CN101397566A - 超氧化物歧化酶及其编码基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种超氧化物歧化酶及其编码基因，该超氧化物歧化酶的最适温度约为70℃，分子量约为51770道尔顿，在25℃至80℃之间可有效催化超氧阴离子自由基(O2·－)发生歧化反应生成O2和H2O2。该酶可以作为添加剂和重要的功能性基料在食品和化妆品行业中具有广泛的应用，并且可作为医药原料在抗炎、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老及自身免疫性疾病等由超氧阴离子自由基引发的疾病治疗方面具有很高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶及其编码基因与应用，特别涉及一种超氧化物歧化酶及其编码基因。
背景技术
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)，是唯一能够特异性清除自由基O2-的抗氧化金属酶，是生物体防御氧毒性的关键。该酶广泛存在于自然界的生物体内，自1969年从牛红细胞发现并正式命名以来，科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。由于SOD的特殊功效，其在医药、日用化工和食品诸领域具有广泛的应用价值。目前，SOD临床应用主要集中在抗炎症方面(以类风湿以及放射治疗后引起的炎症病人为主)，此外对某些自身免疫性疾病(如红斑狼疮、皮肌炎)、肺气肿、抗癌和氧中毒等都有一定疗效；在食品工业主要用作食品添加剂和重要的功能性基料。
基于金属辅基不同，该酶可分为CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型。Mn-SOD与Fe-SOD主要存在于原核生物中，二者序列及结构同源性很高，进化上相近；而Cu/Zn-SOD存在于真核生物中，属于进化上的另一个分支。目前已开发的SOD产品绝大部分都是Cu/Zn-SOD，最早是从动物的血、肝中分离提取的，近年来植物来源的SOD也有了大量相关报道。微生物来源的SOD，尤其嗜热菌中分离的SOD由于具有耐高温、稳定性好的特点，使其在化工应用中比常温酶具有更好的适用性，而越来越受到更多关注。目前，已有一些嗜热SOD基因相继被识别。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基因，能编码一种超氧化物歧化酶。
本发明的另一目的是提供一种超氧化物歧化酶，其可在高温条件下，催化超氧阴离子自由基(O2·-)发生歧化反应生成氧气O2和双氧水H2O2。
本发明的另一目的是提供一种能表达上述超氧化物歧化酶的重组质粒。
本发明的再一目的是提供一种能产生上述超氧化物歧化酶的重组菌。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提出一种编码超氧化物歧化酶的基因，所述基因具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
b)不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；
c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的超氧化物歧化酶的核苷酸序列。
本发明还提供一种超氧化物歧化酶，其具有选自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列：
d)权利要求1中a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
f)所述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有超氧化物歧化酶的活性。
上述一种超氧化物歧化酶，其具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少70％的同源性，同时具有该序列的蛋白质有超氧化物歧化酶的活性。
上述一种超氧化物歧化酶，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中缺失、替换、或插入的多个氨基酸序列为2-100个。
上述一种超氧化物歧化酶，其具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少90％的同源性，同时具有该序列的蛋白质有超氧化物歧化酶的活性。
上述一种超氧化物歧化酶，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中缺失、替换、或插入的多个氨基酸序列为2-10个。
上述的超氧化物歧化酶，保持所述超氧化物歧化酶活性的温度为70℃。
一种表达上述的超氧化物歧化酶的重组质粒，该质粒至少包括权利要求1所述的基因。
上述表达超氧化物歧化酶的重组质粒的载体为pET-28a(+)。
一种产生上述的超氧化物歧化酶的重组菌，该重组菌导入了超氧化物歧化酶。
上述产生超氧化物歧化酶的重组菌为大肠杆菌。
上述产生超氧化物歧化酶的重组菌的大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。
上述的超氧化物歧化酶应用于催化超氧阴离子自由基，发生歧化反应生成氧气和双氧水。
上述的超氧化物歧化酶应用于该酶用于医药、卫生保健、食品或化妆品加工。
应当指出的是，上述提到的术语“严格杂交条件”在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格杂交条件可以是，相互之间的同源性不小于70％的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90％的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件：将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％SDS)中，50℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，50℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(2×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(0.5×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜30min。
所属技术领域的技术人员应该知道，本发明的编码超氧化物歧化酶的DNA序列，还包括编码对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
另外，对本发明的超氧化物歧化酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有超氧化物歧化酶活性的蛋白质。上面使用的术语“多个”可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。
本发明提出的上述超氧化物歧化酶的性能不同于已知的超氧化物歧化酶，比目前已经公布的超氧化物歧化酶(200aa左右)大一倍左右，为469aa，最适温度约为70℃，分子量约为51770道尔顿，可有效催化超氧阴离子自由基(O2·-)发生歧化反应生成氧气O2和双氧水H2O2。
基于本发明的超氧化物歧化酶的上述特性和功能，该酶具有抗氧化、抗衰老作用，并且具有高温稳定性。可广泛用于医药、卫生保健、食品和化妆品加工等领域。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1超氧化物歧化酶基因重组质粒pLW1296的构建模式图；
图2为温度对重组超氧化物歧化酶活性影响的曲线图；
图3为纯化的超氧化物歧化酶SDS—PAGE电泳照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例一
1.嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2(CGMCC No.1228)总DNA的提取
在本实施例中，采用从中国天津大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2(Geobacillus thermodenitrificans该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1228)，取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于250μl 50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，加入10μl 0.4M EDTA(pH8.0)，混匀后37℃保温20min，之后加入30μl 20mg/ml溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5μl 20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20μl10％SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，氯仿∶异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，沉淀溶于100μl TE缓冲液(pH8.0，10mMTris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase 2μl，65℃保温30min，分别用酚∶氯仿∶异戊醇、氯仿∶异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50μl TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.95，A260＝0.73。
2.超氧化物歧化酶基因的克隆和筛选
取前面所述的总DNA溶液0.5μl(约10ng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。
设定的PCR循环参数如下：
95℃，3min；95℃，30s；50℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr
上游引物：5’-ggaattccatatggacgaccaaacgttgtttgc-3’
下游引物：5’-cccaagcttttaaaatggttgccaacgca-3’
上述PCR产物用NdeI和HindIII双酶切，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收1.35kb酶切产物片段。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于含50μg/ml Kan(卡拉霉素)的LB固体培养基上。37℃培养16～18小时，挑取单克隆菌落鉴定，插入有SEQ ID NO：1的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1296，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为H1565。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示，该基因DNA片段全长1410bp，由ATG起始密码开始，到TAA终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该完整的ORF编码一个由469个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质属于超氧化物歧化酶家族，最高相似性同GeobacillusKaustophilus HTA426的超氧化物歧化酶基因，同源性为70％。将重组质粒pLW1296转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21为H1566。
实施例二 重组超氧化物歧化酶的纯化和特性
将上述重组菌E.Coli BL21 H1566单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入200ml含50μg/ml Kan的LB培养基(共2个摇瓶)，37℃，220rpm/min培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，37℃，180rpm/min诱导3小时。离心收集菌体，悬于50mMTris-Cl(pH8.0)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组超氧化物歧化酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组超氧化物歧化酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量约为52000道尔顿，与理论上推算的分子量(51770道尔顿)相似。
实施例三 重组超氧化物歧化酶活性测定
在0.5ml离心管中装入200ul下列反应体系：1×10-5M Cytochrome C，5×10-5M Xanthine，1×10-4M EDTA，0.05M pH7.8 Potassium phosphateBuffer，6×10-9M Xanthine Oxidase，迅速反应在2min内有效，测定A550处光吸收变化为0.025/min；1×10-5M Cytochrome C，5×10-5M Xanthine，1×10-4M EDTA，0.05M pH7.8 Potassium phosphate Buffer，6×10-9M XanthineOxidase，加入适量实施例二中制得的重组超氧化物歧化酶制剂，使得A550处光吸收变化为0.0125/min时所用的酶量为1U。
最适酶活性温度
上述反应条件下，实施例二中制得的重组超氧化物歧化酶制剂在25-80℃范围内水浴加热处理5min后测定超氧化物歧化酶活性，结果表明保持超氧化物歧化酶活性的最适温度约为70℃(见图2)。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>超氧化物歧化酶及其编码基因
<130>7P13011-CN
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1350
<212>DNA
<213>编码超氧化物歧化酶的DNA序列
<400>1
<210>2
<211>449
<212>PRT
<213>编码超氧化物歧化酶的氨基酸序列
<400>2
Claims (14)
1、一种编码超氧化物歧化酶的基因，其特征在于，所述基因具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
b)不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；
c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的超氧化物歧化酶的核苷酸序列。
2、一种超氧化物歧化酶，其特征在于，其具有选自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列：
d)权利要求1中a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
f)所述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有超氧化物歧化酶的活性。
3、根据权利要求2所述的一种超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少70％的同源性，同时具有该序列的蛋白质有超氧化物歧化酶的活性。
4、根据权利要求2所述的一种超氧化物歧化酶，其特征在于，所述具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中缺失、替换、或插入的多个氨基酸序列为2-100个。
5、根据权利要求3所述的一种超氧化物歧化酶，其特征在于，所述超氧化物歧化酶具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少90％的同源性，同时具有该序列的蛋白质有超氧化物歧化酶的活性。
6、根据权利要求4所述的一种超氧化物歧化酶，其特征在于，所述具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中缺失、替换、或插入的多个氨基酸序列为2-10个。
7、根据利要求2至6中任一项所述的超氧化物歧化酶，其特征在于，保持所述超氧化物歧化酶活性的温度为70℃。
8、一种表达权利要求2至6中任一项所述的超氧化物歧化酶的重组质粒，其特征在于，所述质粒至少包括权利要求1所述的基因。
9、根据权利要求8所述的表达超氧化物歧化酶的重组质粒，其特征在于，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。
10、一种产生权利要求2至6中任一项所述的超氧化物歧化酶的重组菌，其特征在于，所述的重组菌导入了超氧化物歧化酶。
11、根据权利要求10所述的产生超氧化物歧化酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌为大肠杆菌。
12、根据权利要求11所述的产生超氧化物歧化酶的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。
13、权利要求2至6任一项所述的嗜热超氧化物歧化酶的应用，其特征在于，该酶用于催化超氧阴离子自由基，发生歧化反应生成氧气和双氧水。
14、权利要求2至6任一项所述的嗜热超氧化物歧化酶的应用，其特征在于，该酶用于医药、卫生保健、食品或化妆品加工。
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