CN104651327A - 一种耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶sod19及其编码基因和应用 - Google Patents

一种耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶sod19及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19及其编码基因和应用。本发明的耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该超氧化物歧化酶SOD19的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的超氧化物歧化酶SOD19具有较好的稳定性，100℃处理1h还有约50％的酶活。该超氧化物歧化酶在食品、生物医药和化妆品中具有非常大应用价值。

Description

一种耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19及其编码基因和应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克隆自深海细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.SCSIO 15121)的耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19及其编码基因和应用。
背景技术：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1)主要生理作用是清除体内氧自由基，氧自由基在生物体内的过度积累会导致衰老、细胞凋亡等过程，因而，SOD酶被广泛应用在生物医药、化妆品、食品和农业等领域。例如，研究表明服用SOD药物能够预防和治疗癌症，SOD药物对于食道癌、直肠癌和乳腺癌等均有较好疗效，因此，SOD在生物医疗领域有着巨大的应用价值。
再如，在化妆品中添加SOD的主要作用是利用SOD来清除自由基，人们在长期的强光、缺氧等环境下能产生对皮肤造成损害的活性氧。活性氧不能及时清除会导致衰老，衰老过程和SOD表达量的减少密切相关。另外，皮肤中的SOD表达量也会随着年龄的增长而减少，SOD可以通过皮肤吸收并解决诸多皮肤问题，因此SOD深受女性的喜爱。
另外，SOD在食品中也有较大的应用价值，一些SOD通过口服也是有效的，因此通过食物补充SOD也是可行的。SOD酸奶、SOD啤酒、水果和大米等食品不断被开发。
随着SOD应用范围的扩大，SOD的需求越来越大。开发高品质的SOD酶，尤其是热温度的SOD，就显得十分迫切。比如食品加工过程大多涉及到加热提取，灭菌等过程，常温SOD酶很难满足应用。现阶段SOD的来源主要有：第一，从动物或其组织中直接提取；第二，从微生物或其它生物中提取；第三，利用生物工程的方法发酵获得。第一种方法获得的SOD存在艾滋病等血液病毒交叉感染的潜在危险，第二种方法受原材料制约，只有第三种方法技术简单、效率高、成本低，符合工业生产的需要。
超氧化物歧化酶是一类金属酶，需要结合金属离子才能催化清除氧自由基的过程，根据金属离子辅基的不同，可以将SOD分为三大类：Cu/Zn SOD，Fe或Mn-SOD以及Ni-SOD。SOD酶稳定性和酶活较高的多集中在SODA家族的Fe和Mn-SOD。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19及其编码基因。
本发明的耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。
本发明的编码耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19的基因，其特征在于，编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19。
所述的编码耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19的基因，优选，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的第二个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因在编码耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种表达载体，其特征在于，含有上述编码耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19的基因。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述表达载体的微生物。
本发明的第四个目的是提供耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19的诱导表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
将转有编码耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19基因的微生物在培养基中培养至OD600为0.5-0.6，加IPTG至浓度为0.2mM，再加MnCl2至浓度为0.1mM，18℃培养16个小时，即可高效诱导表达耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19。
本发明的第五个目的是提供耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19在制备生物医药、化妆品和食品中的应用。
本发明的耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶基因sod19来自深海样品中筛选得到的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.SCSIO15121)。本发明对枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.SCSIO15121)进行基因组测序和生物信息学分析，确定了超氧化物歧化酶基因sod19边界，并设计引物，在引物5’端加上保护碱基和酶切位点，其中上游引物加入EcoRI位点，下游加入XhoI酶切位点。提取纯化提取枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.SCSIO15121)的总DNA，使用高保真的DNA聚合酶pfu进行PCR扩增，获得超氧化物歧化酶基因sod19，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，从起始密码子到终止密码子全长为609p，编码202个氨基酸。
扩增得到的超氧化物歧化酶基因sod19用EcoRI和XhoI酶切，经核酸纯化回收试剂盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)回收后与pET-28a(+)连接获得重组表达载体，将该重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)表达重组产物超氧化物歧化酶SOD19，结合金属酶的特点，本发明从诱导剂的浓度，蛋白表达温度以及Mn2+添加的时间和浓度这几个方面对诱导表达进行了优化，并对重组产物超氧化物歧化酶SOD19进行酶活测定、金属类型测定及酶学特性鉴定，结果表明本发明的超氧化物歧化酶SOD19酶活为3215.6±143.2U mg-1，符合Mn-SOD特征，最适pH为8.0，最适反应温度为60℃左右，具有较高的热稳定性，70℃左右酶活基本保持不变，80℃处理1h依然有70％的酶活存在，100℃处理1h依然有50％的酶活，另外对有机溶剂也有较好的耐受性。
综上，本发明的超氧化物歧化酶SOD19是一种耐高温、耐有机溶剂的超氧化物歧化酶，。
本发明提供了一种耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19及其编码基因，该超氧化物歧化酶SOD19具有较好的热稳定性，在食品、生物医药和化妆品制备中具有非常大的应用价值。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.SCSIO 15121)为发明人所在实验室从印度洋深海海泥中分离得到并保藏，本申请人保证自申请日起20年内向公众提供该枯草芽孢杆菌(Bacillussp.SCSIO 15121)。
附图说明：
图1是Mn-SOD基因的蛋白表达纯化结果，其中，1：BL21(DE3)，pET28a-SOD19；2：BL21(DE3)，pET-28a-SOD19上清；3～8分别为：20mM咪唑，50mM咪唑，100mM咪唑，200mM咪唑，300mM咪唑，400mM咪唑洗脱液；
图2是不同pH对超氧化物歧化酶SOD19活力的影响；
图3是超氧化物歧化酶SOD19的最适反应温度；
图4是不同温度处理1h后超氧化物歧化酶SOD19的活性情况；
图5是抑制剂对超氧化物歧化酶SOD19活性的影响，其中，1：SOD19未处理；2：CH3Cl-C2H5OH(3∶5，V/V)处理后的SOD19活性；3：10mM H2O2处理后的SOD19活性。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、超氧化物歧化酶基因sod19引物设计及开放阅读框边界确定
将实验室保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.SCSIO15121)在LB固体培养基划线培养。每1L LB固体培养基配方为：NaCl 10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，琼脂15g。
挑取单菌落在LB液体培养基中，200rpm，37℃培养。取3mL菌液离心，收集菌体，用DNA提取试剂盒(Gene Jet Genomic DNA Purtification Kit，购自Thermo公司)提取总DNA，经16S rRNA验证无误后，交至上海美吉生物科技有限公司测序。
对基因组进行注释，分析其中的sod基因，确定了其中超氧化物歧化酶基因sod19，设计引物如下(下划线表示酶切位点)：
正向引物：5’-GGTGAATTCATGGCTTACAAACTTCCAG-3’
反向引物：5’-CTGCTCGAGTTATTTTGCTTCGCTGTAAAG-3’。
2、超氧化物歧化酶基因sod19的克隆及载体构建
2.1PCR扩增
将引物序列送至上海生物工程有限公司进行合成引物，合成的引物使用TE稀释到10μM，建立如下反应体系：
表1.PCR反应体系
使用以下PCR扩增程序扩增sod：
a.95℃变性5min；
b.95℃变性1min，54～58℃退火0.5min，72℃延伸1min 20s，进行30个循环；
c.72℃延伸10min，冷却到10℃。
将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察。回收600bp左右的条带。
PCR产物按照胶回收试剂盒(Magen，HiPure Gel Pure DNA Micro Kit)的方法进行回收，使用20μL无菌水洗脱。
2.2酶切
PCR产物使用以下体系进行酶切，酶切时间1h：
EcoRI 1μL
XhoI 1μL
DNA<0.3μg
灭菌的双蒸水加至30μL。
质粒pET-28a(+)的双酶切：挑取含有该质粒的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司，质粒小量制备试剂盒)提取质粒，用EcoRI和XhoI按以下体系双酶切酶切，酶切时间1h：
EcoRI 1μL
XhoI 1μL
质粒DNA<1μg
灭菌的双蒸水加至20μL。
上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶。
2.3连接
将经过双酶切PCR产物和质粒pET-28a(+)按照3∶1的摩尔比例进行连接。连接使用的T4连接酶购自北京全式金生物技术公司，连接使用的酶量为5U/5μL连接体系，连接温度为22℃，连接时间20min，得到含有超氧化物歧化酶基因sod19的重组载体pET-28a(+)sod。
2.4转化及筛选
取5μL连接产物与50μL大肠杆菌DH5a感受态细胞(购自北京全式金生物技术公司)中，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μL/mL的卡那霉素LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mL LB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。
2.5基因核苷酸序列测定
将获得的正确克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与sod19核苷酸序列为SEQDNA进行比对，结果完全正确后进行下一步试验。
3、超氧化物歧化酶基因sod19在BL21(DE3)中的高效表达
3.1BL21(DE3)感受态细胞的制备
a、将大肠杆菌BL21(DE3)接入5mL LB液体培养基中，37℃过夜摇培，250rpm；
b、1％的接种率将液培管中的菌液接种到LB摇瓶中，37℃摇培3h(≥300rpm)；
c、摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，分装至冰预冷的离心管(50mL)，冰置数分钟；
d、4℃，4000rpm离心10min回收细胞，将残留液空干(迅速)；
e、冰预冷的10mL 0.1M的CaCl2重悬细胞，4℃，4000rpm离心10min回收细胞；
f、10mL 0.1M的CaCl2重悬细胞，冰浴1h以上；
g、4℃，4000rpm离心10min回收细胞；
h、50mL原培养物用2mL含15％甘油的CaCl2来重悬，分装于1.5mL离心管，200μL每管，－80℃保藏。
3.2转化
取以上测序正确的带有超氧化物歧化酶基因sod19片段的重组载体pET-28a(+)sod0.5～1μL与50μL BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μL/mL的卡那霉素LB平板，培养20h后挑选单菌落。
4、超氧化物歧化酶SOD19的表达、纯化和功能验证
4.1蛋白诱导
含有重组载体pET-28a(+)sod的BL21(DE3)在LB培养基中培养至OD600为0.5-0.6，加IPTG至浓度0.2mM，加MnCl2至0.1mM，18℃培养16个小时。300mL菌液4000rpm，4℃离心10min，收集菌体，用30mL(50mM，pH 7.2)PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎10min分钟，离心，收集上清。
4.2超氧化物歧化酶SOD19纯化
用镍离子亲和层析柱对上清进行了纯化得超氧化物歧化酶，结果如图1所示，具体实施方案如下：使用5mM的咪唑洗脱5个柱体积，20～40mM咪唑洗脱10个柱体积，最后使用200～500mM咪唑洗脱5个柱体积，收集中间3.5mL。Ni柱纯化的蛋白通过脱盐柱SephadexG25对超氧化物歧化酶SOD19进行脱盐，得到超氧化物歧化酶SOD19酶液。
4.3超氧化物歧化酶SOD19酶活测定
SOD活力测定采用氮蓝四唑(NBT)光还原法，具体方法如下：在盛有3mL反应混合液(在54mL 14.5mmol/L L-甲硫氨酸中分别加入均以0.05mol/L pH7.8磷酸缓冲液配制的3μmol/L EDTA，2.25mmol/L NBT和60μmol/L核黄素各2mL，各溶液均在用前配制，避光放置)的试管中，加入步骤4.2得到的酶液，混合后放在透明试管架上，在光照培养箱内照光20分钟，取出试管，迅速测定OD560值，以缓冲液代替酶液的照光管为最大还原值，不照光管为对照。
酶活单位定义：单位时间内NBT还原反应被抑制半时所需的酶量为一个酶活单位。
测定重组SOD的酶活约为3215.6±143.2U mg-1。
4.4超氧化物歧化酶SOD19活性电泳及金属离子类型鉴定
SOD活性电泳NBT染色法，具体方法如下：
配制以下溶液：
1号染液，称取200mg NBT溶于100mL去离子水中，配成2.45×10-3mol/L的NBT溶液，可反复使用，直至出现沉淀。
2号染液，称取1.05mg核黄素，加入418μL TEMED，用50mmol/L pH 7.8磷酸缓冲液定容至100mL，配成2.8×10-2mol/L TEMED和2.8×10-5mol/L的核黄素溶液。
3号染液，称取0.29g EDTA，用50mmol/L的磷酸缓冲液(pH 7.8)定容至1L，配成1×10-4mol/L的EDTA溶液。
去除SDS-PAGE中的SDS，于120V下跑2h，将凝胶置于1号染液15min，2号染液20min，以上步骤在黑暗中进行
对于SOD金属离子类型鉴定，放入在2号染液前加入抑制剂，及加入10mM H2O2和CH3Cl-C2H5OH(3∶5，V/V)处理1h。
最后放入3号染液，于光下曝光至白色条带清晰。
经试验确认，所表达的超氧化物歧化酶SOD19对H2O2不敏感，对CH3Cl-C2H5OH敏感，符合Mn-SOD特征，而且与序列比对结果一致，可以确认为Mn-SOD。
5、重组超氧化物歧化酶SOD19酶学的特性鉴定
5.1最适pH
配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，其浓度均为50mM：
表2.不同缓冲体系的pH
将步骤4.2得到的酶液加入表2中的缓冲液中，测定重组超氧化物歧化酶SOD19的酶活力，SOD19最适pH为8.0，pH在7.5和8.5之间表现出较好的酶活，如图2所示。
5.2最适温度
将步骤4.2得到的酶液加入步骤4.3中的反应混合液中，后置于不同的温度下处理30min，然后测定SOD19的酶活，重组超氧化物歧化酶SOD19最适反应温度在60℃左右，结果如图3所示。
5.3温度稳定性
将酶液置于pH7.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中，使用30～100℃处理酶液1h后测定酶活。由图4可知，SOD19展示了较高的热稳定性，70℃左右酶活基本保持不变，80℃处理1h依然有70％的酶活存在，100℃处理1h依然有50％的酶活。因此本发明的超氧化物歧化酶SOD19具有极高温度稳定性，具备较好的应用前景。
5.4金属离子抑制
将使用pH7.0的Na2HPO4/NaH2PO4配制不同金属离子溶液，每种金属离子浓度均为5mM，将SOD19酶液在各种金属离子溶液中37℃下处理30min。测定酶活，结果见表3，可见Cu2+和Mn2+对SOD19的酶活有促进作用，其它金属离子对SOD19的酶活影响较小。
表3.金属离子对SOD19酶活力的影响
5.5有机溶剂、变性剂和抑制剂对SOD19活性的影响
将纯化后得到的SOD19加入到表4中的有机溶剂、变性剂和抑制剂中处理30min，以后按照步骤4.3的测定方法测定剩余酶活。结果说明SOD19对有机溶剂有较好的耐受性，而对抑制剂Tween 20、Triton X-100耐受性不高，另外对变性剂尿素和EDTA也有较好的耐受能力。
表4.有机溶剂、变性剂和抑制剂对SOD19活性的影响

Claims (8)

1.一种耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19的基因。
3.根据权利要求2所述的编码耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.权利要求3所述的基因在编码权利要求1所述的耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19中的应用。
5.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述的编码耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19的基因。
6.一种含有权利要求5所述的表达载体的微生物。
7.一种权利要求1所述的耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19的诱导表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
将转有编码耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19基因的微生物在培养基中培养至OD600为0.5左右，加IPTG至浓度为0.2mM，再加MnCl2至浓度为0.1mM，18℃培养16个小时，即可高效诱导表达耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19。
8.权利要求1所述的耐高温耐有机溶剂的超氧化物歧化酶SOD19在制备生物医药、化妆品和食品中的应用。
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