CN101429518A - 耐高温木糖苷酶XynB2和编码该酶的基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了由嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80－2基因组DNA借助PCR扩增而得到的木糖苷酶XynB2构建表达载体在大肠杆菌中表达出该基因编码的重组木糖苷酶。该酶的最适反应温度为65℃，最适反应pH为6.0，在偏酸性环境中热稳定性好。适合分解寡聚木聚糖产生木糖。

Description

耐高温木糖苷酶XynB2和编码该酶的基因与应用

技术领域

本发明涉及一种木糖苷酶，特别涉及在嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2中对木糖苷酶XynB2基因进行克隆表达、功能鉴定以及构建大肠杆菌高效表达的耐高温木糖苷酶和编码该酶的基因与应用。

背景技术

随着当今社会的飞速发展，人口增长和资源消耗使得可再生资源的开发与利用成为国际社会和学术界共同关注的问题。木聚糖是半纤维素的主要组成成份，广泛分布于高等植物的细胞壁中，是自然界中一种巨大的可再生生物资源，也是最容易提取、降解和利用的一类半纤维素。木聚糖酶和β-木糖苷酶是降解木聚糖最主要的酶。在能源工业中，工农业废弃物中的木聚糖可被木聚糖酶和木糖苷酶转化为木糖，而木糖又可被细菌及真菌转化成酒精等有价值的燃料；在造纸工业的纸浆漂白中，β-木糖苷酶与木聚糖酶协同作用可以有效提高漂白性能；在医药行业中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可产生在医药行业具有重要应用价值的中间转化产物。因此对于木聚糖酶和木糖苷酶的研究具有广泛而重要的用途。

半纤维素是仅次于纤维素含量第二丰富的可利用自然资源，半纤维素中的木聚糖(xylan)根据来源不同，分枝程度不同，其主链和支链带有多种不同的取代基团。由于木聚糖结构的复杂性，它的完全降解需要多种水解酶的参与共同作用完成。其中的β-1，4-内切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶中最关键的酶。该酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，使木聚糖降解为短链的寡聚木聚糖，并有少量木糖生成；而β-D-木糖苷酶(β-xylosidase，EC.3.2.1.37.)则作用于短链的寡聚木聚糖，通过催化寡聚木聚糖的末端来释放木糖残基。

β-木糖苷酶可与木聚糖酶协同作用，将木聚糖彻底分解，是木聚糖降解的关键酶之一。β-木糖苷酶在自然界中分布非常广泛，现已从细菌、放线菌和真菌(包括酵母)等微生物和高等植物中分离得到。β-木糖苷酶是一种外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的寡聚木聚糖，水解产物为木糖。木聚糖类半纤维素酶解时一般由木聚糖酶从主链内部先作用于长链木聚糖的糖苷键上，将木聚糖随机切成不同链长的寡聚木聚糖，再由β-木糖苷酶作用于寡聚木聚糖的末端，将这些短链寡聚木聚糖降解成木糖。

在木糖苷酶研究方面，涉及的嗜热菌种有：苍白芽孢杆菌(Geobacillus pallidus)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus P2)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermantarcticus)、嗜盐古细菌(Halorhabdus utahensis)、黑曲霉(Aspergillus niger 90196)、高温厌氧芽孢杆菌(Thermoanaerobacterium sp.strain JW/SL YS485)、聚多曲霉(Aspergillussydowii MG49)、嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum B6A-RI)、嗜热厌氧产乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、极端嗜热厌氧菌(Caldocellum saccharolyticum Tp8T6.3.3.1)。

关于木糖苷酶基因最新的专利报道。如江正强等人报道了嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18木糖苷酶及其基因(第200710063139.0号，申请日期2007.01.29)；伦德特·亨德里克·德格拉夫等人报道了黑曲霉木糖苷酶及其基因(第96194959.7号，申请日期1996.06.24)。尽管关于木糖苷酶基因的专利报道有多篇，但从嗜热脱氮芽孢杆菌中获得热稳定性木糖苷酶及其编码的基因尚未见文献报道。

本发明人首次公开了在嗜热石油降解细菌中，采用嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2对木糖苷酶基因进行克隆表达、功能鉴定以及构建大肠杆菌高效表达工程菌株。通过氨基酸序列比对和分析，证明本发明的木糖苷酶XynB2基因编码的蛋白与已知的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)T6中的编码木糖苷酶的基因(GenBank accession no.ABI49956)相似性最高(氨基酸序列一致性为92％)，与其它已知的木糖苷酶相似性小于74％。该酶属于GH52族。本发明木糖苷酶XynB2的氨基酸序列第2位是脯氨酸，第3位、270位、591位、604位是天冬酰胺，第18位、53位、65位、290位是丝氨酸，第50位、369位、406位、418位、647位是亮氨酸，第58位、191位、194位、233位、254位是缬氨酸，第62位是色氨酸，第95位、117位、385位、598位是谷氨酸，第97位、216位、601位是谷氨酰胺，第101位、243位、410位、527位、646位是组氨酸，第114位是苯丙氨酸，第130位、261位是苏氨酸，第131位、200位、555位是天冬氨酸，第157位、455位、605位、688位是丙氨酸，第183位是半胱氨酸，第282位、452位、592位、687位是赖氨酸，第379位、539位是甘氨酸，第478位是异亮氨酸，第552位是酪氨酸，第608位是精氨酸，这与Geobacillus stearothermophilus T6编码的木糖苷酶的氨基酸序列不同(见图11)，因此表现出更好的热稳定性。因此对这个XynB2基因进行了进一步功能鉴定，并与Geobacillus stearothermophilus T-6中的木糖苷酶活性进行了比较，实验结果表明：本发明的木糖苷酶XynB2是一种新型的酶，这种酶不但耐高温，而且热稳定性优良，从而完成了本发明的工作。

发明内容

本发明一个目的是公开了一种耐高温重组木糖苷酶XynB2。

本发明另一目的是公开了编码本发明木糖苷酶XynB2的基因。

本发明再一目的是公开了表达木糖苷酶的重组质粒，其中至少包括上述的木糖苷酶XynB2的编码基因。

本发明还一目的是公开了一种导入了上述的木糖苷酶XynB2编码基因，产生木糖苷酶的重组菌，例如含有重组质粒的重组菌株H1860。

本发明的技术方案如下：

一种编码木糖苷酶XynB2的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在严格杂交条件下与所述的a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的木糖苷酶核苷酸序列。

应当指出的是，上述提到的术语“严格条件”在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格条件可以是，相互之间的同源性不小于70％的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90％的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件：将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％SDS)中，50℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％ SDS，同位素标记的核苷酸片段)，50℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(2×SSC和0.1％ SDS)，50℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(0.5×SSC和0.1％ SDS)，50℃洗膜30min。

本发明进一步公开了一种木糖苷酶XynB2，该酶具有核苷酸序列编码的氨基酸序列。或者最好具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或上述中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后、并且具有所述木糖苷酶活性的氨基酸序列。

本发明再进一步公开了一种重组表达质粒及重组菌，它含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因。所述的重组质粒的载体为pET-28a(+)，重组质粒为pLW1466。含有重组质粒的重组菌株H1860，这些均属于本发明的保护范围。

扩增木糖苷酶XynB2中任意片段的引物对，也在本发明的保护范围之内。

本发明的较佳实施例中，上述木糖苷酶XynB2的底物为对硝基苯酚木糖苷；

本发明的较佳实施例中，上述木糖苷酶的反应温度为25℃-100℃，优选65℃。

本发明的较佳实施例中，上述木糖苷酶反应pH值为3.0-11.0，优选最适反应pH值为6.0。

本发明提供的表达木糖苷酶的重组质粒为pLW1466，至少包括上述的木糖苷酶XynB2的编码基因。

本发明的较佳实施例中，上述的重组质粒的载体为pET-28a(+)。

本发明的较佳实施例中，木糖苷酶的重组菌内导入了木糖苷酶XynB2的编码基因。

所述的重组菌为大肠杆菌。优选为大肠杆菌BL21菌株。

所属技术领域的技术人员应该知道，本发明编码木糖苷酶的DNA序列，还包括编码对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。

另外，对本发明的木糖苷酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质，也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有木糖苷酶活性的蛋白质。上面使用的术语“多个”可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。

本发明所述的XynB2基因，它是以从嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2中分离的木糖苷酶XynB2(GTNG_1775基因编码)基因组DNA为模板，根据XynB2基因全序列，设计两对引物，有效地扩增出了XynB2基因片段并进行拓扑、克隆和DNA序列测定，进一步实验显示：木糖苷酶XynB2将寡聚木聚糖彻底降解为木糖(如图1)。

本发明提出的XynB2和已知的木糖苷酶相比，本发明提出的XynB2木糖苷酶属于新型酶，不但耐高温，而且热稳定性优良。目前已公开发表的文章介绍木糖苷酶热稳定性较长的有：嗜热革节孢菌(Scytalidium thermophilum)中的木糖苷酶在60℃中能保存1小时(Zanoelo，F.F.，et al，Purification and biochemical properties of athermostable xylose-tolerant β-D-xylosidase from Scytalidium thermophilum，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2004.31：170-176)；极端嗜热海栖热袍菌(Thermotoga maritima)中的木糖苷酶在85℃中能保存2小时，95℃中能保存22分钟(Xue，Y.，et al，Expression and characterization of a thermostableβ-xylosidase from the hyperthermophile，Thermotoga maritima，Biotechnol.Lett.2004.26：1511-1515)；嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermantarcticus)中的木糖苷酶在60℃中能保存1小时(Lama，L.，et al，Purification and characterization ofthermostable xylanase and β-xylosidase by the thermophilic bacterium Bacillusthermantarcticus，Res.Microbiol.2004 May.155(4)：283-9)；聚多曲霉(Aspergillus sydowii)MG49中的木糖苷酶在85℃中能保存18.5分钟(Ghosh，M.，etal，A rejoinder to the commentary on’Thermostability of β-xylosidase fromAspergillus sydowii MG49’，FEBS Lett.1993.330：275-278)；极端嗜热菌(Thermotogasp.)FjSS3-B.1中的木糖苷酶在98℃中的半衰期为7小时(Ruttersmith，L.D.，et al，Thermostable β-glucosidase and β-xylosidase from Thermotoga sp.strainFjSS3-B.1，Biochim.Biophys.Acta.1993.1156：167-72)；嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)21中的木糖苷酶在60℃中能保存1小时(Nanmori，T.，et al，Purification and properties of thermostable xylanase andβ-xylosidase produced by a newly isolated Bacillus stearothermophilus Strain，J.Bacteriol.1990.172：6669-6672)。

本发明的木糖苷酶XynB2与现有技术相比的有益效果在于：与已知的木糖苷酶相比该酶的热稳定性高，且在65℃下孵育100小时、75℃下孵育45小时、85℃下孵育2小时后仍具有50％左右的酶活性。

本发明的木糖苷酶性能不同于已报道的木糖苷酶，该木糖苷酶XynB2具有在高温下保持高活性的特征。木糖苷酶XynB2最适反应温度为65℃；最适反应pH6.0。在偏酸性中热稳定性好。适合分解低聚木糖产生木糖。

附图说明

图1是本发明的木糖苷酶降解寡聚木聚糖作用示意图；

图2为本发明实施例中的木糖苷酶基因重组质粒的构建模式图

图3表示本发明木糖苷酶SDS-PAGE电泳图。

图4表示本发明木糖苷酶在不同温度下的相对活力。

图5表示本发明木糖苷酶在不同pH值下的相对活力。

图6表示本发明木糖苷酶的在65℃下的热稳定性。

图7表示本发明木糖苷酶的在75℃下的热稳定性。

图8表示本发明木糖苷酶的在85℃下的热稳定性。

图9表示本发明木糖苷酶SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

图10表示本发明木糖苷酶SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

图11表示本发明木糖苷酶XynB2与Geobacillus stearothermophilus T6中的木糖苷酶氨基酸序列的比较。

具体实施方式

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明。下面的具体实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。

实施例一

1.嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(CGMCC No.1228)总DNA的提取

嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(CGMCC No.1228)总DNA的提取研究证明：由嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2基因组能够分离出编码醇脱氢酶的基因。因此，在本实施例中，采用从中国天津大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.1228，保藏日期为2004年10月09日，已申请国内发明专利并获得授权，发明名称：嗜热脱氮芽孢杆菌及其筛选和应用，专利号：ZL200410072759.7)，取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于250μl50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，加入10μl 0.4M EDTA(pH8.0)，混匀后37℃保温20min，之后加入30μl 20mg/ml溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5μl 20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20μl 10％ SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚：氯仿:异戊醇抽提两次，氯仿:异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，沉淀溶于100μl TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase 2μl，65℃保温30min，分别用酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50μl TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.95，A260＝0.73。

2.木糖苷酶基因XynB2的克隆和筛选

取嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(CGMCC No.1228)总DNA溶液0.5μl(约10ng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增。

反应混合物(50ul)如下：

dd H₂O，34ul；10×PCR Buffer，5ul；MgCl₂ Buffer，5ul；dNTP Mix，2ul；上游引物，1ul；下游引物，1ul；NG80-2基因组DNA，1ul；Taq DNA polymerase，1ul。

引物序列如下：

上游引物为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，下游引物为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列

设定的PCR循环参数如下：

95℃，5min；95℃，30s；50℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr。按上述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

上述PCR产物用EcoRI和XhoI双酶切，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片断。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α后，涂于含50μg/ml Kan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37℃培养12小时，挑取单克隆转接到20ml LB培养基中进行培养(50μg/ml Kan)，37℃培养12小时后，提取质粒鉴定，插入有SEQ ID NO：1的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1466(见图2)，将重组质粒pLW1466转入表达宿主大肠杆菌BL21(该菌株可向天津开发区厚普生物技术开发有限公司订购，货号为69387-3)中，得到含有该重组质粒的重组菌株为H1860，此重组质粒pLW1466可高频转化大肠杆菌BL21表达木糖苷酶活性和抗卡那霉素性能。

其中的酶切及连接反应均参照表1。

表1 酶切体系及连接体系

3.XynB2 DNA片段的测定

采用Sanger法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示pLW1466中的插入片段含有长2118bp(SEQ ID NO：1)的开放阅读框架，编码由705(SEQ ID NO：2)个氨基酸组成的蛋白质。

实施例二

重组木糖苷酶的表达纯化和特性：

将上述重组菌H1860单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃，180rpm培养12小时，然后将培养物按1％(v/v)接种量接入200ml含50μg/ml Kan的LB培养基，37℃，220rpm培养至OD600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，在37℃、180rpm诱导3小时。5000rpm离心5min收集菌体，悬于含50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，14000g离心20min，上清液为醇脱氢酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带(见图3)。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此酶系的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量分别为80kDa，与理论上推算的分子量(79876Da)相似；等电点沉淀法测得的重组酶的等电点pI为4.98。

实施例三

1.测定本发明木糖苷酶在不同温度下的比活力：

对上述实施例二中制得的木糖苷酶进行最适反应温度的测定，具体方法为：配制木糖苷酶XynB2反应体系(100μl)为：加入底物对硝基苯酚木糖苷至终浓度10mM，一定浓度的木糖苷酶XynB2，用50mM pH6.0的citrate-sodium citrate缓冲液补至100μl。混匀，分别于25~100℃水浴中反应20分钟，反应结束后，加入400ul 1M的Na₂CO₃终止反应，然后在405nm处测定光吸收。以对硝基苯酚为标准曲线，计算每分钟生成1μmol对硝基苯酚所需酶量，定义为1个酶活力单位。测定结果参见图4。从该图中可以看出，木糖苷酶的最适反应温度约为65℃。

2.测定本发明木糖苷酶在不同pH下的比活力：

对上述实施例二中制得的木糖苷酶进行最适反应pH值的测定，具体方法为：配制木糖苷酶XynB2反应体系(100μl)为：加入底物对硝基苯酚木糖苷至终浓度10mM，一定浓度的木糖苷酶XynB2，分别用50mM pH3-11.9的缓冲液(配方见表2)补至100μl。混匀，在65℃水浴中反应20分钟，反应结束后，加入400ul 1M的Na₂CO₃终止反应，然后在405nm处测定光吸收。以对硝基苯酚为标准曲线，计算每分钟生成1μmol对硝基苯酚所需酶量，定义为1个酶活力单位。测定结果参见图5，从该图中可以看出，木糖苷酶的pH值为3.0-11.0，优选最适反应pH值为6.0。

表2 木糖苷酶活测定中所用的缓冲液

 

pH范围	缓冲液
		pH3-6	citrate-sodium citrate
pH6-8	K2HPO4-KH2PO4
		pH8-9	Tris-HCl
pH8.6-10.6	glycine-NaOH
		pH11-11.9	Na2HPO4-NaOH

3.测定本发明木糖苷酶的热稳定性：

对上述实施例二中制得的木糖苷酶进行热稳定性的测定，具体方法为：将一定浓度的木糖苷酶XynB2放入65、75和85℃水浴中温浴，每隔一小时取出一部分酶做酶活反应。

配制木糖苷酶XynB2反应体系(100μl)为：加入底物对硝基苯酚木糖苷至终浓度10mM，一定浓度的木糖苷酶XynB2，用50mM pH6.0的citrate-sodium citrate缓冲液补至100μl。混匀，在60℃水浴中反应20分钟，反应结束后，加入400ul 1M的Na₂CO₃终止反应，然后在405nm处测定光吸收。以对硝基苯酚为标准曲线，计算每分钟生成1μmol对硝基苯酚所需酶量，定义为1个酶活力单位。测定结果参见图6、7、8。从图中可以看出，木糖苷酶XynB2在65℃下孵育100小时、75℃下孵育45小时、85℃下孵育2小时仍保持约50％的酶活性。

实施例四

1.将本发明木糖苷酶XynB2的氨基酸序列与Geobacillus stearothermophilus T6木糖苷酶的氨基酸序列进行比对，比对结果参见图11。

2.本发明木糖苷酶XynB2与Geobacillus stearothermophilus T6中的木糖苷酶各项酶学参数均有不同，详见表3。

表3 XynB2与Geobacillus stearothermophilus T6中的木糖苷酶酶学参数的比较

                             NG80-2                           T6

最适反应温度(℃)             65                               65

最适反应pH                   6.0                              5.6-6.3

热稳定性           5℃孵育100小时、75℃孵育45小时、           未鉴定

                   85℃孵育2小时后仍有50％的酶活性

比活力(U/mg)                 667                                5.3

从图11和表3可以看出，由于氨基酸的变化，NG80-2中的木糖苷酶XynB2具有比Geobacillus stearothermophilus T6中的木糖苷酶活性更高，更具热稳定性。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围所做的更动与改进，都将落入本发明的保护范围。

序列表

<110>南开大学

<120>耐高温木糖苷酶XynB2和编码该酶的基因与应用

<160>4

<210>1

<211>2118

<212>DNA

<213>嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2118)

<400>1

<210>2

<211>705bp

<212>PRT

<213>嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2

<220>

<221>CHAIN

<222>(1)..(705)

<400>2

<210>3

<211>32bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>32bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

Claims (9)

1、一种编码木糖苷酶XynB2的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

b)不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或

c)在严格杂交条件下与所述的a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的木糖苷酶核苷酸序列。

2、一种木糖苷酶XynB2，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

3、一种重组表达质粒，它含有权利要求1所述的木糖苷酶XynB2编码基因。

4、权利要求3所述的重组表达质粒，所述的重组质粒的载体为pET-28a(+)。

5、权利要求1所述的木糖苷酶XynB2编码基因，其特征在于所述的木糖苷酶于嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2中分离得到。

6、权利要求1所述的木糖苷酶XynB2编码基因，其特征在于所述的木糖苷酶的底物为对硝基苯酚木糖苷；最适反应温度均为65℃。

7、权利要求1所述的木糖苷酶XynB2编码基因，其特征在于所述的木糖苷酶pH值为6.0

8、一种产生木糖苷酶的重组菌，其特征在于它含有权利要求1所述的木糖苷酶XynB2编码基因。

9、权利要求8所述木糖苷酶XynB2的重组菌，其特征在于所述的重组菌为大肠杆菌BL21菌株。

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