CN102517306A - 四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及应用，该基因可编码四氢嘧啶合成酶，并在宿主细胞中高效表达以生产四氢嘧啶合成酶，使含有该基因的工程菌结构稳定、性能优良、耐盐性高，处理高盐废水无需驯化，降低了高盐废水处理成本，简化了生产工艺，可广泛应用于日化、食品加工、皮革加工、有机合成和药物制备等行业中高盐废水的处理，意义重大。

Description

四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及涉及一种四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及其应用，属于酶的基因工程领域。

背景技术

四氢嘧啶作为相容性溶质于1985年在极端嗜盐菌Ectothiorhodospirahalochloris中被Galinski等所发现并且鉴定结构，1988年Inbar等又在革兰氏阳性土壤细菌Streptomycesparvulus中发现了四氢嘧啶的羟基化衍生物羟基化四氢嘧啶。四氢嘧啶类相容性溶质(ectoines,Ecs)是嗜盐菌中最普遍存在的相容性溶质之一，能够为处于外界高温、冷冻、射线、干燥等极端条件刺激下的细胞、蛋白质、细胞膜、和核酸提供保护作用，因此受到各国研究者的广泛关注。此外Ecs对阿尔兹海默氏症、帕金森病等神经性疾病均有一定的疗效，并且最新研究发现Ecs能够提高皮肤的再生能力和延缓皮肤的老化。因此，Ecs在精细化工、生物医药及生物制造等行业将具有广泛的应用前景。

目前处理高盐废水常用的是物化法+生化法的水处理工艺，该工艺流程繁琐，工艺参数要求严格，操作困难，处理效率低，运行成本高，废水处理过程中产生大量有毒有害固废很难处理。经过该工艺处理后的废水很难达到国家的直排标准。据现有报道来看，对高盐废水直接采用生物法处理，在企业的实际应用中少有成功案例。生物法处理虽然在工艺流程以及成本投入方面有很大优势，但由于此种废水的高盐以及极强的杀菌抑制能力，使得其对微生物的杀伤力极大，因此，寻找一种能应用于工业生产的处理高盐废水的微生物是目前高盐废水处理行业所关注的焦点。

近几年，国内外学者对微生物四氢嘧啶合成酶的基因工程研究做了大量工作，并取得了很多重要成果。斯图加特大学根据ES的基因序列、蛋白质结构等的研究情况整理了一个ES酶工程数据库对ES酶相关信息进行了不同的分类。目前为止已克隆了包括微生物和动植物在内的众多ES酶基因，在NCBI中已报道的ES酶基因已达1000余个(包括假单胞菌、酵母菌、葡萄球菌、链霉菌和枯草杆菌等众多微生物来源的)；而且仍在迅猛增加。

由于ES酶基因氨基酸序列具有较低相似性，即不同种甚至同种不同属的微生物之间的ES酶基因序列也存在较大的差异，所以ES酶基因的克隆存在较大难度。目前关于ES酶基因的克隆策略有以下几种：(1)通过构建DNA/mRNA文库克隆ES酶基因：直接将待克隆基因的基因组酶切后回收带有ES酶的基因片段，转化到E.coli中构建基因组文库，在罗丹明B平板上筛选阳性克隆。(2)RACE的方法。分别通过3′RACE和5′RACE，经过两轮PCR，获得基因全长；(3)直接从已知序列设计引物PCR克隆ES酶基因：根据序列同源性比较，参考已报道出发菌株ES酶基因序列设计引物，以基因组DNA为模板直接进行PCR扩增目的ES酶基因片段。

发明内容

本发明的目的是提供一种四氢嘧啶合成酶基因、含有该基因的重组载体和重组工程菌。

本发明的另一个目的是提供该重组工程菌的应用，本发明所述基因为耐盐基因，将该基因转入菌株制得的工程菌耐盐性大大提高，在处理高盐废水中具有重要应用。

本发明是通过以下措施实现的：

一种四氢嘧啶合成酶基因，具有SEQ NO：1所示的核苷酸序列。

本发明四氢嘧啶合成酶基因的得到方法与常规方法略有不同，以前期筛选到的耐盐菌株芽孢杆菌(Bacillaceae)基因组为模板，通过简并引物PCR与反向PCR(IPCR)相结合的方法，扩增得到了编码完整的ES酶基因的ORF框，该基因全长414bp，编码137个氨基酸，序列如SEQ NO：1所示。具体方法如下：

1、根据四氢嘧啶合成酶的氨基酸序列，设计简并引物序列

上游引物  5’-GGNTTYWSNTTYCAYATHACN-3’

下游引物  5’-NGGRTTRAANACRCA-3’

2、以芽孢杆菌(Bacillaceae)基因组为模板，进行PCR扩增获取ES酶基因，其反应体系为：

10× buffer                            5.0 ML 

dNTPs(2.5 mM)                       4.0 μL

上游引物(50 mM)                     1.0 μL

下游引物(50 mM)                     1.0 μL 

Taq DNA polymerase                   0.5 μL

芽孢杆菌(Bacillaceae)基因组            1.0 μL

H₂O                                 37.5 μL

反应条件为：预变性94℃，5min；变性温度94℃，1min；退火温度57℃，1min； 

延伸温度72℃，1.5min，循环32次。

根据上述四氢嘧啶合成酶基因，可编码四氢嘧啶合成酶，其氨基酸序列如SEQNO：2所示。

本发明还提供了含有该基因的重组载体(即重组表达载体，下同)，重组载体的构建方法为：将以芽孢杆菌基因组为模板扩增得到的含有限制性内切酶(EcoRI 与NotI)酶切位点的ES酶基因与T载体pBST相连得到pBST-ES，然后将表达载体pIC9K与pBST-ES分别进行双酶切，酶切后的基因片段与质粒pIC9K进行连接并转化进大肠杆菌，提取质粒然后用BgⅡ 线性化处理，得到重组载体，命名为pIC9K-ES。

将上述线性化的重组载体pIC9K-ES转入目的降解菌株中，可以得到含有ES酶的重组工程菌，本发明所用的降解菌株Oceanobacillus sp. CJ-10是从工厂废水车间的生物处理池及工厂生产车间周边土样中富集、筛选得到的，发明人已经将降解菌株和重组工程菌进行了保藏，降解菌株Oceanobacillus sp. CJ-10，保藏号为CGMCC NO.4328，保藏日期为2010年11月12日；重组工程菌Oceanobacillus sp. CJ-10-1的保藏号为CGMCC NO.5463，保藏日期为2011年11月16日，他们均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

本发明的重组工程菌实现了该基因的高效表达，本发明的重组工程菌有以下特点：(1)表达量高：由于醇氧化酶基因启动子很强，细胞生长速度很快，所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高；(2)稳定性好：由于该系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在，而是整合在染色体上，所以构建的菌株十分稳定；(3)分泌量大：分泌信号和先导序列(如α因子)使其分泌表达可达10g/L，这在ES酶的生产过程中十分少见；(4)容易放大；(5)成本较低：重组蛋白在目的降解菌株中的表达比在昆虫和哺乳动物中表达成本要低，生产和表达基质不需要象牛血清白蛋白那样昂贵的添加物,也不需要CO₂培养箱和组织培养箱等昂贵的设备。

本发明还提供了含有该基因的重组工程菌的应用，具体的是在处理高盐废水中的应用，所述废水含盐量在12wt%以下，酚含量在2500mg/L以下，COD在10000mg/L以下，废水中含有苯酚、2,4-二氯苯酚、氯乙酸和2,4-D酸中的至少一种。经重组的菌株具有很高的耐盐性和稳定性，大大降低了废水处理成本，大大提高了废水处理效率。

采用重组工程菌处理高盐废水的工艺流程如图5所示，方法为：

（1）含盐含酚废水进入调配池，调节废水中的COD、N和P的含量，同时将废水温度调节至15-35℃，pH调节至7.5-9.5，盐含量调节为1-12wt%；

（2）废水进入生物处理设备进行生物降解，处理后废水中COD﹤200mg/L，酚﹤0.2mg/L，所述生物处理设备包括依次连接的一级厌氧生物滤池、二级厌氧生物滤池、一级好氧生物滤池和二级好氧生物滤池，所述一级厌氧生物滤池、二级厌氧生物滤池、一级好氧生物滤池和二级生物滤池中均固定有权利要求5所述的重组工程菌，重组工程菌的固定量均为1-5g/L废水；

（3）生物处理后废水进一步采用磁性大孔离子交换树脂进行吸附，吸附后废水中TOC﹤20mg/L；

（4）步骤(3)后的废水进入氯碱精制工艺或进入盐场晾晒后回收固体盐。

上述生物处理设备中，固定重组工程菌所用的载体为陶粒、火山石、聚氨酯悬浮填料、颗粒活性炭或高温竹炭，优选活性炭，固定时间为24-48h。

上述生物处理设备中，一级和二级厌氧生物滤池废水处理条件为：pH 7.5-9.5、温度15-35℃、时间20-24h；一级好氧生物滤池废水处理条件为：pH 7.5-9.5、温度15-35℃、时间20-24h、溶氧2-4mg/L；二级生物滤池废水处理条件为：pH 7.5-9.5、温度15-35℃、时间20-24h、溶氧2-4mg/L。

上述步骤(1)中，加入尿素调节废水中N含量，加入KH₂PO₄调节废水中P含量，使废水中COD:N:P的浓度比为100-300:2-6:0.6-1.2，以为菌种提供环境条件。

上述步骤(3)中，生物处理后废水pH6-9，流速为15-30mL/min，吸附温度为25-35℃。

得到的重组工程菌需要扩大培养才能满足实际需要，培养过程为：将重组工程菌按10%的接种量接入到培养基中，在温度15-35℃、pH 7.5-9.5、溶解氧2-4mg/L的条件下对菌种进行扩大培养72-96h，培养后将培养基离心分离得湿菌体；所用培养基为葡糖糖9-11g/L，尿素1.0-1.2g/L，磷酸二氢钾1.29-1.34g/L，氯化钠 12wt%。

本发明重组工程菌不需驯化即可直接用于处理高盐废水，对盐浓度在12wt%以下的废水均有很好的处理作用，大大减少了稀释用水的使用量；生物处理过后的废水，酚类物质去除率在99%以上，并且出水COD保持在200mg/L以下，继续对出水进行磁性大孔树脂吸附处理，使废水不仅达到了山东半岛流域水污染物综合排放标准，还可以晒出工业盐，具有广泛的社会效益和环境效益。

本发明的重点是提供SEQ NO：1所示的核苷酸序列、SEQ NO：2所示的氨基酸序列、具有该SEQ NO：1所示的核苷酸序列的重组载体和重组工程菌。在已知上述两种序列的基础上，可以通过现有技术得到核苷酸序列和氨基酸序列，例如PCR扩增技术。此外，相关载体、宿主细胞、内切酶、试剂的获得，也是可以在市场中买到或者根据现有技术得到的，对本领域技术人员来说均为显而易见的。

本发明提供了一种四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及应用，该基因可编码四氢嘧啶合成酶，并在宿主细胞中高效表达以生产四氢嘧啶合成酶，使含有该基因的工程菌结构稳定、性能优良、耐盐性高，处理高盐废水无需驯化，降低了高盐废水处理成本，简化了生产工艺，可广泛应用于日化、食品加工、皮革加工、有机合成和药物制备等行业中高盐废水的处理，意义重大。

保藏信息

降解菌株：Oceanobacillus sp. CJ-10，已经于2010年11月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.4328；

重组工程菌：Oceanobacillus sp. CJ-10-1，已经于2011年11月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.5463。

附图说明

图1 实施例2所得四氢嘧啶合成酶基因片段的电泳图。

图2实施例3四氢嘧啶合成酶基因回收电泳图。

图3实施例3pIC9K-ES重组载体纯化电泳图。

图4 pIC9K 质粒图谱。

图5重组工程菌废水处理流程图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步的阐述本发明并证实本发明的优点。下述实例中，所用到的技术，例如PCR技术、引物设计技术、载体构建技术、细胞转化技术、检测技术、电泳技术等均为基因工程中的成熟技术，本领域技术人员可根据现有技术实现。在操作过程中所用到的设备或试剂、载体、菌株等，如无特别注明，均能在市场中得到。

下述实施例所用的限制性内切酶(EcoRI内切酶、NotI内切酶)、Taq酶、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer均购于Takara公司，大肠杆菌和pIC9K质粒载体购于Invitrogen公司，T载体购于Tiangen公司。

实施例1

本发明ES酶基因的原始取得过程如下：

采用上海生工的One-4-All Genomic DNA Mini-Preps Kit提取芽孢杆菌(Bacillaceae)基因组DNA(操作步骤见试剂盒说明书)。根据四氢嘧啶合成酶的氨基酸序列，设计简并引物序列，上游引物为GGNTTYWSNTTYCAYATHACN，下游引物为NGGRTTRAANACRCA。然后以芽孢杆菌基因组DNA为模板，在简并引物的作用下通过PCR的方法得到含有限制性内切酶(EcoRI 与NotI)酶切位点的ES酶基因，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。

反应体系：

10× buffer                    5.0 ΜL 

dNTPs(2.5 mM)               4.0 μL

上游引物(50 mM)             1.0 μL

下游引物(50 mM)             1.0 μL 

Taq DNA polymerase           0.5 μL

芽孢杆菌基因组DNA         1.0 μL

H₂O                        37.5 μL

反应条件：预变性94℃，5min；变性温度94℃，1min；退火温度57℃，1min； 

延伸温度72℃，1.5min，循环32次。

实施例2

在得到本发明ES酶基因核苷酸序列的基础上，其基因的获得可以通过现有方法克隆得到，其方法如下：

1、表达用ES酶基因的克隆

根据实施例1得到的SEQ NO:1基因序列，设计并合成扩增引物 Qe-1与Qe-2。

Qe-1  5’-GGCCGTTCTGGCCGCAGGCGTGTCTCAAGG-3’

Qe-2  5’-GGATCCGTTCTCAACTTGTG-3’

以芽孢杆菌基因组DNA为模板，在引物的作用下进行PCR扩增，反应体系为：

10× buffer              5.0 μL

dNTPs(2.5 mM)         4.0 μL

Qe-1(50 mM)           1.0 μL

Qe-2(50 mM)           1.0 μL 

Taq DNA polymerase     0.5 μL

芽孢杆菌基因组DNA    1.0 μL

双蒸水                37.5 μL

采用PCR仪，反应条件：预变性94 oC 5min；变性温度94 oC 1min；退火温度57oC，1min；72oC延伸1.5min，循环32次。

将PCR产物利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为400bp左右的基因片段，结果如图1所示。

实施例3

本发明基因片段可以与质粒连接构建得重组表达载体，其方法为：

将上述实施例2的基因片段回收与T载体 pBST(Tiangen公司)相连，转化进大肠杆菌(Escherichiacoli) DH5α中，抗性筛选，提取符合要求的质粒，记为pBST-ES，所得质粒与表达载体pIC9K（其质粒图谱如图4所示）分别进行双酶切，双酶切反应体系如下：

pIC9K或pBST-ES             10 μL

10×H buffer                   2 μL

EcoRI内切酶                 1 μL

NotI内切酶                  1 μL

双蒸水                      6 μL 

反应条件：37oC酶切2-4h ，加入4μL10×loading buffer终止反应，反应液用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并回收酶切片段，如图2所示。将回收的目的片段及质粒pIC9K进行连接，得重组表达载体，命名为pIC9K-ES。连接反应体系(10μL)为：

           pIC9K                           2 μL

           目的DNA片段                   2 μL

           T4 DNA ligase                  1 μL

           10×T4 DNA ligase buffer          1 μL

           双蒸水                           4 μL

连接反应条件：16oC过夜，将连接的重组质粒进行线性化处理，线性化处理体系(20μL)为：

     pIC9K-ES                     10 μL

10×H buffer                   2 μL

Bgl II                        1 μL

双蒸水                       6 μL 

线性化条件：37oC酶切2～4 h，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测线性化程度，如图3所示，使用核酸回收试剂盒(Takara公司，大连)回收产物。

实施例4

将上述实施例3线性化的pIC9K-ES重组载体通过电转化的方式转入目的降解菌株(JC-10)感受态细胞中，得到重组工程菌。

电转化方案：

1) 取80μl感受态JC-10细胞至一新的无菌Eppendorf管中，加入5-10μl线性化DNA，置于0.2cm型的电穿孔转化杯中。

2) 将电转杯置于冰上5min。

3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V；电阻：400Ω；电容：25μF；脉冲时间：10mS；1-2次电击。

4) 电击后，马上在电击转化杯中加入1mL 0℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液器轻轻吹打均匀，置于冰浴中。

5) 将电转杯中的混合液转移到新的无菌Eppendorf管中，30°C，静置培养1-2h。

6) 分别取10, 25, 50, 100和200μl混合液涂布在MD平板上。

下面通过具体实施例阐述本发明重组工程菌在处理含酚废水中的应用及效果。

实施例5

在处理废水前将重组工程菌固定在生物处理系统中，该生物处理系统包括依次连接的一级厌氧生物滤池、二级厌氧生物滤池、一级好氧生物滤池和二级生物滤池，重组工程菌固定在一级厌氧生物滤池、厌氧生物滤池、一级好氧生物滤池和二级生物滤池中。固定过程为：将重组工程菌按1-5g/L废水的投加量加入到带有载体的生物反应器中，将重组工程菌固定在载体上，固定时间为24-48h。

固定重组工程菌的载体可选自陶粒、火山石、聚氨酯悬浮填料、颗粒活性炭和高温竹炭中的任一种，优选和常用的为颗粒活性炭。本发明所用的聚氨酯悬浮填料来自佛山市碧沃丰生物科技有限公司，所用的高温竹炭来自徐州天正活性炭厂。在处理废水时载体可随意选择。

实施例6

将上述实施例4得到的重组工程菌应用到2,4-D高盐含酚废水的处理当中，以2,4-D生产工厂的高盐含酚废水为例，废水中含有苯酚、2,4-二氯苯酚、氯乙酸、2,4-D酸等有机物，酚含量在2500mg/L以下，COD含量在10000mg/L以下，含盐量高达12%，分别取10组2,4-D含酚废水，废水中盐、酚含量见下表：

上述10组含酚废水处理步骤如下：

采用重组工程菌处理上述10组含酚废水的步骤如下：

1、将含盐含酚废水进入调配池，调节废水中的COD、N含量和P含量，使COD:N:P为100-300:2-6:0.6-1.2，若这三者之间的比值不满足100-300:2-6:0.6-1.2，可加入尿素调节N含量，加入KH₂PO₄调节P含量，使满足条件，同时将废水温度调节至15-35℃、pH调节至7.5-9.5，盐分含量调至1-12wt%。

2、废水调配好后，进入生物处理设备进行生物降解，生物处理设备中，一级和二级厌氧生物滤池废水处理条件为：pH 7.5-9.5、温度15-35℃、时间20-24h；一级好氧生物滤池废水处理条件为：pH 7.5-9.5、温度15-35℃、时间20-24h、溶氧2-4mg/L；二级生物滤池废水处理条件为：pH 7.5-9.5、温度15-35℃、时间20-24h、溶氧2-4mg/L，处理后废水中COD﹤200mg/L，酚﹤0.2mg/L。

3、废水进行生物处理后，进一步采用磁性大孔离子交换树脂进行吸附，吸附时废水pH为6-9，废水流速在15-30mL/min之间，吸附温度为25-35℃，吸附后废水中TOC﹤20mg/L，酚基本检测不出。

4、吸附后的废水进入氯碱精制工艺通过氯碱一次精制和二次精制，可满足氯碱原材料需要；吸附后的废水也可通过盐场晾晒之后回收固体盐，使资源充分回收，减少了环境污染和资源浪费。

废水处理过程中，废水中酚、COD的处理情况如下：

核苷酸序列表

<110>山东潍坊润丰化工有限公司

<120>四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及其应用

<160>2

<210>1

<211>414

<212>DNA

<213>Bacillaceae

<400>1

atgatcgttc gcaatctcga agaagcgcgc cagaccgacc gtctggtcac cgccgaaaac 60

ggcaactggg acagcacccg cctgccgctg gccgaagatg gtggcaactg ctccttccac 120

atcacccgca tcttcgaggg taccgagacc cacatccact ataagcatca cttcgaggct 180

gtttattgca tcgaaggcga gggcgaagtg gaaaccctgg ccgatggcaa gatctggccc 240

atcaagccgg gtgacatcta catcctcgac cagcacgacg agcacctgct gcgcgccagc 300

aagaccatgc acctggcctg cgtgttcacg ccgggcctga ccggcaacga agtgcaccgc 360

gaagacggtt cctacgcacc tgccgacgaa gccgacgacc agaagccgct gtaa       414

 

<210>2

<211>137

<212>PRT

<213>Bacillaceae

<400>2

Met Ile Val Arg Asn Leu Glu Glu Ala Arg Gln Thr Asp Arg Leu Val

1                5                  10                  15

Thr Ala Glu Asn Gly Asn Trp Asp Ser Thr Arg Leu Pro Leu Ala Glu

            20                  25                  30

Asp Gly Gly Asn Cys Ser Phe His Ile Thr Arg Ile Phe Glu Gly Thr

        35                  40                  45

Glu Thr His Ile His Tyr Lys His His Phe Glu Ala Val Tyr Cys Ile

     50                  55                    60

Glu Gly Glu Gly Glu Val Glu Thr Leu Ala Asp Gly Lys Ile Trp Pro

65                  70                  75                  80

Ile Lys Pro Gly Asp Ile Tyr Ile Leu Asp Gln His Asp Glu His Leu

                85                  90                  95

Leu Arg Ala Ser Lys Thr Met His Leu Ala Cys Val Phe Thr Pro Gly

            100                 105                 110

Leu Thr Gly Asn Glu Val His Arg Glu Asp Gly Ser Tyr Ala Pro Ala

        115                 120                 125

Asp Glu Ala Asp Asp Gln Lys Pro Leu

    130                 135

 

Claims (10)

1.一种四氢嘧啶合成酶基因，其特征是：具有SEQ NO：1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的四氢嘧啶合成酶基因，其特征是：其能编码SEQ NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种含有权利要求1所述四氢嘧啶合成酶基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征是：所述重组载体是由权利要求1所述的四氢嘧啶合成酶基因和表达载体pIC9K构建而得。

5.一种用权利要求4所述的重组载体转化得到的重组工程菌，其特征是：所述重组载体转化入Oceanobacillus sp. CJ-10 CGMCC NO.4328中，所得重组工程菌为Oceanobacillus sp. CJ-10-1 CGMCC NO.5463。

6.一种权利要求5所述的重组工程菌在处理高盐废水中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征是包括以下步骤：

(1)含盐含酚废水进入调配池，调节废水中的COD、N和P的含量，同时将废水温度调节至15-35℃、pH调节至7.5-9.5；

(2)废水进入生物处理设备进行生物降解，处理后废水中COD﹤200mg/L，酚﹤0.2mg/L，所述生物处理设备包括依次连接的一级厌氧生物滤池、二级厌氧生物滤池、一级好氧生物滤池和二级好氧生物滤池，所述一级厌氧生物滤池、二级厌氧生物滤池、一级好氧生物滤池和二级生物滤池中均固定有权利要求5所述的重组工程菌，重组工程菌的固定量均为1-5g/L废水；

(3)生物处理后废水进一步采用磁性大孔离子交换树脂进行吸附，吸附后废水中TOC﹤20mg/L；

(4)步骤(3)后的废水进入氯碱精制工艺或进入盐场晾晒后回收固体盐。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征是：生物处理设备中，固定重组工程菌所用的载体为陶粒、火山石、聚氨酯悬浮填料、颗粒活性炭或高温竹炭，固定时间为24-48h；一级和二级厌氧生物滤池废水处理条件为：pH 7.5-9.5、温度15-35℃、时间20-24h；一级好氧生物滤池废水处理条件为：pH 7.5-9.5、温度15-35℃、时间20-24h、溶氧2-4mg/L；二级生物滤池废水处理条件为：pH 7.5-9.5、温度15-35℃、时间20-24h、溶氧2-4mg/L。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征是：步骤(1)中，加入尿素调节废水中N含量，加入KH₂PO₄调节废水中P含量，使废水中COD:N:P的浓度比为100-300:2-6:0.6-1.2；步骤(3)中，生物处理后废水pH6-9，流速为15-30mL/min，吸附温度为25-35℃。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征是：废水含盐量在12wt%以下，酚含量在2500mg/L以下，COD在10000mg/L以下，废水中含有苯酚、2,4-二氯苯酚、氯乙酸和2,4-D酸中的至少一种。

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