CN111607582A - 具提升酶活性的溶菌酶 - Google Patents

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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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Abstract

本案系关于一种具提升酶活性的溶菌酶，其氨基酸序列系为将序列编号2第101个位置的组氨酸突变成精氨酸的序列。

Description

具提升酶活性的溶菌酶
【技术领域】
本案系关于一种溶菌酶，尤指一种具提升酶活性的溶菌酶。
【先前技术】
溶菌酶(Lysozyme,EC 3.2.1.17)是一种作用于微生物细胞壁的水解酶，又称为胞壁质酶。它能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖(peptidoglycan)，其机制主要是透过水解N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)和N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)之间的β-1,4糖苷键，使肽聚糖骨架结构断裂后造成细胞壁破裂，最终导致细菌溶解。溶菌酶广泛存在于自然界中，像是哺乳动物的眼泪、唾液、鼻涕、组织及鸟类和家禽的蛋清中。依其不同来源，溶菌酶可分为六大类：分别为鸡型(C-type)、鹅型(G-type)、无脊椎动物型(I-type)、噬菌体型(Phage-type)、植物型及细菌型。溶菌酶是一种无毒、且对人和哺乳动物无副作用的蛋白质，因其具有溶菌的特性，近年来也已被广泛地应用于不同工业上。它在乳制品工业中可当作天然防腐剂，例如在巴氏杀菌奶添加溶菌酶能有效地延长其保存期。在食品应用上，可延长水产品及肉食品的储存时间。而在动物饲料工业上能提高动物的生产性能。研究结果显示，在仔猪饲料中额外添加溶菌酶可以提高动物对饲料的转换率及降低腹泻率，改善仔猪健康并减少抗生素的使用。
近年来由于全球抗生素药物的滥用，越来越多的细菌发展成抗药性的菌株，许多国家已开始禁止在畜禽饲料中添加抗生素，例如美国FDA在2013年12月发布了<兽医饲料指令>，要求兽医监督抗生素的使用，计划用3年时间禁止在家畜饲料中使用预防性抗生素。因此科学家们正努力寻找能够替代传统抗生素的方案，而使得溶菌酶的研究受到越来越广泛的重视。目前许多研究不论是从大自然中筛选新基因或是改造现有的酶，都企图想要得到能满足各种工业应用的溶菌酶。在许多改造酶的策略中，根据酶蛋白结构分析，进而逻辑性地设计突变点是改造酶的主要方法之一。而在此策略中提升酶蛋白的活性也是改良工业酶的一大重点，酶活性愈高就代表成本的下降以及利润的提高，也较有利于工业应用。
本案即欲藉由逻辑性地设计突变来提升溶菌酶的活性，进而增加其在工业上的应用价值。
【发明内容】
本案之目的在于改造现有溶菌酶，利用结构分析及点突变技术，以有效提升溶菌酶的活性，进而增加溶菌酶的工业应用价值。
为达上述目的，本案之一较广义实施态样为提供一种溶菌酶，其氨基酸序列系为将序列编号2第101个位置或与序列编号2具有80％以上序列相似度的序列中对应位置的组氨酸突变成精氨酸的序列。
在一实施例中，编码该序列编号2的基因系从美洲鸵鸟(Rhea americana)的蛋清中所分离出来的Rham基因。
在一实施例中，该溶菌酶系为一鹅型溶菌酶。
在一实施例中，该溶菌酶的氨基酸序列如序列编号5所示。
本案之另一较广义实施态样为提供一种编码前述溶菌酶之核酸分子。
本案之又一较广义实施态样为提供一种重组质粒，其系包含前述核酸分子。
【图式简单说明】
图1显示溶菌酶Rham的蛋白立体结构图。
图2显示野生型溶菌酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
图3显示点突变技术所采用的引物序列。
图4显示H101R突变型溶菌酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
图5显示野生型及H101R突变型溶菌酶的活性分析。
【实施方式】
体现本案特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本案能够在不同的态样上具有各种的变化，其皆不脱离本案的范围，且其中的说明及图式在本质上系当作说明之用，而非用以限制本案。
本案的溶菌酶基因Rham是从美洲鸵鸟(Rhea americana，又名三趾鸵鸟)的蛋清(egg white)中所分离出来的，其蛋白特性为高耐热性及耐酸性，属于鹅型溶菌酶。近期发现它可以大量地表达在工业上常用的毕赤酵母(Pichia pastoris)中，具有潜在的工业应用价值。为了深入研究以及进一步地改造溶菌酶Rham，本案分析其蛋白结构后针对其活性区域具有关键特性的四十多个氨基酸来做修改。图1显示溶菌酶Rham的蛋白立体结构图。根据蛋白结构重迭比对的结果，Rham蛋白序列第101个位置的组氨酸(H101)位于蛋白立体结构中的活性区内，故被选择作为进行点突变(site-directed mutagenesis)的位置之一，且发现针对H101来进行点突变能提升溶菌酶活性。其它的突变没有增强活性的效果，在此即不再赘述。
以下将详述本案改造溶菌酶之方法及其所得到之改良溶菌酶。
图2显示野生型溶菌酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。如图2所示，野生型溶菌酶Rham基因包含558个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号1标示)，且编码185个氨基酸(氨基酸序列以序列编号2标示)。首先，将Rham基因利用EcoRI以及NotI限制酶切位构筑到pPICZαA载体中，再将该重组质粒转形入一胜任细胞(competent cell)中，形成一野生型表达载体。
为了提高溶菌酶Rham之活性，本案利用点突变技术以野生溶菌酶基因做为模版进行聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)步骤，当中所用的突变引物列于图3，其引物序列以序列编号3标示。原始的模板DNA则利用DpnI移除掉。接着把突变质粒送入大肠杆菌胜任细胞中以抗生素(Zeocin)作初步筛选，并藉由DNA定序步骤确认成功突变基因。在此，本案构筑了一个突变株H101R，其中H101R意指为溶菌酶Rham第101个位置的氨基酸由组氨酸(histidine)突变成精氨酸(arginine)。图4即显示H101R突变型溶菌酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中核苷酸序列以序列编号4标示，氨基酸序列以序列编号5标示。
之后在毕赤酵母中表现溶菌酶重组基因。先将溶菌酶之野生型及突变型的重组基因利用PmeI把DNA质粒进行线性化之后，藉由电转步骤将DNA送入毕赤酵母内。接着将菌液涂于含有100μg/ml Zeocin抗生素的YPD培养基于30℃下进行培养两天。再挑选菌落并接种到5ml YPD于30℃下培养，再次接种到50ml BMGY中于30℃下培养至隔天。接着，将培养基换成含有0.5％甲醇的20ml BMMY来诱导蛋白表达，同样培养于30℃下。每隔24小时取样并补充0.5％甲醇。经过4天的蛋白质诱导表现之后，将菌液以3500rpm离心并收集上清液，进而检测溶菌酶活性。
溶菌酶的活性测试方式是参考先前文献方法再经过修改而成。在本案中是以溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)为底物，并利用浊度法来测定溶菌酶活性。首先将溶壁微球菌粉末以pH 6.2的磷酸二氢钾缓冲液(66mM)配制成一定浓度(A450＝0.6～0.7)，接着取2.5ml配制好的溶壁微球菌底物加入0.1ml适当稀释的溶菌酶蛋白，迅速混合后侦测1分钟内OD450吸光值的变化(25℃)。而1unit的定义为25℃、波长450mm下吸亮度降低0.001为1个酶活力单位。
图5显示野生型及H101R突变型溶菌酶的活性分析。如图5所示，H101R突变型溶菌酶之相对比活性为野生型溶菌酶的150.6％，其活性明显地高于野生型溶菌酶。此外，本案也将野生型及H101R突变型基因进行了50L模拟工业生产的酦酵试验，而在50L酦酵的结果中，H101R突变型蛋白的活性也是明显地高于野生型。
此外，酶在不同物种间通常存在一些变异，但仍具有相同功能，且彼此间大多具有80％以上或90％以上的氨基酸序列相似度，显见要保有酶功能，亦可容许有部分氨基酸序列的变异。换言之，本案改造之溶菌酶序列当不仅限于将序列编号2第101个位置的组氨酸突变成精氨酸的序列，亦可包含将与序列编号2具有80％以上或90％以上序列相似度的序列中对应位置的组氨酸突变成精氨酸的序列。
综上所述，为了增加溶菌酶Rham的活性来提升其工业应用价值，本案根据其结构分析挑选位在活性区附近的第101个位置的组氨酸(histidine)进行改造，利用点突变技术突变为精氨酸(arginine)。根据溶菌酶活性分析结果可知，本案所改造的H101R突变型蛋白的活性明显高于野生型蛋白。因此，本案成功且大大地提升溶菌酶Rham的活性，进而降低其生产成本并增加此溶菌酶的工业应用价值。
纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由熟悉本技艺人士任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附申请专利范围所欲保护者。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 具提升酶活性的溶菌酶
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 558
<212> DNA
<213> 美洲鸵鸟(Rhea americana)
<400> 1
agaactaact gttacggaga tgtttccaga attgatacta ctggagcttc atgtaagact 60
gctaagcctg aaaagttgaa ctactgtgga gttgctgcta gtcgcaagat tgctgaaaga 120
gatttgaggt cgatggatag atacaagact ttgattaaga aggttggtca aaagttgtgt 180
gttgaacctg ctgttattgc tggtattatt tccagagaat cccatgctgg gaaagcgttg 240
aagaacggat ggggcgacaa cggtaacggt tttggtttga tgcaagttga tagacggagc 300
cataagccag ttggtgagtg gaacggtgaa agacatttga ttcaaggtac tgaaattttg 360
atttctatga ttaaggctat gcaaagaaag tttcctagat ggactaagga acaacaattg 420
aagggaggaa tttccgctta caacgctggt ccaggtaacg ttagaactta cgaacgcatg 480
gatattggta ctactcatga tgattacgct aacgatgttg ttgctagagc acaatactac 540
aagcaacatg gttactaa 558
<210> 2
<211> 185
<212> PRT
<213> 美洲鸵鸟(Rhea americana)
<400> 2
Arg Thr Asn Cys Tyr Gly Asp Val Ser Arg Ile Asp Thr Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ser Cys Lys Thr Ala Lys Pro Glu Lys Leu Asn Tyr Cys Gly Val Ala
20 25 30
Ala Ser Arg Lys Ile Ala Glu Arg Asp Leu Arg Ser Met Asp Arg Tyr
35 40 45
Lys Thr Leu Ile Lys Lys Val Gly Gln Lys Leu Cys Val Glu Pro Ala
50 55 60
Val Ile Ala Gly Ile Ile Ser Arg Glu Ser His Ala Gly Lys Ala Leu
65 70 75 80
Lys Asn Gly Trp Gly Asp Asn Gly Asn Gly Phe Gly Leu Met Gln Val
85 90 95
Asp Arg Arg Ser His Lys Pro Val Gly Glu Trp Asn Gly Glu Arg His
100 105 110
Leu Ile Gln Gly Thr Glu Ile Leu Ile Ser Met Ile Lys Ala Met Gln
115 120 125
Arg Lys Phe Pro Arg Trp Thr Lys Glu Gln Gln Leu Lys Gly Gly Ile
130 135 140
Ser Ala Tyr Asn Ala Gly Pro Gly Asn Val Arg Thr Tyr Glu Arg Met
145 150 155 160
Asp Ile Gly Thr Thr His Asp Asp Tyr Ala Asn Asp Val Val Ala Arg
165 170 175
Ala Gln Tyr Tyr Lys Gln His Gly Tyr
180 185
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成引物
<400> 3
gttgatagac ggagcagaaa gccagttggt gagtg 35
<210> 4
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变体
<400> 4
agaactaact gttacggaga tgtttccaga attgatacta ctggagcttc atgtaagact 60
gctaagcctg aaaagttgaa ctactgtgga gttgctgcta gtcgcaagat tgctgaaaga 120
gatttgaggt cgatggatag atacaagact ttgattaaga aggttggtca aaagttgtgt 180
gttgaacctg ctgttattgc tggtattatt tccagagaat cccatgctgg gaaagcgttg 240
aagaacggat ggggcgacaa cggtaacggt tttggtttga tgcaagttga tagacggagc 300
agaaagccag ttggtgagtg gaacggtgaa agacatttga ttcaaggtac tgaaattttg 360
atttctatga ttaaggctat gcaaagaaag tttcctagat ggactaagga acaacaattg 420
aagggaggaa tttccgctta caacgctggt ccaggtaacg ttagaactta cgaacgcatg 480
gatattggta ctactcatga tgattacgct aacgatgttg ttgctagagc acaatactac 540
aagcaacatg gttactaa 558
<210> 5
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变体
<400> 5
Arg Thr Asn Cys Tyr Gly Asp Val Ser Arg Ile Asp Thr Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ser Cys Lys Thr Ala Lys Pro Glu Lys Leu Asn Tyr Cys Gly Val Ala
20 25 30
Ala Ser Arg Lys Ile Ala Glu Arg Asp Leu Arg Ser Met Asp Arg Tyr
35 40 45
Lys Thr Leu Ile Lys Lys Val Gly Gln Lys Leu Cys Val Glu Pro Ala
50 55 60
Val Ile Ala Gly Ile Ile Ser Arg Glu Ser His Ala Gly Lys Ala Leu
65 70 75 80
Lys Asn Gly Trp Gly Asp Asn Gly Asn Gly Phe Gly Leu Met Gln Val
85 90 95
Asp Arg Arg Ser Arg Lys Pro Val Gly Glu Trp Asn Gly Glu Arg His
100 105 110
Leu Ile Gln Gly Thr Glu Ile Leu Ile Ser Met Ile Lys Ala Met Gln
115 120 125
Arg Lys Phe Pro Arg Trp Thr Lys Glu Gln Gln Leu Lys Gly Gly Ile
130 135 140
Ser Ala Tyr Asn Ala Gly Pro Gly Asn Val Arg Thr Tyr Glu Arg Met
145 150 155 160
Asp Ile Gly Thr Thr His Asp Asp Tyr Ala Asn Asp Val Val Ala Arg
165 170 175
Ala Gln Tyr Tyr Lys Gln His Gly Tyr
180 185

Claims (6)

1.一种溶菌酶，其氨基酸序列系为将序列编号2第101个位置或与序列编号2具有80％以上序列相似度的序列中对应位置的组氨酸突变成精氨酸的序列。
2.如权利要求1所述之溶菌酶，其中编码该序列编号2的基因系从美洲鸵鸟(Rheaamericana)的蛋清中所分离出来的Rham基因。
3.如权利要求1所述之溶菌酶，其中该溶菌酶系为一鹅型溶菌酶。
4.如权利要求1所述之溶菌酶，其中该溶菌酶的氨基酸序列如序列编号5所示。
5.一种编码如权利要求1所述之溶菌酶之核酸分子。
6.一种重组质粒，其系包含如权利要求5所述之核酸分子。
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