合物包含本发明的多肽以及一种或多种如下所述的配制剂。
这些组合物可进一步包含多种酶活性，例如一种或多种(例如若干种)选自由以下组成的组的酶：植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、溶血磷脂酶、磷脂酶C、磷脂酶D、淀粉酶、溶菌酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、支链淀粉酶、和β-葡聚糖酶或其任何组合。
这些组合物可进一步包含一种或多种益生菌。在一个实施例中，该益生菌选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘菌芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、肉食杆菌属、丁酸梭菌、梭菌属、屎肠球菌、肠球菌属、乳酸杆菌属、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳酸杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属、明串珠菌属、埃氏巨型球菌、巨型球菌属、乳酸片球菌、片球菌属、特氏丙酸杆菌、丙酸杆菌属、以及链球菌属或其任何组合。
在一个实施例中，该组合物包含一种或多种如本文披露的配制剂，优选一种或多种选自以下列表的化合物，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土、麦芽糊精、环糊精、小麦、PVA、乙酸盐、磷酸盐、高岭土和纤维素。
在一个实施例中，该组合物包含一种或多种选自以下列表的组分，该列表由以下组成：维生素、矿物质和氨基酸。
配制品
本发明的酶可以配制为液体或固体。针对液体配制品，该配制剂可以包括多元醇(像例如，甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(像例如，氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或糖或糖衍生物(像例如，糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨醇)。因此，在一个实施例中，该组合物是液体组合物，其包含本发明的多肽和一种或多种选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨醇。该液体配制品可以喷洒在已经丸粒化(pelleted)的饲料上，或可以添加到供给动物的饮用水中。
针对固体配制品，该配制品可以例如作为颗粒、喷雾干粉或聚结物(例如如在WO2000/70034中所披露)。配制剂可以包括盐(有机的或无机的锌、钠、钾或钙盐，像例如，如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)。
在一个实施例中，该组合物是固体组合物，例如喷雾干燥组合物，该固体组合物包含本发明的LYS多肽和一种或多种选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土、麦芽糊精、环糊精、小麦、PVA、乙酸盐、磷酸盐和纤维素。在一个优选的实施例中，该配制剂选自一种或多种以下化合物：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、硫酸镁和碳酸钙。
本发明还涉及包含本发明的LYS多肽的酶颗粒/粒子任选地与一种或多种另外的酶的组合。该颗粒由核心以及任选地包围该核心的一个或多个包衣(外层)构成。
通常，该颗粒的粒度(granule/particle size)(测量为当量球径(基于体积的平均粒度))是20-2000μm，具体是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。
该核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，例如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床凝集、旋转雾化、挤压、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小法、转鼓造粒(drum granulation)和/或高剪切造粒。
用于制备核心的方法可见于Handbook of Powder Technology[粉末技术手册]；C.E.Capes的Particle size enlargement[粒度增大]；第1卷；1980；Elsevier[爱思唯尔]。制备方法包括已知的饲料和颗粒配制技术，例如：
a)喷雾干燥产品，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含酶溶液以形成小液滴，在它们在沿干燥塔下降的过程中干燥形成含有酶的颗粒状材料；
b)层状产品，其中酶作为层包衣在预形成的惰性核心粒子周围，其中包括酶的溶液被雾化，通常在流化床装置中，其中预形成的核心粒子被流体化，并且含酶的溶液附着到核心粒子上并干燥，直到使得干的酶层留在核心粒子的表面上。如果可以发现具有期望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有期望尺寸的粒子。这种类型的产品描述于例如WO 97/23606中；
c)吸收的核心粒子，其中不是包衣该酶作为核心周围的层，而是在核心的表面上和/或表面中吸收该酶。这样的方法描述于WO 97/39116中。
d)挤出或丸粒化的(pelletized)产品，其中将含有酶的糊料压成丸粒(pellet)或在压力下通过小的开口挤出并切割为粒子，随后干燥这些粒子。此类粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压力降。此外，当使用小的开口时，非常高的挤出压力增加了酶糊料中的热发生，这对酶是有害的；
e)颗粒化的产品，其中含酶的粉末悬浮于熔化的蜡中并且例如通过转盘喷雾器将悬浮液喷洒到冷却室中，在此液滴快速地固化(Michael S.Showell(编辑)；Powdereddetergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔德克尔出版社])。所获得产物是酶均匀分布遍及整个惰性材料而不是集中在其表面上的产物。此外，US 4,016,040和US 4,713,245是与此技术有关的文献；
f)混合造粒产品，其中将液体添加到例如常用造粒组分的干燥粉末组合物中，经由液体或粉末或二者引入该酶。将液体和粉末混合，并且因为液体的水分为干燥粉末所吸收，干燥粉末的组分开始附着并附聚，并且粒子将构建，形成包含酶的颗粒。此种方法描述于US 4,106,991和有关的文献EP 170360、EP 304332、EP 304331、WO90/09440和WO 90/09428中。在其中可以用各种高剪切混合器作为造粒机的此方法的具体产品中，将由作为酶的酶、填料和粘合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以强化粒子，而得到所谓的T-颗粒(T-granulate)。经强化的粒子更加坚固，酶粉尘释放更少。
g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含酶的较大的粒子、丸粒、平片体、坯块(briquette)等产生核心。通过将碾磨或压碎的产物过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子。粒度减小描述于(Martin Rhodes(编辑)；Principles ofPowder Technology[粉末技术原理]；1990；第10章；John Wiley&Sons[约翰威利父子公司])；
h)流化床造粒，其涉及将颗粒悬浮于空气流中并经喷嘴喷洒液体到流态化粒子上。被喷洒的液滴击中的粒子湿润并发粘。发粘的粒子与其他粒子碰撞并附着于其上并形成颗粒；
i)这些核心可经受干燥，例如在流化床干燥器中。本领域技术人员可以使用其他已知的在饲料或洗涤剂工业中用于干燥颗粒的方法。干燥优选在从25℃至90℃的产物温度下进行。对于一些酶来说，重要的是包含酶的核心在包衣之前含有少量的水。如果在过量水除去之前水敏性酶被包衣，则水分会截留在核心中并可能消极地影响酶的活性。干燥之后，这些核心优选含有0.1％w/w-10％w/w的水。
该核心可以包含另外的材料如填料、纤维材料(纤维素或合成纤维)、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、黏度调节剂、轻球体、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。
该核心可以包含粘合剂，例如合成聚合物、蜡、脂肪或碳水化合物。
该核心通常作为均匀的共混物可以包含多价阳离子的盐、还原剂、抗氧剂、过氧化物分解催化剂和/或酸性缓冲液组分。
在一个实施例中，该核心包含选自由以下组成的组的材料：盐(例如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质以及粘土矿物质(也称作水性页硅酸铝)。在一个实施例中，该核心包含粘土矿物质，例如高岭石或高岭土。
该核心可以包含惰性粒子，其中酶被吸附到该惰性粒子之内，或者被施加(例如通过流化床包衣)到该惰性粒子的表面上。
该核心的直径可以是20-2000μm，具体地50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。
该核心可以被至少一个包衣包围，例如以改进储存稳定性、以减少在处理过程中的粉尘形成或用于着色该颗粒。任选的一个或多个包衣可以包括盐和/或蜡和/或面粉包衣或其他合适的包衣材料。
可以将该包衣按核心的重量计以至少0.1％(例如，至少0.5％、1％或5％)的量施加。该量至多可以是100％、70％、50％、40％或30％。
该包衣优选是至少0.1μm厚，具体地至少0.5μm、至少1μm或至少5μm。在一些实施例中，该包衣的厚度低于100μm，例如低于60μm或低于40μm。
该包衣应当通过形成基本上连续的层来密封该核心单元。基本上连续的层应当理解为具有极少或没有孔洞的包衣，使得密封或封闭的核心单元具有极少或没有未包衣的区域。该层或包衣在厚度上应当特别均匀。
该包衣可以进一步含有其他本领域已知的材料，例如填料、防粘剂、颜料、染料、增塑剂和/或粘合剂，例如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。
盐包衣可以包含按重量计至少60％的盐，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
该盐可以从盐溶液(其中该盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中该细粒子是少于50μm，例如少于10μm或少于5μm)中添加。
该盐包衣可以包含单一盐或者两种或更多种盐的混合物。该盐可以是水溶性的，具体地具有在20℃在100g水中至少0.1g的溶解度，优选至少0.5g/100g水，例如至少1g/100g水、例如至少5g/100g水。
该盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯盐或碳酸盐或者简单有机酸(少于10个碳原子，例如6个或更少的碳原子)的盐例如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子、铵离子或第一过渡系的金属离子，例如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、二碱式磷酸根、次磷酸根、焦磷酸二氢根、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、乙酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、山梨酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。具体而言，可以使用硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、膦酸根、硝酸根、氯或碳酸根的碱或碱土金属盐或者简单有机酸的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。
在包衣中的盐可以在20℃下具有超过60％的恒定湿度，具体地超过70％、超过80％或超过85％，或者它可以是此盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。该盐包衣可以如WO 1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO 2000/70034、WO 2006/034710、WO2008/017661、WO 2008/017659、WO 2000/020569、WO 2001/004279、WO 1997/05245、WO2000/01793、WO 2003/059086、WO 2003/059087、WO 2007/031483、WO 2007/031485、WO2007/044968、WO 2013/192043、WO 2014/014647和WO 2015/197719中所述或者是如WO2001/00042中所述的聚合物包衣。
适合的盐的具体实例是NaCl(CH20℃＝76％)、Na2CO3(CH20℃＝92％)、NaNO3(CH20℃＝73％)、Na2HPO4(CH20℃＝95％)、Na3PO4(CH25℃＝92％)、NH4Cl(CH20℃＝79.5％)、(NH4)2HPO4(CH20℃＝93,0％)、NH4H2PO4(CH20℃＝93.1％)、(NH4)2SO4(CH20℃＝81.1％)、KCl(CH20℃＝85％)、K2HPO4(CH20℃＝92％)、KH2PO4(CH20℃＝96.5％)、KNO3(CH20℃＝93.5％)、Na2SO4(CH20℃＝93％)、K2SO4(CH20℃＝98％)、KHSO4(CH20℃＝86％)、MgSO4(CH20℃＝90％)、ZnSO4(CH20℃＝90％)和柠檬酸钠(CH25℃＝86％)。其他实例包括NaH2PO4、(NH4)H2PO4、CuSO4、Mg(NO3)2、乙酸镁、乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌和山梨酸锌。
该盐可以处于无水形式，或者它可以是水合盐，即具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物，例如描述于WO 99/32595中。具体实例包括无水硫酸钠(Na2SO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、七水硫酸镁(MgSO4.7H2O)、七水硫酸锌(ZnSO4.7H2O)、七水磷酸氢二钠(Na2HPO4.7H2O)、六水硝酸镁(Mg(NO3)2(6H2O))、二水柠檬酸钠以及四水乙酸镁。
优选地，作为盐溶液施加该盐，例如使用流化床。
蜡包衣可以包含按重量计至少60％的蜡，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
蜡的具体实例是聚乙二醇；聚丙烯；巴西棕榈蜡；小烛树蜡；蜂蜡；氢化植物油或动物脂油例如聚乙二醇(PEG)、甲基羟丙基纤维素(MHPC)、聚乙烯醇(PVA)、氢化牛脂、氢化棕榈油、氢化棉籽油和/或氢化豆油；脂肪酸醇；单甘油酯和/或二甘油酯，例如甘油硬脂酸酯，其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕榈酸的混合物；微晶蜡；石蜡；以及脂肪酸，如氢化的线性长链脂肪酸和其衍生物。优选的蜡是棕榈油或氢化棕榈油。
该颗粒可以包含核心(该核心包含本发明的LYS多肽)、一种或多种盐包衣和一种或多种蜡包衣。具有多个包衣的酶颗粒的实例示于WO 1993/07263、WO 1997/23606和WO2016/149636中。
可以产生非粉尘颗粒，例如如美国专利号4,106,991和4,661,452中所披露，并且这些颗粒可以任选地通过本领域已知的方法来包衣。这些包衣材料可以是蜡状包衣材料和成膜包衣材料。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适合用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。
该颗粒可以进一步包含一种或多种另外的酶。然后，每种酶将存在于更多颗粒中，确保酶的更均匀分布，并且还由于不同的粒度而减少不同酶的物理分离。用于产生多酶共颗粒的方法披露于ip.com公开内容IPCOM000200739D中。
通过使用共颗粒配制酶的另一个实例披露于WO 2013/188331中。
本发明还涉及根据EP 238,216中披露的方法制备的受保护的酶。
因此，在一个另外的方面，本发明提供了颗粒，其包含：
(a)核心，该核心包含根据本发明的具有溶菌酶活性的LYS多肽，和
(b)由包围该核心的一个或多个层组成的包衣。
在一个实施例中，该包衣包含如本文所述的盐包衣。在一个实施例中，该包衣包含如本文所述的蜡包衣。在一个实施例中，该包衣包含盐包衣，然后是本文所述的蜡包衣。
动物饲料添加剂
本发明还涉及包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽的动物饲料添加剂。因此，在一个实施例中，本发明涉及包含LYS多肽的动物饲料添加剂，其中：
(a)该多肽具有溶菌酶活性；
(b)该多肽包含一个或多个LAD催化结构域；以及
(c)当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为170，并且其中通过利用HMM确定溶菌酶增强结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询。
在一个实施例中，该多肽进一步包含一个或多个溶菌酶增强结构域，其中当使用SEQ ID NO:188至316和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该溶菌酶增强结构域的domT评分至少为100，并且其中使用hmmscan软件程序执行该查询。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分是至少175，优选至少180，更优选至少185，甚至更优选至少190，甚至更优选至少195，或最优选至少200。在一个实施例中，LED的domT评分是至少103，优选至少106，更优选至少109，更优选至少112，更优选至少115，更优选至少118，甚至更优选至少121，或最优选至少124。domT评分的优选组合如本发明的第一方面中所披露。
在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在另一方面，本发明涉及包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽的动物饲料添加剂，其中该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(r)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；以及
(s)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％。
在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在一个实施例中，该多肽是真菌来源的。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自分类学子囊菌门，优选分类学盘菌亚门。
在一个实施例中，动物饲料添加剂中的酶含量按重量计介于0.001％与10％的组合物的量之间。
在一个实施例中，该动物饲料添加剂包含一种或多种配制剂，优选如上文所述。
在一个实施例中，该动物饲料添加剂包含一种或多种另外的酶，优选如下文所述。
在一个实施例中，该动物饲料添加剂包含一种或多种益生菌，优选如下文所述。
在一个实施例中，该动物饲料添加剂包含一种或多种维生素，优选如下文所述。
在一个实施例中，该动物饲料添加剂包含一种或多种矿物质，优选如下文所述。
在一个实施例中，该动物饲料添加剂包含一种或多种氨基酸，优选如下文所述。
在一个实施例中，该动物饲料添加剂包含一种或多种益生元，优选如下文所述。
在一个实施例中，该动物饲料添加剂包含一种或多种有机酸，优选如下文所述。
在一个实施例中，该动物饲料添加剂包含一种或多种植生素，优选如下文所述。
动物饲料
本发明还涉及包含一种或多种本发明溶菌酶的动物饲料组合物。在一个实施例中，本发明涉及包含如本文所述的颗粒和植物基材料的动物饲料。在一个实施例中，本发明涉及包含如本文所描述的动物饲料添加剂以及植物基材料的动物饲料。
动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪饮食可以如WO 01/58275的表B第2-3栏所示来表征。鱼饮食可以如表B第4栏所示来表征。此外，此类鱼饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
根据本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800g/kg，此外还包含至少一种本文所要求的具有溶菌酶活性的多肽。
此外或在(上述粗蛋白含量)的替代方案中，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275表B中的范围2、3、4或5(R.2-5)中的任何一个内。
粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x 6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.,1984,Official Methods of Analysis[官方分析方法]第14版,Association of Official Analytical Chemists[官方分析化学家集],华盛顿特区)。
可代谢能量可根据如下进行计算：NRC出版物Nutrient requirements in swine[猪的营养需求],第九次再版1988,subcommittee on swine nutrition,committee onanimal nutrition,board of agriculture,national research council[美国国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会].美国国家科学院出版社[National AcademyPress],华盛顿特区,第2-6页；以及欧洲家禽饲养材料能量值表(European Table ofEnergy Values for Poultry Feed-stuffs),斯克得霍特家禽研究与推广中心[Spelderholt centre for poultry research and extension],7361DA贝克贝亨,荷兰,Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv,瓦赫宁恩[Wageningen].ISBN 90-71463-12-5。
根据诸如Veevoedertabel 1997,gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg 6,8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7等饲料表计算在动物全饮食中的钙、有效磷和氨基酸的膳食含量。
在一个具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物蛋白。
本发明的动物饲料组合物还可以含有动物蛋白，例如肉和骨粉、羽毛粉和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干酒糟(DriedDistillers Grains with Solubles，DDGS)，通常量为0-30％。
在再进一步具体的实施例中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％豆粕；和/或0-25％鱼粉；和/或0-25％肉和骨粉；和/或0-20％乳清。
该动物饲料可以包含植物蛋白。在具体实施例中，这些植物蛋白的蛋白含量是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(w/w)。植物蛋白可以衍生自植物蛋白来源，例如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉饼、羽扇豆粉饼、油菜籽粉饼及其组合。
在一个具体实施例中，该植物蛋白来源是来自豆科的一种或多种植物(例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆)的材料。在另一个具体实施例中，植物蛋白来源是得自藜科的一种或多种植物，例如甜菜、糖甜菜、菠菜或奎奴亚藜的材料。植物蛋白来源的其他实例是油菜和卷心菜。在另一个具体实施例中，大豆是优选的植物蛋白来源。植物蛋白来源的其他实例是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻和高粱。
可以将动物饮食制成例如粉状饲料(非丸粒化)或丸粒状饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的种类的说明添加充足量的必需维生素和矿物质。作为固体或液体酶配制品添加酶。例如，对于粉状饲料，在成分混合步骤前或期间可以添加固体或液体酶配制品。对于丸粒状饲料而言，也可以在饲料成分步骤之前或过程中添加该(液体或固体)溶菌酶/酶制剂。典型地，液体溶菌酶/酶制剂包含本发明的具有溶菌酶活性的多肽，任选地伴随着多元醇(例如甘油、乙二醇或丙二醇)，并且是在丸粒化步骤后添加，例如通过将该液体配制品喷涂至丸粒上。也可以将该酶掺入饲料添加剂或预混物中。
可替代地，可以通过冷冻液体酶溶液与填充剂(例如研磨的豆粕)的混合物，并且然后冻干该混合物，来制备具有溶菌酶活性的多肽。
饮食中的最终酶浓度在0.01-200mg酶蛋白/kg饮食的范围内，优选在0.05-100mg/kg饮食之间，更优选0.1-50mg，甚至更优选0.2-20mg酶蛋白/kg动物饮食。
目前预期按一种或多种以下量(剂量范围)施用所述酶：0.01-200；0.05-100；0.1-50；0.2-20；0.1-1；0.2-2；0.5-5；或1-10；-所有这些范围都以每kg饲料中LYS多肽蛋白的mg数(ppm)计。
为了确定每kg饲料中LYS多肽蛋白的mg数，从饲料组合物中纯化LYS多肽，并且使用相关试验(参见溶菌酶活性)确定经纯化的LYS多肽的比活性。使用相同试验测定该饲料组合物的溶菌酶活性，并且在这两次测定的基础上计算出以每kg饲料中溶菌酶蛋白的mg数计的剂量。
在一个具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂意欲以0.01％至10.0％，更特别地0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％意指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。
应用相同的原理确定饲料添加剂中的LYS多肽蛋白的mg数。当然，如果可获得用于制备祠料添加剂或饲料的LYS多肽样品，就从该样品确定比活性(不必从饲料组合物或添加剂中纯化该LYS多肽)。
因此，在另一方面，本发明还涉及包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽和植物基材料的动物饲料。在另一方面，本发明还涉及包含本发明的动物饲料添加剂(如上所述)和植物基材料的动物饲料。
在一个实施例中，本发明涉及包含植物基材料和LYS多肽的动物饲料，其中该多肽(a)具有溶菌酶活性，并且(b)包含一个或多个LAD催化结构域；其中，当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型(HMM)查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为180，并且其中通过利用HMM确定LAD催化结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询。
在一个实施例中，该多肽进一步包含一个或多个溶菌酶增强结构域，其中当使用SEQ ID NO:188至316和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该溶菌酶增强结构域的domT评分至少为100，并且其中通过确定溶菌酶的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询。
在一个实施例中，LAD催化结构域的domT评分是至少175，优选至少180，更优选至少185，甚至更优选至少190，甚至更优选至少195，或最优选至少200。在一个实施例中，LED的domT评分是至少103，优选至少106，更优选至少109，更优选至少112，更优选至少115，更优选至少118，甚至更优选至少121，或最优选至少124。domT评分的优选组合如本发明的第一方面中所披露。
在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在另一方面，本发明涉及包含植物基材料和一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽的动物饲料，其中该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(r)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；以及
(s)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％。
在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。在一个实施例中，LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)和一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)，LED包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
在一个实施例中，该多肽是真菌来源的。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自分类学子囊菌门，优选分类学盘菌亚门。
在一个实施例中，该植物基材料选自由以下组成的组：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆(slimjim bean)、利马豆、法国菜豆、蚕豆(fava bean)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜(oilseed rape)、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(例如豆粕、油菜籽粕)或其任何组合。
在另外的实施例中，该动物饲料是已经丸粒化的。
另外的酶
在另一个实施例中，本文描述的组合物任选地包含一种或多种酶。可以根据handbook Enzyme Nomenclature[酶命名手册](来自NC-IUBMB,1992)对酶进行分类，还参见因特网上的ENZYME网站：http://www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是相对于酶命名法的信息储库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB),AcademicPress,Inc.[学术出版社公司],1992的推荐并且描述了所表征的酶的每种类型，为所述酶提供EC(酶委员会)编号(Bairoch A.The ENZYME database[酶数据库],2000,NucleicAcids Res[核酸研究]28:304-305)。这种IUB-MB酶命名法是基于它们的底物特异性，有时基于它们的分子机制；这种分类不反映这些酶的结构特征。
在Henrissat等人的“The carbohydrate-active enzymes database(CAZy)in2013[2013年的碳水化合物活性酶数据库(CAZy)]”,Nucl.Acids Res.[核酸研究](2014年1月1日)42(D1):D490-D495中描述了某些糖苷水解酶(例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、溶菌酶和半乳糖苷酶)的另一种分类；还参见www.cazy.org。
因此，本发明的组合物还可以包含选自下组的至少一种其他的酶，该组由以下组成：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)；磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，如例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)；乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)；纤维素酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)；β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)；支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)，或其任何混合物。
在一个具体实施例中，本发明的组合物包含植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)。可商购的植酸酶的实例包括Bio-FeedTM植酸酶(诺维信公司(Novozymes))、P、NP和HiPhos(帝斯曼营养产品公司(DSM NutritionalProducts))、NatuphosTM(巴斯夫公司(BASF))、NatuphosTM E(巴斯夫公司)、和Blue(AB酶公司(AB Enzymes))、(浩卫制药公司(Huvepharma))、Phytase(Aveve Biochem公司)、XP(范恩尼姆/杜邦公司(Verenium/DuPont))以及PHY(杜邦公司(DuPont))。其他优选的植酸酶包括描述于例如WO 98/28408、WO 00/43503和WO 03/066847中的那些。
在一个具体实施例中，本发明的组合物包含木聚糖酶(EC 3.2.1.8)。可商购的木聚糖酶的实例包括WX(帝斯曼营养产品公司)、XT和Barley(ABVista公司)、(范恩尼姆公司(Verenium))、X(浩卫制药公司)、XB(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，杜邦公司)和XAP(木聚糖酶/淀粉酶/蛋白酶，杜邦公司)、XG 10(木聚糖酶/葡聚糖酶)和02CS(木聚糖酶/葡聚糖酶/果胶酶，Aveve Biochem公司)以及Naturgrain(巴斯夫公司)。
在一个具体实施例中，本发明的组合物包含蛋白酶(EC 3.4)。可商购的蛋白酶的实例包括ProAct(帝斯曼营养产品公司)。
在一个具体实施例中，本发明的组合物包含α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。可商购的α-淀粉酶的实例包括A和RumiStarTM(帝斯曼营养产品公司)。
在一个实施例中，本发明的组合物包含多组分酶产品，如Octazyme(Framelco公司)、G2、VP和MultiGrain(帝斯曼营养产品公司)、Excel或Advance(安迪苏公司(Adisseo))。
摄生品
摄生品(eubiotic)是意欲在胃肠道中提供微生物菌群的健康平衡的化合物。摄生品包括许多不同的饲料添加剂，例如益生菌、益生元、植生素(精油)和有机酸，其在下面更详细地描述。
益生菌
在一个实施例中，该动物饲料组合物进一步包含一种或多种另外的益生菌。在一个具体实施例中，该动物饲料组合物进一步包含来自以下一个或多个属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、肉食杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属和巨型球菌或其任何组合。
在一个优选的实施例中，动物饲料组合物进一步包含来自以下一种或多种菌株的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、屎肠球菌、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特氏丙酸杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius ssp.salivarius)、埃氏巨型球菌、丙酸杆菌属物种。
在一个更优选的实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包含来自以下一种或多种枯草芽孢杆菌菌株的细菌：3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-501 05)、BS 18(NRRL B-50633)、BS 278(NRRL B-50634)、DSM 29870、DSM 29871、DSM 32315、NRRL B-50136、NRRL B-50605、NRRL B-50606、NRRL B-50622以及PTA-7547。
在一个更优选的实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包含来自以下一种或多种短小芽孢杆菌菌株的细菌：NRRL B-50016、ATCC 700385、NRRL B-50885或NRRL B-50886。
在一个更优选的实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包含来自以下一种或多种地衣芽孢杆菌菌株的细菌：NRRL B 50015、NRRL B-50621或NRRL B-50623。
在一个更优选的实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包含来自以下一种或多种解淀粉芽孢杆菌菌株的细菌：DSM 29869、DSM 29869、NRRL B 50607、PTA-7543、PTA-7549、NRRL B-50349、NRRL B-50606、NRRL B-50013、NRRL B-50151、NRRL B-50141、NRRL B-50147或NRRL B-50888。
该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数在1x 104和1x 1014CFU/kg的干物质之间，优选在1x 106和1x 1012CFU/kg的干物质之间，并且更优选在1x 107至1x1011CFU/kg的干物质之间。在一个更优选的实施例中，该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数在1x 108和1x 1010CFU/kg的干物质之间。
该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数在1x 105和1x 1015CFU/动物/天之间，优选在1x 107和1x 1013CFU/动物/天之间，并且更优选在1x 108和1x 1012CFU/动物/天之间。在一个更优选的实施例中，该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数在1x109和1x 1011CFU/动物/天之间。在一个实施例中，益生菌的量按重量计为组合物的0.001％至10％。
在另一个实施例中，该一种或多种细菌菌株以稳定的孢子形式存在。
商业产品的实例是(帝斯曼营养产品公司)、Alterion(安迪苏公司)、Enviva PRO(杜邦动物营养公司(DuPont Animal Nutrition))、(混合酶+益生菌，杜邦动物营养公司)、和(Norel/Evonik)以及PY1(赢创公司(Evonik))。
益生元
益生元是诱导微生物(例如，细菌和真菌)生长或活动的物质，其有助于宿主的健康。益生元通常是不可消化的纤维化合物，其未消化地通过胃肠道的上部并刺激通过充当它们的底物而定殖大肠的有利细菌的生长或活动。通常，益生元增加胃肠(GI)道中双歧杆菌和乳酸菌的数量或活动。
酵母衍生物(灭活的整个酵母或酵母细胞壁)也可以被认为是益生元。它们通常包括甘露寡糖、酵母β-葡聚糖或蛋白质内容物，并且通常衍生自酵母(酿酒酵母)的细胞壁。
在一个实施例中，益生元的量按重量计为组合物的0.001％至10％。酵母产品的实例是和Agrimos(拉曼动物营养公司(Lallemand Animal Nutrition))。
植生素
植生素是一组来自草药、香料或其他植物的用作饲料添加剂的天然生长促进剂或非抗生素生长促进剂。植生素可以是由精油/提取物、精油/提取物、单一植物和植物混合物(草药产品)或精油/提取物/植物的混合物(专门产品)制备的单一物质。
植生素的实例是迷迭香、鼠尾草、牛至、百里香、丁香和柠檬草。精油的实例是百里酚、丁香酚、间甲酚、香草醛、水杨酸酯、间苯二酚、邻甲氧基苯酚(guajacol)、姜酚、薰衣草油、紫罗酮、鸢尾酮、桉叶油素、薄荷醇、薄荷油、α-蒎烯、柠檬烯、茴香脑、芳樟醇、二氢茉莉酸甲酯、香芹酚、丙酸/丙酸酯、乙酸/乙酸酯、丁酸/丁酸酯、迷迭香油、丁香油、香叶醇、萜品醇、香茅醇、水杨酸戊酯和/或水杨酸苄酯、肉桂醛、植物多酚(单宁)、姜黄和姜黄提取物。
在一个实施例中，植生素的量按重量计为组合物的0.001％至10％。商业产品的实例是(帝斯曼营养产品公司)、CinergyTM、BiacidTM、ProHacidTM Classic和ProHacidTM AdvanceTM(all Promivi公司/嘉吉公司(Cargill))以及Envivo EO(杜邦动物营养公司(DuPont Animal Nutrition))。
有机酸
有机酸(C1-C7)在自然界中作为植物或动物组织的正常成分广泛分布。它们也通过主要在大肠中的碳水化合物的微生物发酵形成。它们通常在猪和家禽生产中用作抗生素生长促进剂的替代品，因为它们对鸡的坏死性肠炎和仔猪的大肠杆菌感染等肠道问题具有预防作用。有机酸可以作为单组分或通常2或3种不同有机酸的混合物出售。有机酸的实例是丙酸、甲酸、柠檬酸、乳酸、山梨酸、苹果酸、乙酸、富马酸、苯甲酸、丁酸和酒石酸或其盐(通常是钠或钾盐、如二甲酸钾或丁酸钠)。
在一个实施例中，有机酸的量按重量计为组合物的0.001％至10％。商业产品的实例是(帝斯曼营养产品公司)、 (巴斯夫公司)、正丁酸AF(OXEA)以及Adimix Precision(Nutriad公司)。
预混物
将如上文示例的饲料添加剂的组合物掺入动物饲料(例如家禽饲料)中在实践中是使用浓缩剂或预混物进行的。预混物是指一种或多种微小成分与稀释剂和/或载体的优选均匀的混合物。预混物用于促进微小成分在较大混合物中均匀分散。根据本发明的预混物可以作为固体(例如作为水溶性粉末)或液体添加到饲料成分或饮用水中。
氨基酸
本发明的组合物可以进一步包含一种或多种氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的实例是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。在一个实施例中，氨基酸的量按重量计为组合物的0.001％至10％。
维生素和矿物质
在另一个实施例中，该动物饲料可以包含一种或多种维生素，如一种或多种脂溶性维生素和/或一种或多种水溶性维生素。在另一个实施例中，该动物饲料可以任选地包含一种或多种矿物质，如一种或多种痕量矿物质和/或一种或多种常量矿物质。
通常，脂溶性维生素和水溶性维生素、以及痕量矿物质形成了一种所谓的旨在添加到饲料中的预混物的部分，而常量矿物质通常被分开地添加到饲料中。
脂溶性维生素的非限制性实例包括维生素A、维生素D3、维生素E、以及维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的非限制性实例包括维生素C、维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。
痕量矿物质的非限制性实例包括硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、、碘、硒和锌。
常量矿物质的非限制性实例包括钙、镁、磷、钾和钠。
在一个实施例中，维生素的量按重量计为组合物的0.001％至10％。在一个实施例中，矿物质的量按重量计为组合物的0.001％至10％。
这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)列于WO 01/58275的表A中。营养需求意指应在饮食中提供指定浓度的这些组分。
在替代方案中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275的表A中指定的单独组分中的至少一种。至少一种意指一种或两种或三种或四种等直至所有十三种或直至所有十五种单独组分中的任一种、一种或多种。更具体地，此至少一种单独组分以提供在表A的第四栏或第五栏或第六栏说明的范围内的饲料中浓度(in-feed-concentration)的量包含在本发明的添加剂内。
在一个仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种以下维生素，优选以提供落入下表1中所限定的范围之内(分别针对仔猪饮食和肉鸡饮食)的饲料中浓度。
表1：典型维生素推荐
| 维生素 | 仔猪饮食 | 肉鸡饮食 |
| 维生素A | 10,000-15,000IU/kg饲料 | 8-12,500IU/kg饲料 |
| 维生素D3 | 1800-2000IU/kg饲料 | 3000-5000IU/kg饲料 |
| 维生素E | 60-100mg/kg饲料 | 150-240mg/kg饲料 |
| 维生素K3 | 2-4mg/kg饲料 | 2-4mg/kg饲料 |
| 维生素B1 | 2-4mg/kg饲料 | 2-3mg/kg饲料 |
| 维生素B2 | 6-10mg/kg饲料 | 7-9mg/kg饲料 |
| 维生素B6 | 4-8mg/kg饲料 | 3-6mg/kg饲料 |
| 维生素B12 | 0.03-0.05mg/kg饲料 | 0.015-0.04mg/kg饲料 |
| 烟酸(维生素B3) | 30-50mg/kg饲料 | 50-80mg/kg饲料 |
| 泛酸 | 20-40mg/kg饲料 | 10-18mg/kg饲料 |
| 叶酸 | 1-2mg/kg饲料 | 1-2mg/kg饲料 |
| 生物素 | 0.15-0.4mg/kg饲料 | 0.15-0.3mg/kg饲料 |
| 氯化胆碱 | 200-400mg/kg饲料 | 300-600mg/kg饲料 |
其他饲料成分
本发明的组合物可以进一步包含着色剂、稳定剂、生长改善添加剂和芳香化合物/调味品、多不饱和脂肪酸(PUFA)、活性氧产生物质、抗氧化剂、抗微生物肽、抗真菌多肽以及霉菌毒素控制化合物。
着色剂的实例是类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素。
芳香化合物/调味品的实例是甲氧甲酚，茴香脑，十、十一和/或十二内酯、紫罗酮、鸢尾酮、姜酚、哌啶、亚丙基苯酞(propylidene phatalide)、亚丁基苯酞(butylidenephatalide)、辣椒素和单宁。
抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、三色肽(Tritrpticin)、Protegrin-1、死亡素(Thanatin)、防卫素、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽和奥维司匹林(Ovispirin)如诺维司匹林(Novispirin)(Robert Lehrer,2000)、菌丝霉素(Plectasin)和他汀(包括在WO 03/044049和WO 03/048148中披露的化合物和多肽)以及以上的保留抗微生物活性的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉和黑曲霉的肽连同其保留抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO 02/090384中披露的。
多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。
活性氧产生物质的实例为例如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐等化学品；以及例如氧化酶、氧合酶或合成酶等酶。
抗氧化剂可以用于限制可产生的活性氧物质的数量，使得活性氧物质的水平与抗氧化剂平衡。
霉菌毒素(例如脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素)可以在动物饲料中发现，并且可以导致消极的动物性能或疾病。可以将能够例如通过霉菌毒素的失活或通过霉菌毒素的结合控制霉菌毒素水平的化合物添加到饲料中以改善这些负面影响。霉菌毒素控制化合物的实例是Vitafix Ultra(核科学公司(Nuscience))、Secure、BBSH、MTV(百奥明公司(Biomin))、以及Plus(Nutriad公司)。
用途
在动物饲料中的用途
本发明的LYS多肽也可用于动物饲料，其中术语“动物”是指除人以外的所有动物。动物的实例是单胃动物，例如猪(pig或swine)(包括但不限于仔猪、成长猪和母猪)；家禽(包括但不限于家禽、火鸡、鸭、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽、雏鸟、小鸡、肉鸡、下蛋鸡、小母鸡和小鸡)；鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、菖鲉(bocachico)、鲤科鱼、鲶鱼、卡叉马鱼(cachama)、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、瓜波特鱼(guapote)、大比目鱼、爪哇鱼(java)、野鲮属鱼、莱鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼(paco)、珍珠斑点鱼(pearlspot)、佩杰瑞鱼(pejerrey)、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼(sampa)、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼(shiner)、睡鲨(sleeper)、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼(sweetfish)、丁鲷、特罗尔鱼(terror)、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼和白鱼)；以及甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。
在根据本发明的用途中，该LYS多肽可在饮食前、后或同时喂饲给动物。优选后者。
在一个具体实施例中，以一定形式加入饲料或包括在饲料添加剂中时，该LYS多肽是被明确限定的。明确限定指的是如经大小排阻色谱法(参见WO 01/58275的实例12)确定的，该LYS多肽制剂至少为50％纯。在其他具体实施例中，如经此方法确定的，该LYS多肽制剂至少为60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％纯，或至少为95％纯。
明确限定的LYS多肽制剂是有利的。例如，对于实质上不受其他溶菌酶干扰或污染的LYS多肽而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确地给料(dose correctly)具体是指得到一致且恒定的结果的目标，和基于所希望的效果优化剂量的能力。
然而，为了在动物饲料中使用，该LYS多肽不必是纯的；它可例如包括其他酶，在此情况下它可被定义为LYS多肽制剂。
该LYS多肽制剂可以(a)直接添加到饲料中，或者(b)它可以用于随后添加到饲料(或者用于处理过程中)中的一种或多种中间组合物(如饲料添加剂或预混物)的生产。上述纯化的程度是指根据上述(a)或(b)使用的原始LYS多肽制剂的纯度。
改善动物性能的方法
在一个实施例中，本发明还涉及改善动物性能的方法，该方法包括向动物施用本发明的动物饲料或动物饲料添加剂。
在一个优选的实施例中，改善动物性能的方法包括向动物施用本发明的包含LYS多肽的动物饲料或动物饲料添加剂。在一个实施例中，该LYS多肽选自由以下组成的组：SEQID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:42和SEQ ID NO:45。
在一个实施例中，本发明还涉及本发明的动物饲料或动物饲料添加剂用于改善动物的性能的用途。在另一个实施例中，本发明涉及本发明的一种或多种溶菌酶用于改善动物的性能的用途。
在一个实施例中，“改善动物的性能”意指存在体增重的增加。在另一个实施例中，“改善动物的性能”意指存在改善的饲料转化率。在另外的实施例中，“改善动物的性能”意指存在增加的饲料效率。在另外的实施例中，“改善动物的性能”意指存在体增重的增加和/或改善的饲料转化率和/或增加的饲料效率。
在一个实施例中，该动物饲料包含选自由以下组成的组的植物基材料：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如豆粕、油菜籽粕)或者其任何组合。
制备动物饲料的方法
在一个实施例中，本发明提供了一种用于制备动物饲料的方法，该方法包括将本发明的一种或多种LYS多肽添加至一种或多种动物饲料成分中。动物饲料成分包括但不限于浓缩物(如本文所定义)、草料(如本文所定义)、酶、益生菌、维生素、矿物质和氨基酸。
在一个优选实施例中，制备动物饲料的方法包括将植物基材料与本发明的LYS多肽混合。在一个实施例中，该LYS多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:45。
在一个实施例中，该植物基材料选自由以下组成的组：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如豆粕、油菜籽粕)或其任何组合。
优选实施例
以下是本发明优选实施例的列表。
1.一种组合物，该组合物包含至少0.01mg LYS多肽/千克组合物，其中该多肽(a)具有溶菌酶活性，并且(b)包含一个或多个LAD催化结构域；其中，当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型(HMM)查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为180，适当地其中通过利用HMM确定LAD催化结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询；
2.如项目1所述的组合物，其中该多肽进一步包含一个或多个溶菌酶增强结构域，其中当使用SEQ ID NO:188至316和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该溶菌酶增强结构域的domT评分至少为100，并且其中通过确定溶菌酶增强结构域的方法，使用hmmscan软件程序执行该查询。
3.如项目1至2中任一项所述的组合物，其中
(a)该LAD催化结构域包含一个或多个基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQID NO:317)和/或一个或多个基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)；和/或
(b)该溶菌酶增强结构域包含一个或多个基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
4.一种组合物，该组合物包含一种或多种具有溶菌酶活性的LYS多肽，其中将该多肽以至少0.01mg多肽/千克组合物给予，并且该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(r)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；以及
(s)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％。
5.如项目4所述的组合物，其中该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；以及
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。
6.如项目4所述的组合物，其中该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；以及
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。
7.如项目4所述的组合物，其中该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；以及
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQID NO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。
8.如项目4至7中任一项所述的组合物，其中该LYS多肽包含一个或多个选自由以下组成的组的基序：
(a)基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)；
(b)基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)；以及
(c)基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
9.如项目1至8中任一项所述的组合物，其中该多肽是真菌来源的。
10.如项目1至9中任一项所述的组合物，其中该多肽获得自或可获得分类学子囊菌门，优选分类学盘菌亚门。
11.如项目1至10中任一项所述的组合物，其中该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至226、SEQ ID NO:3的氨基酸1至226、SEQ ID NO:5的氨基酸1至226、SEQ ID NO:6的氨基酸1至226、SEQ ID NO:8的氨基酸1至223、SEQ ID NO:9的氨基酸1至223、SEQ ID NO:11的氨基酸1至304、SEQ ID NO:12的氨基酸1至304、SEQ ID NO:14的氨基酸1至228、SEQ ID NO:15的氨基酸1至228、SEQ ID NO:17的氨基酸1至230、SEQ ID NO:18的氨基酸1至230、SEQ ID NO:20的氨基酸1至230、SEQ ID NO:21的氨基酸1至230、SEQ ID NO:23的氨基酸1至232、SEQ IDNO:24的氨基酸1至232、SEQ ID NO:26的氨基酸1至228、SEQ ID NO:27的氨基酸1至228、SEQID NO:29的氨基酸1至228、SEQ ID NO:30的氨基酸1至228、SEQ ID NO:32的氨基酸1至226、SEQ ID NO:33的氨基酸1至226、SEQ ID NO:35的氨基酸1至225、SEQ ID NO:36的氨基酸1至225、SEQ ID NO:38的氨基酸1至225、SEQ ID NO:39的氨基酸1至225、SEQ ID NO:41的氨基酸1至304、SEQ ID NO:42的氨基酸1至304、SEQ ID NO:44的氨基酸1至227或SEQ ID NO:45的氨基酸1至227或由其组成。
12.如项目1至11中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含一种或多种配制剂。
13.如项目12所述的组合物，其中该一种或多种配制剂选自由以下组成的组：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土、麦芽糊精、环糊精、小麦、PVA、乙酸盐、磷酸盐和纤维素或其任何组合。
14.如项目1至13中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含一种或多种另外的酶。
15.如项目14所述的组合物，其中该一种或多种另外的酶选自由以下组成的组：乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、脂肪酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酶、果胶裂解酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
16.如项目1至15中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含一种或多种微生物。
17.如项目16所述的组合物，其中该一种或多种微生物选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、双歧杆菌属物种、肉食杆菌属物种、丁酸梭菌、梭菌属物种、屎肠球菌、肠球菌属物种、乳杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属物种、明串珠菌属物种、埃氏巨型球菌、巨型球菌属物种、乳酸片球菌、片球菌属物种、特氏丙酸杆菌、丙酸杆菌属物种和链球菌属物种或其任何组合。
18.如项目1至17中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下组成：
一种或多种维生素；
一种或多种矿物质；
一种或多种氨基酸；
一种或多种植生素；
一种或多种益生元；
一种或多种有机酸；以及
一种或多种其他饲料成分。
19.一种颗粒，该颗粒包含如项目1至18中任一项所述的组合物。
20.如项目19所述的颗粒，其中将该颗粒包衣。
21.如项目20所述的颗粒，其中该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。
22.一种动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含如项目1至18中任一项所述的组合物或如项目19至21中任一项所述的颗粒。
23.一种动物饲料，该动物饲料包含植物基材料和如项目1至18中任一项所述的组合物、如项目19至21中任一项所述的颗粒或如项目22所述的动物饲料添加剂。
24.如项目23所述的动物饲料，其中该植物基材料选自由以下组成的组：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如豆粕、油菜籽粕)或其任何组合。
25.一种丸粒状动物饲料，该丸粒状动物饲料包含植物基材料和如项目1至18中任一项所述的组合物、如项目19至21中任一项所述的颗粒或如项目22所述的动物饲料添加剂。
26.如项目25所述的丸粒状动物饲料，其中该植物基材料选自由以下组成的组：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如豆粕、油菜籽粕)或其任何组合。
27.一种液体配制品，该液体配制品包含如项目1至18中任一项所述的组合物。
28.如项目27所述的液体配制品，其中将该LYS多肽以0.01％至25％w/w之间的液体配制品给予，优选0.05％至20％w/w的LYS多肽，更优选0.2％至15％w/w的LYS多肽，更优选0.5％至15％w/w的LYS多肽，或最优选1.0％至10％w/w的LYS多肽。
29.如项目27至28中任一项所述的液体配制品，其中该配制品进一步包含20％至80％w/w的多元醇。
30.如项目29所述的液体配制品，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)或其任何组合。
31.如项目27至30中任一项所述的液体配制品，其中该配制品进一步包含0.01％至2.0％w/w的防腐剂。
32.如项目31所述的液体配制品，其中该防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。
33.如项目27至32中任一项所述的液体配制品，该液体配制品进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下组成：
一种或多种酶；
一种或多种微生物；
一种或多种维生素；
一种或多种矿物质；
一种或多种氨基酸；
一种或多种植生素；
一种或多种益生元；
一种或多种有机酸；以及
一种或多种其他饲料成分。
34.一种制备动物饲料的方法，该方法包括将如项目27至33中任一项所述的液体配制品施加到植物基材料上。
35.如项目34所述的方法，其中该液体配制品通过喷雾施加。
36.如项目34至35中任一项所述的方法，其中该植物基材料选自由以下组成的组：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如豆粕、油菜籽粕)或其任何组合。
37.如项目34至36中任一项所述的方法，其中该植物基材料处于丸粒状形式。
38.一种使用如项目34至37中任一项所述的方法制备的丸粒状动物饲料。
39.一种改善动物的一个或多个性能参数的方法，该方法包括向一只或多只动物施用如项目1至18中任一项所述的组合物、如项目19至21中任一项所述的颗粒、如项目22所述的动物饲料添加剂、如项目23至24中任一项所述的动物饲料、如项目25至26或38中任一项所述的丸粒状动物饲料或如项目27至33中任一项所述的液体配制品。
40.如项目39所述的方法，其中该性能参数选自由以下组成的列表：体增重(BWG)、欧洲生产效率因子(EPEF)和饲料转化率(FCR)或其任何组合。
41.一种制备动物饲料的方法，该方法包括将如项目1至18中任一项所述的组合物、如项目19至21中任一项所述的颗粒、如项目22所述的动物饲料添加剂、如项目23至24中任一项所述的动物饲料、如项目25至26或38中任一项所述的丸粒状动物饲料或如项目27至33中任一项所述的液体配制品与植物基材料混合。
42.如项目41所述的方法，其中该植物基材料选自由以下组成的组：豆类、谷类、燕麦、黑麦、大麦、小麦、玉蜀黍、玉米、高粱、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子、大豆、野生大豆、豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、油菜、稻、甜菜、卷心菜、糖甜菜、菠菜、奎奴亚藜、或豌豆，处于其加工形式(如豆粕、油菜籽粕)或其任何组合。
43.如项目1至18中任一项所述的组合物、如项目19至21中任一项所述的颗粒、如项目22所述的动物饲料添加剂、如项目23至24中任一项所述的动物饲料、如项目25至26或38中任一项所述的丸粒状动物饲料或如项目27至33中任一项所述的液体配制品在以下中的用途：
在动物饲料中；
在动物饲料添加剂中；
在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；
用于改善动物饲料的营养价值；
用于提高动物饲料的消化率；和/或
用于改善动物中的一个或多个性能参数。
44.一种具有溶菌酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少95％(例如，至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少94％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少87％(例如，至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少81％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少87％(例如，至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少96.2％(例如，至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少81％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％(例如，至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽；
(o)SEQ ID NO:3的多肽的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(p)SEQ ID NO:6的多肽的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:36，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(r)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:21、SEQID NO:24、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:42，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(s)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(t)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:39，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(u)SEQ ID NO:30的多肽的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7或8位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(v)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)或(u)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(w)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)或(u)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸的多肽；以及(x)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)或(u)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％。
45.根据项目44所述的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至316、SEQID NO:3的氨基酸1至316、SEQ ID NO:4的氨基酸1至322、SEQ ID NO:6的氨基酸1至318、SEQID NO:7的氨基酸1至318、SEQ ID NO:8的氨基酸1至326、SEQ ID NO:10的氨基酸1至316、SEQ ID NO:11的氨基酸1至316、SEQ ID NO:12的氨基酸1至324、SEQ ID NO:14的氨基酸1至316、SEQ ID NO:15的氨基酸1至316、SEQ ID NO:16的氨基酸1至324、SEQ ID NO:18的氨基酸1至316、SEQ ID NO:19的氨基酸1至316、SEQ ID NO:20的氨基酸1至324、SEQ ID NO:22的氨基酸1至316、SEQ ID NO:23的氨基酸1至316、SEQ ID NO:24的氨基酸1至324、SEQ ID NO:26的氨基酸1至516、SEQ ID NO:27的氨基酸1至516、SEQ ID NO:28的氨基酸1至524、SEQ IDNO:30的氨基酸1至317、SEQ ID NO:31的氨基酸1至317、SEQ ID NO:32的氨基酸1至325、SEQID NO:34的氨基酸1至316、SEQ ID NO:35的氨基酸1至316、SEQ ID NO:36的氨基酸1至324、SEQ ID NO:38的氨基酸1至316、SEQ ID NO:39的氨基酸1至316或SEQ ID NO:40的氨基酸1至324或由其组成。
46.一种编码如项目44至45中任一项所述的多肽的多核苷酸。
47.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如项目46所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
48.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如项目46所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
49.如项目48所述的重组宿主细胞，其中该宿主是丝状真菌例如曲霉属、木霉属或镰胞属，或酵母例如毕赤酵母属或酵母属。
50.如项目49所述的重组宿主细胞，其中该宿主是曲霉属，例如泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉。
51.如项目49所述的重组宿主细胞，其中该宿主是木霉属，例如哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
52.如项目48所述的重组宿主细胞，其中该宿主是芽孢杆菌属，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌。
53.一种产生如项目44至45中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；和
(b)回收该多肽。
54.一种产生如项目44至45中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如项目48至52中任一项所述的重组宿主细胞；和
(b)回收该多肽。
55.一种用编码如项目44至45中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
56.一种全液配制品或细胞培养组合物，该全液配制品或细胞培养组合物包含如项目44至45中任一项所述的多肽。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
菌株
将购自英杰公司(Invitrogen)(美国生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德，加利福利亚州，美国)的大肠杆菌Top-10菌株用于繁殖编码LYS多肽的表达载体。
将米曲霉菌株MT3568用于LYS多肽编码序列的异源表达。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因来恢复pyrG营养缺陷型。
通过采用PDA培养基(pH7，25C)的稀释平板法，将真菌菌株NN044175从1998年采集自中国的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN044175鉴定为简青霉。
通过采用PDA介质(pH3，25C)的稀释平板法，将真菌菌株NN053742从2011年采集自中国湖北省的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN053742鉴定为Penicillium vasconiae。
通过采用PDA培养基(pH3)的稀释平板法，将真菌菌株NN058285从2014年采集自中国贵州省的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN058285鉴定为解蛋白篮状菌。
通过采用PDA培养基(pH7，25C)的稀释平板法，将真菌菌株NN053333从2010年采集自中国湖南省的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN053333鉴定为曲霉属物种XZ2668。
真菌菌株NN058605来自CBS，登录号为CBS100492。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN058605鉴定为南极青霉。
通过采用YG培养基(pH7，37C)的稀释平板法，将真菌菌株NN047528从1998年采集自中国的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN047528鉴定为Ovatospora brasiliensis。
通过采用PDA培养基(pH7，10C)的稀释平板法，将真菌菌株NN054749从2012年采集自中国西藏的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN054749鉴定为惠灵顿青霉。
通过采用水琼脂(24C)的稀释平板法，将真菌菌株NN054129从2011年采集自瑞典哥特兰岛的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN054129鉴定为玫瑰紫青霉。
通过采用PDA培养基(pH3)的稀释平板法，将真菌菌株NN058650从2014年采集自中国贵州省的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN058650鉴定为帚青霉。
通过采用YG培养基(pH7，37C)的稀释平板法，将真菌菌株NN046949从1998年采集自中国的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN046949鉴定为霉白曲霉。
2014年通过与CAS微生物学研究所的蔡磊(Cai Lei)教授的合作获得真菌菌株NN057921。从中国收集菌株。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将该菌株鉴定为毛壳菌属物种ZY369。
通过采用PDA培养基(pH3，25C)的稀释平板法，将真菌菌株NN058427从2014年采集自中国贵州省的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将该菌株N NN058427鉴定为Talaromyces atricola。
2011年通过与CAS微生物学研究所的合作获得真菌菌株NN053773。从中国收集该菌株，并通过采用PDA培养基(pH7，10C)的稀释平板法分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN053773鉴定为粗糙短梗蠕孢。
通过采用PDA培养基(pH3，25C)的稀释平板法，将真菌菌株NN058086从2014年采集自中国贵州省的土壤样品中分离。然后通过将单分生孢子转移至PDA琼脂板上进行纯化。基于形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN058086鉴定为肉色绿僵菌。
土生梭孢壳霉菌株NRRL 8126购自ATCC，并将其接种到PDA平板上，并在37℃下于黑暗中孵育7天。将来自平板的菌丝体和孢子接种到含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在37℃以150rpm振荡孵育6天。
培养基和溶液
DAP4C-1培养基由以下各项构成：0.5g酵母提取物、10g麦芽糖、20g右旋糖、11g硫酸镁七水合物、1g磷酸氢二钾、2g一水合柠檬酸、5.2g磷酸钾三元一水合物、1mL Dowfax63N10(消泡剂)、2.5g碳酸钙，补充有1mL KU6金属溶液以及去离子水补足至1000mL。
KU6金属溶液由以下各项构成：6.8g ZnCl2、2.5g CuSO4.5H2O、0.13g NiCl2、13.9gFeSO4.7H2O、8.45g MnSO4.H2O、3g C6H8O7.H2O、以及去离子水补足至1000mL。
YP 2％葡萄糖培养基由以下各项构成：10g酵母提取物、20g细菌用蛋白胨(Bacto-peptone)、20g葡萄糖、以及去离子水补足至1000mL。
LB板由以下各项构成：10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂(Bacto-agar)、以及去离子水补足至1000mL。
LB培养基由以下各项构成：10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、和10g的氯化钠、以及去离子水补足至1000mL。
COVE-蔗糖-T平板由以下各项构成：342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20mL的COVE盐溶液、以及去离子水补足至1000mL。将该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。将该培养基冷却至60℃并且添加10mM乙酰胺、Triton X-100(50μL/500mL)。
COVE-N-琼脂管由以下各项构成：218g山梨醇、10g右旋糖、2.02g KNO3、25g琼脂、50mL Cove盐溶液、以及去离子水补足至1000mL。
COVE盐溶液由以下各项构成：26g的MgSO4·7H2O、26g的KCL、26g的KH2PO4、50mL的COVE痕量金属溶液、以及去离子水补足至1000mL。
COVE痕量金属溶液由以下各项构成：0.04g的Na2B4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、0.7g的MnSO4·H2O、0.8g的Na2MoO4·2H2O、10g的ZnSO4·7H2O、以及去离子水补足至1000mL。YPM培养基包含1％的酵母提取物、2％的蛋白胨和2％的麦芽糖。
实例1：使用还原末端测定法测定溶菌酶活性
将LYS多肽在聚丙烯管中在磷酸盐缓冲液(5mM柠檬酸盐，5mM K2HPO4，0.01％TritonX-100，pH 5.0)中稀释至50μg/mL。将稀释的LYS多肽在96孔聚丙烯微量滴定板中进一步稀释至在磷酸盐缓冲液(5mM柠檬酸盐，5mM K2HPO4，0.01％TritonX-100，pH 5.0)中浓度为5.0或0.7μg/mL。在聚丙烯深孔板中，将50μL LYS多肽稀释液与450μL 1％溶壁微球菌溶液(在milli-Q水中冻干的溶壁微球菌ATCC号4698(Sigma M3770))混合，并在40℃下伴随振荡(500rpm)孵育45分钟。孵育后，将深孔板离心(4000g，5分钟)以沉淀不溶物质，并将100μL上清液与50μL3.2M HCl在96孔PCR板中混合，并在95℃孵育80分钟。向PCR板的每个孔中添加50μL的3.5M NaOH，并将150μL的每种样品转移到新PCR板，该新PCR板含有在酒石酸K-Na/NaOH缓冲液(50g/L酒石酸K-Na+20g/L NaOH)中的75μL/孔的4-羟基苯甲酰肼溶液。将板在95℃孵育10分钟，然后将100μL/样品转移至透明平底微量滴定板，用于405nm处的光密度(OD)测量。对三次稀释的样品(在Milli-Q水中在100μL中稀释的50μL样品)进行OD测量。
实例2：使用OD下降测定法测定溶菌酶活性
洗涤经冷冻干燥的溶壁微球菌ATCC号4698(西格玛公司)，并将其悬浮于60mMKH2PO4缓冲液(pH 6.0)中，最终浓度为1％(w/v)，作为底物原液。通过添加柠檬酸-Na2HPO4缓冲液来调节该菌株的浓度，直到OD450达到约1。
通过添加61.45ml 0.1M柠檬酸和38.55ml 0.2M Na2HPO4(pH 4)制备柠檬酸-Na2HPO4 pH 4缓冲液。将50μg/mL的20μL酶和200μL的在柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH4)中稀释的细菌菌株溶液添加到96孔板中，混合并读取OD450。然后将板在37℃、300rpm下孵育1小时并读取OD450。1小时时间点与初始读数之间的OD差异显示了LYS多肽的OD下降活性。通过添加20ul MQ水或相应的缓冲液设置空白，并一式三份地测量每个样品。
实例3：基因组DNA提取
将简青霉菌株NN044175接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育9天。
将Penicillium vasconiae菌株NN053742接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育3天。
将解蛋白篮状菌菌株NN058285接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育4天。
将曲霉属物种菌株NN053333接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育5天。
将南极青霉菌株NN058605接种到PDA平板上，并在25℃下于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育4天。
将Ovatospora brasiliensis菌株NN047528接种到PDA平板上，并在37℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在37℃以160rpm振荡孵育2天。
将惠灵顿青霉菌株NN054749接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育11天。
将玫瑰紫青霉菌株NN054129接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育4天。
将帚青霉菌株NN058650接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育4天。
将霉白曲霉菌株NN046949接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育3天。
将毛壳菌属物种菌株NN057921接种到PDA平板上，并在37℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在37℃以160rpm振荡孵育8天。
通过(康碧泉公司(Calbiochem)，拉霍亚，加利福尼亚州，美国)过滤来收集南极青霉菌株NN058605的菌丝，并且在液氮中冷冻。用研钵和研棒将冷冻的菌丝磨碎成细粉，并且遵循制造商的说明使用针对土壤的MP Faster DNA spin试剂盒(MP生物医疗公司(MP Biomedicals)，圣安娜(Santa Ana)，加利福尼亚州，美国)分离出基因组DNA。
将Talaromyces atricola菌株NN058427接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育3天。
将粗糙短梗蠕孢菌株NN053773接种到PDA平板上，并在15℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在15℃以160rpm振荡孵育4天。
将肉色绿僵菌菌株NN058086接种到PDA平板上，并在25℃于黑暗中孵育7天。将若干个菌丝-PDA塞接种于含有100ml YPG培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在25℃以160rpm振荡孵育4天。
通过(康碧泉公司，拉霍亚，加利福尼亚州，美国)过滤来收集土生梭孢壳霉的菌丝，并且在液氮中冷冻。用研钵和研棒将冷冻的菌丝磨碎成细粉，并且使用Plant Maxi试剂盒(24)(凯杰有限公司(QIAGEN GmbH)，希尔登，德国)遵循制造商的说明分离出基因组DNA。
通过过滤来收集所有其他菌株的菌丝，并且在液氮中冷冻。用研钵和研棒将冷冻的菌丝磨碎成细粉，并且使用Plant Maxi试剂盒(24)(凯杰有限公司，希尔登，德国)遵循制造商的说明分离出基因组DNA。
实例4：基因组测序、装配与标注
将简青霉菌株NN044175的提取的基因组DNA样品传送到Exiqon A/S公司(丹麦)，以使用MiSeq系统(亿明达公司(Illumina,Inc.)，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行基因组测序。使用程序Idba(Peng,Yu等人,2010,Research in ComputationalMolecular Biology[计算分子生物学研究]6044:426-440.Springer Berlin Heidelberg[柏林海德尔堡斯普林格出版社])，将原始读数在丹麦诺维信公司(Novozymes)装配。
将解蛋白篮状菌菌株NN058285、南极青霉菌株NN058605、玫瑰紫青霉菌株NN054129、帚青霉菌株NN058650、霉白曲霉菌株NN046949、肉色绿僵菌菌株NN058086的提取的基因组DNA样品传送到Exiqon A/S公司，以使用MiSeq系统进行基因组测序。使用Spades程序(Anton Bankevich等人,2012,Journal of Computational Biology[计算生物学杂志],19(5):455-477)，将原始读数在丹麦诺维信公司装配。
将Penicillium vasconiae菌株NN053742、Ovatospora brasiliensis菌株NN047528、粗糙短梗蠕孢菌株NN053773的提取的基因组DNA样品传送到Fasteris公司(瑞士)，以使用HiSeq 2000系统(亿明达公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行基因组测序。使用程序Idba在丹麦诺维信公司装配原始读数。
将曲霉属物种菌株NN053333、毛壳菌属物种菌株NN057921和Talaromycesatricola菌株NN058427的提取的基因组DNA样品传送到诺维信戴维斯公司(NovozymesDavis)(美国)，以使用MiSeq系统进行基因组测序。使用程序Spades在丹麦诺维信公司装配原始读数。
将惠灵顿青霉菌株NN054749的提取的基因组DNA样品传送到诺维信戴维斯公司，以使用MiSeq系统进行基因组测序。使用程序Idba在丹麦诺维信公司装配原始读数。
使用标准生物信息学方法分析装配的序列，用于基因鉴定和功能预测。使用GeneMark-ES真菌版本(Ter-Hovhannisyan V等人,2008,Genome Research[基因组研究]18(12):1979-1990)进行基因预测。基于结构同源性，使用Blastall版本2.2.10(Altschul等人,1990,Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志]215(3):403-410),ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/release/2.2.10/)和HMMER版本2.1.1(国家生物技术信息中心(NCBI)，贝塞斯达，马里兰州，美国)来预测功能。通过分析Blast结果直接鉴定NZ5家族。使用Agene程序(Munch和Krogh,2006,BMC Bioinformatics[BMC生物信息学]7:263)和SignalP程序(Nielsen等人,1997,Protein Engineering[蛋白质工程]10:1-6)鉴定起始密码子。进一步使用SignalP程序来预测信号肽。使用Pepstats(Rice等人,2000,Trends in Genetics[遗传学趋势]16(6):276-277)来预测等电点和分子量。
实例5：真菌NZ5基因(SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37和40)的克隆、表达和发酵
十四个真菌LYS野生型基因，即LYS_Pesi(SEQ ID NO:1)、LYS_Pv(SEQ ID NO:4)、LYS_Tapr(SEQ ID NO:7)、LYS_Asp2668(SEQ ID NO:10)、LYS_Pean(SEQ ID NO:13)、LYS_chbr(SEQ ID NO:16)、LYS_Pewe(SEQ ID NO:19)、LYS_Pr(SEQ ID NO:22)、LYS_Pevir(SEQID NO:25)、LYS_asni(SEQ ID NO:28)、LYS_ch369(SEQ ID NO:31)、LYS_Taat(SEQ ID NO:34)、LYS_Tras(SEQ ID NO:37)、LYS_Meca2(SEQ ID NO:40)，分别克隆自简青霉菌株NN044175、Penicillium vasconiae菌株NN053742、解蛋白篮状菌菌株NN058285、曲霉属物种菌株NN053333、南极青霉NN058605、Ovatospora brasiliensis菌株NN047528、惠灵顿青霉菌株NN054749、玫瑰紫青霉菌株NN054129、帚青霉菌株NN058650、霉白曲霉菌株NN046949、毛壳菌属物种菌株NN057921、Talaromyces atricola菌株NN058427、粗糙短梗蠕孢菌株NN053773、肉色绿僵菌菌株NN058086。
如WO 2013029496中所述，将真菌LYS基因克隆到米曲霉表达载体pCaHj505中。具有天然分泌信号的LYS编码序列的转录处于米曲霉α-淀粉酶基因启动子的控制下。
将最终的表达质粒，即p505-LYS_Pesi、p505-LYS_Pv、p505-LYS_Tapr、p505-LYS_Asp2668、p505-LYS_Pean、p505-LYS_chbr、p505-LYS_Pewe、p505-LYS_Pr、p505-LYS_Pevir、p505-LYS_asni、p505-LYS_ch369、p505-LYS_Taat、p505-LYS_Tras和p505-LYS_Meca2，分别转化到米曲霉表达宿主中。通过同源重组将LYS基因整合到转化后的米曲霉宿主基因组中。从选择性培养基琼脂平板中选择每个转化的四个转化体，并接种到24孔板中的3ml YPM或Dap4C培养基中，并在30℃、150rpm孵育。3天的孵育之后，根据制造商的说明，在NuPAGENovex 4％-12％Bis-Tris凝胶w/MES上对来自每一转化体的20μl上清液进行分析。用Instant Blue染色所得凝胶。培养物的SDS-PAGE图谱显示，所有基因均表达了1条蛋白带，分别在约28kDa、25kDa、25kDa、35kDa、25kDa、25kDa、25kDa、25kDa、25kDa、25kDa、25kDa、25kDa、25kDa、30kDa处检测。选择蛋白带最强的重组米曲霉菌株进行摇瓶培养。将重组菌株接种在由斜面培养基制成的斜面上，并在37C孵育6-7天。当菌株充分生长至完全形成孢子时，将它们接种到2L摇瓶中，每个摇瓶含有400ml YPM或DAP4C，每种菌株5-6个烧瓶。烧瓶在80rpm，30C振荡。在第3天或第4天收获培养物，并使用0.22μm DURAPORE膜过滤，并如实例9所述进行纯化。
实例6：改善的分裂标记米曲霉宿主的构建
构建了与WO 2016026938A1中披露的实例5中描述的相当的改善的米曲霉宿主/载体系统。通过将位于质粒pDAu724的PART-II上的FLPase表达盒(参见WO 2016/026938中第34页，图7和SEQ ID NO:30)移至宿主菌株的基因组中的整合基因座amy2中，做出了改善以减小转化DNA的大小。通过从pDAu724扩增FLPase表达盒并在pDAu703的FRT-F3和amdS选择标记之间克隆，将FLPase表达盒克隆到pDAu703(WO 2016/026938，第32页和图6以及SEQID:29)中，以给出质粒pDAu770(图1，SEQ ID NO:320)。使用与WO 2016/026938第33页中描述的相同的方案将线性化质粒pDAu770转化到米曲霉菌株Jal1338的原生质体中(披露于WO2012/160097中)。在AmdS选择平板上选择转化体以获得菌株DAu785。所得重组宿主菌株DAu785具有与DAU716(WO 2016/026938)中相似的经修饰的amy2基因座，其中添加了FLPase表达盒(图2，上图)。现在，该宿主菌株DAu785组成性地表达FLPase位点特异性重组酶(在这一情况下允许在转化DNA的FRT位点处整合通过重叠延伸PCR反应获得的PCR片段(图2，中间图和下图))并描述于实例7中。
实例7：重叠延伸PCR克隆(SEQ ID NO:43)
使用50μL反应体积的Phusion高保真DNA聚合酶(新英格兰实验室(New EnglandBiolabs)，生物诺沃挪第克丹麦公司(BioNordika Denmark A/S)，海莱乌(Herlev)，丹麦)和表2中披露的引物进行编码LYS多肽的SEQ ID NO:43的PCR扩增。
表2：PCR引物
*-F-正向引物；-R-反向引物；粗体字母代表编码序列。
PCR反应混合物由以下组成：10μL Phusion反应缓冲液HF(5x)；1μL PCR核苷酸混合物(10mM)；2μL正向克隆引物(2.5mM)；2μL反向克隆引物(2.5mM)；1μL Phusion高保真DNA聚合酶#M0530L(2000U/mL)；和PCR级水补充至50μL。使用以下程序在热循环仪T100(伯乐公司(Biorad)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州，美国)上孵育PCR反应：在98℃初始变性2分钟，然后在98℃进行30个10秒的循环，在72℃进行2分钟，最后在72℃最终延伸10分钟。使用适用于Biomek FXp液体处理器(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，布雷亚(Brea)，加利福尼亚，美国)的AMPure XP珠系统试剂盒(Agencourt公司，贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州，美国)纯化PCR扩增子。
在反应中，将pDAu724质粒用作DNA模板以扩增两种PCR产物(F1和F3)，该反应由以下各项构成：10μL的KAPA聚合酶缓冲液5x、1μL 10mM的KAPA PCR核苷酸混合物、1μL 10μM的合适的正向引物(F1的SEQ ID NO:323和F3的SEQ ID NO:325，表3)、1μL 10μM的合适的反向引物(F1的SEQ ID NO:324和F3的SEQ ID NO:326，表3)、1至10ng的pDAu724质粒、1μL的KAPA生物系统聚合酶KK2502(1单位)和PCR级水补充至50μL。
在Dual-Block热循环仪(MJ研究公司(MJ Research Inc.)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)上进行PCR扩增反应，程序为在98℃下2分钟，并随后进行在98℃下10秒和在72℃下2分钟的35个循环，以及在72℃下10分钟的最后一个循环。
使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分析五μl PCR反应，其中观察到适当大小的DNA条带。根据制造商的说明，使用ILLUSTRATM GFXTM PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒纯化剩余的PCR反应。
表3：PCR引物
用于对从土生梭孢壳霉gDNA扩增的LYS多肽基因进行克隆的重叠延伸PCR反应由以下各项构成：10μL的KAPA聚合酶缓冲液(5X)、1μL 10mM的KAPA PCR核苷酸混合物、50ng的PCR片段F1和等摩尔量的PCR片段F3、和编码SEQ ID NO:45的LYS多肽基因、1μl的KAPA生物系统聚合酶KK2502(1单位)以及PCR级水补充至48μL。使用由以下构成的程序在Dual-Block热循环仪(MJ研究公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)上孵育反应：在98℃下2分钟；随后进行5个循环，各自由以下构成：在98℃下10秒、在68℃下30秒、和在72℃下5分钟，以及最后在72℃下8分钟的最后的延伸。
在OE PCR反应期间，通过正向克隆引物(KKSC0972-F)中包含的SEQ ID NO:327中的重叠来确保片段F1和编码SEQ ID NO:45的LYS多肽基因之间的退火，并且通过反向克隆引物(KKSC0972-R)中包含的重叠SEQ ID NO:328来确保片段F3和编码SEQ ID NO:45的LYS多肽基因之间的退火。
将1μL 10mM的引物SEQ1和1μL 10mM的引物SEQ4添加到OE PCR反应中，并且使用以下构成的程序在Dual-Block热循环仪(MJ研究公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)上第二次孵育该反应：在98℃下2分钟；随后进行25个循环，各自由以下构成：在98℃下10秒，和在72℃下4分钟，以及最后在72℃下10分钟的最后的延伸。
使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分析五μl PCR反应，其中观察到适当大小的DNA条带。通过在60℃下加热管将剩余的PCR反应浓缩至20μL。将10μL的该反应用于米曲霉DAu785原生质体转化。
正向结合引物SEQ ID NO:327：CTATATACACAACTGGGGATCCACC
反向结合引物SEQ ID NO:328：TAGAGTCGACCCAGCCGCGCCGGCCA
实例8：曲霉属原生质体的制备
米曲霉MT3568的原生质体是根据WO 95/002043制备的。将100μl原生质体与OEPCR片段KKSC0972和250μL的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem)，达姆施塔特，德国)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl pH 7.5混合并轻轻混合。将混合物在37℃孵育30分钟并且将这些原生质体铺展到COVE平板上用于选择。在37℃孵育4-7天后，将四个转化体的孢子接种到96孔微量滴定板中的0.2mL的YP+2％葡萄糖或DAP4C-1培养基中。在30℃培养4天后，通过SDS-PAGE分析培养液以鉴定产生最高量LYS多肽的转化体。
将来自转化的最佳转化体的孢子铺展于包含0.01％X-100的COVE平板上，以便分离单个菌落。在含有10mM硝酸钠的COVE平板上总共重复铺展两次。然后将孢子接种到含有100mL的YP+2％葡萄糖的500mL摇瓶中，并在30℃以100rpm振荡孵育4天。使用0.2μm过滤装置通过过滤收获培养液并如实例9所述纯化。
实例9：LYS多肽的纯化
纯化程序的活性检测
将冷冻干燥的细菌菌株溶壁微球菌ATCC号4698(西格玛公司)和微小杆菌属物种(Exiguobacterium sp.)(从土壤中分离)分别洗涤并悬浮于60mM KH2PO4缓冲液(pH 6.0)中，最终浓度为1％(w/v)，作为底物原液。在活性检测之前，用60mM KH2PO4缓冲液(pH 6.0或pH 4.0)将底物的浓度稀释至0.035％，与OD450的约0.7相关。将10ul多肽样品(或5ul样品，如果含有高浓度盐，则含5ul MQ水)和190ul 0.035％底物添加到96孔板中，然后读取OD450。将板在恒温混匀仪中在室温或37℃下以300rpm孵育30或60分钟。将板摇动10秒钟，并再次读取OD450。OD下降显示溶菌酶活性。空白添加10μl的60mM KH2PO4(pH 6.0或pH 4.0)缓冲液，并且如有必要，以一式两份测量每个样品。
SEQ ID NO:3的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后用pH 4.5的20mM NaAc透析。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 4.5的20mM NaAc平衡的SP快流柱(GE医疗集团(GE Healthcare))中。使用NaCl浓度梯度增加作为从0至1M的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，并且然后浓缩用于进一步评估。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:6的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后向沉淀中添加水以调节电导率至约140mS/cm。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 8.0的20mM PBS(添加1.2M(NH4)2SO4)平衡的HIC高效柱(GE医疗集团)中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.2M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。
收集贯流液和从1到15的级分，将电导率调整为180mS/cm，然后重新加载到用pH8.0的20mM PBS(添加1.8M(NH4)2SO4)平衡的HIC柱中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.8M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，合并在一起，并用pH 6.0的20mM PBS渗滤。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:9的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后向沉淀中添加水以调节电导率至约170mS/cm。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 7.0的20mM PBS(添加1.5M(NH4)2SO4)平衡的HIC高效柱(GE医疗集团)中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.5M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，合并在一起，并用pH 6.0的20mM PBS渗滤。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:12的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后向沉淀中添加水以调节电导率至约185mS/cm。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加1.8M(NH4)2SO4)平衡的HIC高效柱(GE医疗集团)中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.8M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，合并在一起，并用pH 6.0的20mM Bis-Tris渗滤。
将样品加载到用pH 6.0的20mM Bis-Tris平衡的Mono Q柱(GE医疗集团)中。使用NaCl浓度梯度增加作为从0至1M的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，并且然后浓缩用于进一步评估。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:15的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后向沉淀中添加水以调节电导率至约170mS/cm。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加1.5M(NH4)2SO4)平衡的苯基快流柱(GE医疗)中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.5M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。
收集贯流液和具有溶菌酶活性的级分，将电导率调整为190mS/cm，然后重新加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加1.5M(NH4)2SO4)平衡的HIC柱中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.5M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，合并在一起，并用pH 6.0的20mM PBS渗滤。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:18的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀来自LYS_chbr(SEQ ID NO:16)的表达的培养上清液，然后向沉淀中添加水以调节电导率至约170mS/cm。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加1.8M(NH4)2SO4)平衡的苯基琼脂糖高效柱(GE医疗集团)中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.8M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，并将级分合并在一起，并用pH 6.0的20mM PBS渗滤。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
通过完整分子量(MAXIS II电喷雾质谱仪(布鲁克股份有限公司(BrukerDaltonik GmbH)，不莱梅，德国(DE)))进行的分析表明，主要产物对应于SEQ ID NO:18的氨基酸1至230(检测质量24128.35Da，预测质量24128.21Da)，次要产物对应于SEQ ID NO:18的氨基酸4至230(检测的质量23768.79Da，预测的质量23768.16Da)。
SEQ ID NO:329的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀来自LYS_chbr(SEQ ID NO:16)的表达的培养上清液，然后用pH 6.5的20mM PBS透析。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH6.5的20mM PBS平衡的Capto SP柱(GE医疗集团)中。使用NaCl浓度梯度增加作为从0至1M的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，并且然后浓缩用于进一步评估。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
通过N-末端测序(应用生物系统(Applied Biosystems)精确氨基酸测序仪494型)和完整分子量(MAXIS II电喷雾质谱仪(布鲁克股份有限公司(Bruker Daltonik GmbH)，不莱梅，德国(DE)))进行的分析显示，N-末端LED结构域已被切除，剩下LAD催化结构域，并且该分子具有异质N-末端(参见表4)。主要产物对应于残基85-230，且被披露为SEQ ID NO:329。
表4：N-末端和完整分子量的测定
SEQ ID NO:21的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后向沉淀中添加水以调节电导率至约140mS/cm。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 4.5的20mM NaAc(添加2M NaCl)平衡的苯基快流柱(GE医疗集团)中。使用NaCl浓度梯度降低作为从2M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。
收集贯流液和具有溶菌酶活性的级分，将电导率调整为180mS/cm，然后重新加载到用pH 4.5的20mM NaAc(添加4M NaCl)平衡的HIC柱中。使用NaCl浓度梯度降低作为从4M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分和未结合的样品，合并在一起并浓缩。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:24的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后向沉淀中添加水以调节电导率至约170mS/cm。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加4MNaCl)平衡的HIC高效柱(GE医疗集团)中。使用NaCl浓度梯度降低作为从4M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。
收集贯流液和具有溶菌酶活性的未结合的样品，将电导率调整为190mS/cm，然后重新加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加1.8M(NH4)2SO4)平衡的HIC柱中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.8M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，合并在一起，并用pH 6.0的20mM PBS渗滤。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:27的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后用pH 5.5的20mM NaAc透析。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 5.5的20mM NaAc平衡的Capto SP柱(GE医疗集团)中。使用NaCl浓度梯度增加作为从0至1M的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分。合并具有溶菌酶活性的级分并浓缩，但是发现样品降解。
将样品的电导率调整为200mS/cm，然后重新加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加2.0M(NH4)2SO4)平衡的苯基高效柱中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从2.0M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，合并在一起，并用pH 6.0的20mM PBS渗滤。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:30的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后用pH 4.5的20mM NaAc透析。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 4.5的20mM NaAc平衡的Capto SP柱(GE医疗集团)中。使用NaCl浓度梯度增加作为从0至1M的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，并且然后浓缩用于进一步评估。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:33的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀O33X73的培养上清液，然后用pH 4.5的20mMNaAc透析。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 4.5的20mM NaAc平衡的Capto SP柱(GE医疗集团)中。使用NaCl浓度梯度增加作为从0至1M的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，并且然后浓缩用于进一步评估。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:36的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后用pH 7.0的20mM PBS透析。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 7.0的20mM PBS平衡的Capto Q柱(GE医疗集团)中。使用NaCl浓度梯度增加作为从0至1M的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分。挑取具有溶菌酶活性的贯流级分以进行进一步纯化。
将贯流级分的pH调节至pH 4.5，然后重新加载到用pH 4.5的20mM NaAC平衡的Capto SP柱中。使用NaCl浓度梯度增加作为从0至1M的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，并合并在一起。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:39的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后向沉淀中添加水以调节电导率至约170mS/cm。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加1.5M(NH4)2SO4)平衡的苯基琼脂糖6快流柱(GE医疗集团)中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.5M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。仍在贯流级分和级分1至12中发现了溶菌酶活性，将它们合并在一起以进行进一步纯化。
将具有溶菌酶活性的样品的电导率调整为190mS/cm，然后重新加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加1.8M(NH4)2SO4)平衡的苯基琼脂糖高效柱中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.8M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，合并在一起，并用pH 6.0的20mM PBS渗滤。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
SEQ ID NO:42的纯化
首先用硫酸铵(80％饱和度)沉淀培养上清液，然后向沉淀中添加水以调节电导率至约170mS/cm。将溶液用0.45um过滤器过滤，并且然后加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加1.5M(NH4)2SO4)平衡的苯基琼脂糖高效柱(GE医疗集团)中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.5M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分，但发现两个条带。将具有溶菌酶活性的级分合并在一起以进行进一步纯化。
将这些级分的电导率调整为140mS/cm，然后重新加载到用pH 6.0的20mM PBS(添加1.2M(NH4)2SO4)平衡的苯基琼脂糖高效柱中。使用(NH4)2SO4浓度梯度降低作为从1.2M至0的洗脱缓冲液，并且然后收集洗脱级分和贯流级分以检测溶菌酶活性。通过SDS-PAGE分析具有溶菌酶活性的级分。级分29至37具有较低的分子量，将其合并在一起，并用pH 6.0的20mM PBS渗滤。级分43至45具有较高的分子量，将其合并在一起，并用pH 6.0的20mM PBS渗滤。通过蛋白质测定试剂盒(英杰公司，目录Q33212)测定蛋白质浓度。
通过N-末端测序(应用生物系统精确氨基酸测序仪494型)进行的分析显示，产物以N-末端序列YPIKDNN开始，对应于SEQ ID NO:42的氨基酸1至7。
通过完整分子量(MAXIS II电喷雾质谱仪(布鲁克股份有限公司(BrukerDaltonik GmbH)，不莱梅，德国(DE)))进行的分析表明，主要产物对应于SEQ ID NO:42的氨基酸1至304(检测质量31755.59Da，预测质量31754.97Da)。由于第一LED结构域从N-末端被切除，所以还存在少量对应于SEQ ID NO:42的氨基酸76至304的次要产物(检测质量23617.23Da，预测质量23617.15Da)。
SEQ ID NO:45的纯化
通过具有0.22μm截留的快速PES瓶(Fast PES Bottle)顶部过滤器过滤具有溶菌酶的发酵上清液。将250ml过滤的发酵样品用250ml MilliQ水稀释，并将pH调整到4.5。将含有溶菌酶的溶液通过Capto S色谱(在XK16柱中约30ml，使用50mM乙酸钠pH 4.5作为缓冲液A，使用50mM乙酸钠+2M NaCl pH 4.5作为缓冲液B，使用0-100％的梯度，超过约10CV)进行纯化。基于色谱图(在280nm和254nm处的吸收)和SDS-PAGE分析，将来自该柱的级分进行合并。
由SDS-PAGE估算分子量为25kDa，并且纯度>90％。
实例10：利用HMM确定LAD催化结构域的方法
使用具有默认设置的软件程序MUSCLE v3.8.31来比对SEQ ID NO:46至187。使用此比对，使用软件包HMMER 3.0(2010年3月)(http://hmmer.org/)中的软件程序’hmmbuild’构建HMM，并通过以下命令使用默认设置启用该软件：hmmscan3--tbloutoutput.dat model.hmm sequences.fasta。下面给出由此产生的LAD催化结构域HMM序型，以供随后加载到软件程序’hmmscan’中。
HMMER3/b[3.0|2010年3月]
实例11：利用HMM确定溶菌酶增强结构域的方法
使用具有默认设置的软件程序MUSCLE v3.8.31来比对SEQ ID NO:188至316。使用此比对，使用软件包HMMER 3.0(2010年3月)(http://hmmer.org/)中的软件程序’hmmbuild’构建HMM，并通过以下命令使用默认设置启用该软件：hmmscan3--tbloutoutput.dat model.hmm sequences.fasta。下面给出由此产生的溶菌酶增强结构域HMM序型，以供随后加载到软件程序’hmmscan’中。
HMMER3/b[3.0|2010年3月]
实例12：DomT评分的确定
使用如本文所述的来自实例10的LAD催化结构域HMM和来自实例11的溶菌酶增强结构域HMM，确定本发明的LYS多肽的LAD结构域和LED结构域的DomT评分，呈现于下表5中。
表5：LAD和LED结构域的DomT评分
所有要求保护的LYS多肽均具有至少170的LAD DomT评分，这表明与LAD HMM模型具有良好的同源性。同样，所有要求保护的LYS多肽均具有LED，均具有至少100的LED DomT评分，这表明与LED HMM模型具有良好的同源性。
实例13：使用还原末端测定法测定的LYS多肽的活性
根据实例1在两种酶浓度下测试本发明的LYS多肽，结果示于下表6至8中。
表6：SEQ ID NO:3的OD下降
1：酶浓度
表7：SEQ ID NO:6至45的OD下降
1：酶浓度
可以看出，本发明的LYS多肽显示出如使用还原末端测定法测定的溶菌酶活性。
实例14：使用OD下降测定法测定的LYS多肽的活性
根据实例2在pH 4下测试本发明的LYA多肽，结果示于下表8和9中。
表8：针对滕黄微球菌的OD下降
表9：针对滕黄微球菌的OD下降
可以看出，本发明的LYS多肽显示出如使用针对滕黄微球菌的传统OD下降测定法测定的溶菌酶活性。
实例19：包含LYS多肽的动物饲料和动物饲料添加剂
动物饲料添加剂
将含有0.01g至10g酶蛋白质的本发明的LYS多肽(例如SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45或239)的配制品添加到以下预混物中(每千克预混物)：
动物饲料
这是动物饲料(肉鸡饲料)的一个实例，其包含如上文所述的动物饲料添加剂：
62.55％玉蜀黍
33.8％豆粕(50％粗蛋白)
1.0％大豆油
0.2％DL-甲硫氨酸
0.22％DCP(磷酸二钙)
0.76％CaCO3(碳酸钙)
0.32％砂
0.15％NaCl(氯化钠)
1％上述预混物
将这些成分混合，并将饲料在所希望的温度(例如60℃、65℃、75℃、80℃、85℃、90℃或甚至95℃)下丸粒化。
本文所述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将从前述描述变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开内容为准。
Claims (20)
1.一种组合物，该组合物包含至少0.01mg LYS多肽/千克组合物，其中该多肽(a)具有溶菌酶活性，并且(b)包含一个或多个LAD催化结构域；其中，当使用SEQ ID NO:46至187和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型(Profile Hidden Markov Model，HMM)查询时，该LAD催化结构域的domT评分至少为180。
2.如权利要求1所述的组合物，其中该多肽进一步包含一个或多个溶菌酶增强结构域，其中当使用SEQ ID NO:188至316和hmmbuild软件程序制备的序型隐马尔可夫模型查询时，该溶菌酶增强结构域的domT评分至少为100，并且其中使用hmmscan软件程序执行该查询。
3.如权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:45的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(p)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQ IDNO:45，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(r)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸；以及
(s)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)或(p)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中该LYS多肽包含一个或多个选自由以下组成的组的基序：
(a)基序I：AG[I/L]AT[A/G][I/L][T/V]ES(SEQ ID NO:317)；
(b)基序II V[G/A]XLCQXVQXSAYP(SEQ ID NO:318)；以及
(c)基序III：[CGY][YF][VIL][ASTP][DG]X[YF][VIT]X[TS][GAN](SEQ ID NO:319)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中该多肽获得自或可获得分类学子囊菌门，优选分类学盘菌亚门。
6.一种颗粒，该颗粒包含如权利要求1至5中任一项所述的组合物。
7.如权利要求6所述的颗粒，其中将该颗粒进行包衣。
8.一种动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含如权利要求1至5中任一项所述的组合物或如权利要求6至7中任一项所述的颗粒。
9.一种动物饲料，该动物饲料包含植物基材料和如权利要求1至5中任一项所述的组合物、如权利要求6至7中任一项所述的颗粒或如权利要求8所述的动物饲料添加剂。
10.一种液体配制品，该液体配制品包含如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中将该LYS多肽以0.01％至25％w/w之间的液体配制品给予，优选0.05％至20％w/w的LYS多肽，更优选0.2％至15％w/w的LYS多肽，更优选0.5％至15％w/w的LYS多肽，或最优选1.0％至10％w/w的LYS多肽。
11.如权利要求10所述的液体配制品，其中该配制品进一步包含20％至80％w/w的多元醇。
12.一种改善动物的一个或多个性能参数的方法，该方法包括向一种或多种动物施用如权利要求1至11中任一项所述的组合物。
13.一种制备动物饲料的方法，该方法包括将如权利要求1至11中任一项所述的组合物与植物基材料混合。
14.如权利要求1至11中任一项所述的组合物的用途，该用途：
在动物饲料中；
在动物饲料添加剂中；
在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；
用于改善动物饲料的营养价值；
用于提高动物饲料的消化率；和/或
用于改善动物中的一个或多个性能参数。
15.一种具有溶菌酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少94％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少87％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:18的多肽具有至少81％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:24的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:27的多肽具有至少87％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:30的多肽具有至少96.2％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:33的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:36的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:39的多肽具有至少81％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:42的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(o)SEQ ID NO:3的多肽的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(p)SEQ ID NO:6的多肽的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(q)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:36，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(r)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:42，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(s)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(t)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:39，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(u)SEQ ID NO:30的多肽的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并包含在1、2、3、4、5、6、7或8位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(v)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)或(u)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；
(w)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)或(u)的多肽以及多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端和/或C-末端延伸的多肽；以及
(x)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)或(u)的多肽的片段，该片段具有溶菌酶活性并且具有成熟多肽长度的至少90％。
16.如权利要求15所述的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至316、SEQ IDNO:3的氨基酸1至316、SEQ ID NO:4的氨基酸1至322、SEQ ID NO:6的氨基酸1至318、SEQ IDNO:7的氨基酸1至318、SEQ ID NO:8的氨基酸1至326、SEQ ID NO:10的氨基酸1至316、SEQID NO:11的氨基酸1至316、SEQ ID NO:12的氨基酸1至324、SEQ ID NO:14的氨基酸1至316、SEQ ID NO:15的氨基酸1至316、SEQ ID NO:16的氨基酸1至324、SEQ ID NO:18的氨基酸1至316、SEQ ID NO:19的氨基酸1至316、SEQ ID NO:20的氨基酸1至324、SEQ ID NO:22的氨基酸1至316、SEQ ID NO:23的氨基酸1至316、SEQ ID NO:24的氨基酸1至324、SEQ ID NO:26的氨基酸1至516、SEQ ID NO:27的氨基酸1至516、SEQ ID NO:28的氨基酸1至524、SEQ ID NO:30的氨基酸1至317、SEQ ID NO:31的氨基酸1至317、SEQ ID NO:32的氨基酸1至325、SEQ IDNO:34的氨基酸1至316、SEQ ID NO:35的氨基酸1至316、SEQ ID NO:36的氨基酸1至324、SEQID NO:38的氨基酸1至316、SEQ ID NO:39的氨基酸1至316或SEQ ID NO:40的氨基酸1至324或由其组成。
17.一种编码如权利要求15至16中任一项所述的多肽的多核苷酸。
18.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求17所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
19.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求17所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
20.一种产生如权利要求15至16中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求19所述的重组宿主细胞；和
(b)回收该多肽。
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