CN113528476A

CN113528476A - 一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和高效重组表达

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Publication number: CN113528476A
Application number: CN202110959606.8A
Authority: CN
Inventors: 叶秀云; 靳伟刚; 应喜娟; 李仁宽
Original assignee: Fujian Fuda Biotech Development Co ltd
Current assignee: Fujian Fuda Biotech Development Co ltd
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113528476B

Abstract

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和高效重组表达。本发明将来源于黑曲霉CGMCC 3.4523的葡萄糖氧化酶基因GOD按照巴斯德毕氏酵母的密码子偏好进行优化，得到葡萄糖氧化酶基因GOD‑ OP，然后将基因GOD‑OP进行定点突变，得到葡萄糖氧化酶基因GOD‑MT5，并构建了含有葡萄糖氧化酶基因GOD‑OP的重组表达载体和含有葡萄糖氧化酶基因GOD‑MT5的重组表达载体。上述重组表达载体可在毕氏酵母X33中高效表达，实现葡萄糖氧化酶的产业化生产。本发明所获得的葡萄糖氧化酶GOD及其突变体GOD‑MT5具有良好的酶学性质，可以应用于制备饲料添加剂、食品添加剂。

Description

一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和高效重组表达

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和高效重组表达。

背景技术

2018年，农业农村部发布了《农业农村部办公厅关于开展兽用抗菌药使用减量化行动试点工作的通知》，决定开展兽用抗菌药使用减量化行动，并组织制定了《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案（2018-2021年）》（以下简称“方案”）：在2020年底以前，药物饲料添加剂将在饲料中消失，不能再用在饲料生产中，只能用在养殖端。并且，农业部制定的“方案”中也明确了养殖端减抗和禁抗的时间。因此，非抗生素和药物类替抗产品的研制和推广使用迫在眉睫。

在众多抗生素替代产品中，酶制剂在无抗饲养的应用效果和地位是无可比拟的，在饲料中添加酶制剂，可以直接补充内源酶的不足、促进营养消化利用,也可改善肠道健康、提高机体免疫力、减少应激反应和提高抗应激能力、减少粪便排放、降低环境污染等。但传统酶制剂不能直接作为抗生素替代品起到抑菌和杀菌的效果。

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）是一种黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖型氧化酶，该酶以分子氧作为电子受体，催化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢，再经非酶促反应水解成葡萄糖酸。GOD是同型二聚体分子，含有2个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合位点。每个单体含有2个完全不同的区域：一个与部分FAD非共价但紧密结合，主要为β折叠；另一个与底物β- D -葡萄糖结合，由 4个α-螺旋支撑1个反平行的β折叠。

葡萄糖氧化酶的作用产物为葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖酸，具有酸化剂相似的作用，可使胃内食糜pH值降低，从而更有效的激活胃蛋白酶，有利于蛋白质等营养成分的消化吸收；pH值下降，也能抑制有害细菌繁殖，避免肠道中的异常发酵；过氧化氢具有广谱杀菌作用，可以起到抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物生长繁殖的作用；葡萄糖氧化酶作用过程中消耗肠道内的氧气，造成厌氧环境，促进益生菌的增殖，而有益菌大量增殖会形成微生态竞争优势，从而抑制了病原微生物的存活，提高了牲畜的自身免疫力，并增强其他消化酶的生物活性，改善肠道菌群，促进肠道蠕动，提高营养物质的利用率，从而提高饲料转化效率。因此，作为一种新型的抗生素替代物，葡萄糖氧化酶在饲料工业中具有广阔的应用前景。

葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，微生物葡萄糖氧化酶大多数来源于真菌，主要为曲霉属和青霉属。其中，曲霉属包括黑曲霉（Aspergillus niger）、塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、土曲霉（Aspergillus terreus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）等；青霉属包括尼崎青霉（Penicillium amagasakiense）、变幻青霉（Penicillium variabile）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、特异青霉（Penicillium notatum）等。国内对GOD的系统研究始于20世纪70年代。葡萄糖氧化酶协作组从367株青霉和曲霉中筛选到GOD高产菌点青霉（Penicillium notatum）AS 3.3871，以蔗糖为碳源，NaNO3为氮源，振荡培养后经静置，酶活达到15～18U/mL。2013年，朱运平等从全国120余份土样中筛选到高产GOD的黑曲霉（A. niger）1504，该菌株同时合成胞外GOD（55.08U/mL）和胞内GOD（80.58U/mL），经紫外-亚硝酸钠复合诱变，获得遗传稳定性高的突变菌UNⅡ 021，其胞外GOD酶活达到186.32U/mL。江南大学酶工程实验室长期从事GOD研究，从最初的菌株筛选，到黑曲霉（A.niger）Z-25的god基因异源表达于巴斯德毕赤酵母提高产量，再到对重组菌进行改造，于2015年使GOD酶活达到1634.7U/mL，为有史以来报道的最高值。

工业上主要利用黑曲霉菌或青霉菌进行生产葡萄糖氧化酶，但是常出现酶活力不高、稳定性差、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。尽管利用基因工程的手段实现了葡萄糖氧化酶的异源表达，由于表达量不高导致生产成本突出的问题仍然没有得到有效解决，阻碍了葡萄糖氧化酶的大规模工业化生产及广泛应用。另外，饲料在造粒过程中有一个短暂的高温（80-90℃）阶段，现有的葡萄糖氧化酶产品耐热性差，也大大的限制了其在饲料中的应用效果和范围。因此挖掘分离新的葡萄糖氧化酶、提高葡萄糖氧化酶耐热性和pH耐受性、拓宽pH的温度适用范围、以及提高其表达量和酶活力，是促进葡萄糖氧化酶应用推广的关键，也是我们研究的重点和方向。

目前，对蛋白质进行分子改良的策略主要有两种：非理性设计（定向进化）和理性设计。非理性设计策略不需要了解蛋白质的结构与功能的特点，但是它必须具备一个高通量定向筛选突变体的方法，并且这个方法工作量大，造成大量的人力和资金的消耗。近年来，随着蛋白质结构和功能鉴定技术越来越成熟，人们对蛋白质结构的研究越来越深入，基于理性设计对蛋白质进行分子改良的策略发展起来：（1）蛋白质表面优化策略：一般情况下，疏水氨基酸掩藏在蛋白质的内部，各种亲水性氨基酸分布在蛋白质的表面，带电荷氨基酸在蛋白质表面可通过静电相互作用形成一个保护层，稳定蛋白质的结构，基于这一特点，可以通过重新优化设计蛋白质表面的带电荷氨基酸，使表面分布的电荷合理化，增强蛋白质表面的静电相互作用力，提高蛋白质热稳定性；（2）二硫键策略：蛋白质结构内部在特定位置上形成的二硫键，可降低蛋白质折叠状态的熵值，这对蛋白质的热稳定性起着至关重要的作用，可用二硫键设计软件来分析蛋白质结构内部哪些特定位点可形成二硫键；（3）盐键策略：酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）和碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）残基之间的静电作用力称为离子键或盐键，这是影响蛋白质的热稳定性因素的关键之一，基于蛋白质的这一热稳定机制，可在蛋白质三级结构内部引入带电荷氨基酸，然后再对蛋白质进行定点突变，以提高蛋白质的热稳定性；（4）氢键策略：蛋白质内部的多肽链之间及蛋白质表面氨基酸侧链与水介质之间可形成大量的氢键，研究表明，pH依赖型酶的催化活性受催化残基的pka调控，而催化残基的pKa值与邻近的通过氢键相互作用的可电离基团的酸度相关，因此，在酶蛋白分子内部的引入氢键可有效改善其热稳定性和 pH 稳定性；（5）其它策略：蛋白质分子内部的疏水作用力、脯氨酸、芳香环间的相互作用等因素都是嗜热蛋白的热稳定性机制，基于对蛋白质热稳定性的理性认知，可对蛋白质的热稳定性进行分子改良研究。除此之外，还可通过已公开的蛋白质热稳定性动力学及相应参数如蛋白质解折叠自由能ΔG、解折叠过程的焓变ΔH和熵变ΔS、热熔的变化ΔCp等，运用可计算蛋白质突变前后热稳定性参数的软件来分析分子热稳定性的变化。另外，还可运用基于蛋白质结构计算酸度系数（pKa）值的软件，来精确计算酶蛋白的pKa值，从而对酶蛋白的pH稳定性进行预测和评判。

本发明从黑曲霉中得到了一个新的葡萄糖氧化酶基因，通过密码子优化，显著提高了其表达水平；通过理性设计对所表达的葡萄糖氧化酶进行分子改良，拓宽了酶分子的温度适用范围和pH适用范围，提高了温度耐受性和pH耐受性，从而使本发明的新型葡萄糖氧化酶有更好的适用范围和应用效果，提升了其在饲料和食品等领域的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和高效重组表达，实现葡萄糖氧化酶的产业化生产及应用推广。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种葡萄糖氧化酶GOD，所述葡萄糖氧化酶GOD来源于黑曲霉CGMCC 3.4523，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.3所示，其编码基因GOD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种编码上述葡萄糖氧化酶GOD的基因GOD-OP，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，GC含量为54.81%；基因GOD-OP是通过结合密码子使用频率的调整、GC含量的平衡及不稳定序列的删除，并按照巴斯德毕氏酵母的密码子偏好对葡萄糖氧化酶编码基因GOD进行优化得到的

一种葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5，所述突变体是由SEQ ID NO.3所示氨基酸序列第11位氨基酸由N变为E、第165位氨基酸由T变为K、第185位氨基酸由R变为D、第360位氨基酸由S变为T、第502位氨基酸由T变为Q、第570位氨基酸由S变为A得到的；所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。

进一步的，上述葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5具有如下特征：

①理论分子量为63.11kDa；

②理论pI值为4.62；

③最适pH范围为4.0-6.0，其中最高点为6.0；

④最适反应温度范围为30-60℃，其中最高点为40℃；

⑤在pH2.0下处理60min，有75.2%的残余酶活力；在pH3.0-7.0的范围内处理60min，能保持90%以上的残余酶活力；在pH10.0下处理60min，仍有50%左右的残余酶活力；

⑥在70℃、75℃、80℃、85℃和90℃下分别处理3min后，分别有81.1%、67.9%、40.5%、19.5%和8.3%的残余酶活力；且经胰蛋白酶或胃蛋白酶分别处理2hr后，仍有95%以上的残余酶活力。

一种编码上述葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5的基因GOD-MT5，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

一种重组表达载体，所述重组载体包含上述的葡萄糖氧化酶基因GOD、GOD-OP、 GOD-MT5中的任意一种。

一种重组基因工程菌株，所述重组基因工程菌株包含上述的重组表达载体。进一步的，所述重组基因工程菌株以毕氏酵母细胞X33为宿主细胞。

上述一种葡萄糖氧化酶基因GOD的制备方法，包括以下步骤：黑曲霉CGMCC 3.4523菌体培养，RNA提取，ds cDNA合成；然后设计引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，获得葡萄糖氧化酶GOD的编码基因。

上述一种葡萄糖氧化酶突变体基因GOD-MT5的制备方法，包括以下步骤：通过对优化基因GOD-OP进行理性分析和设计选定突变点，设计突变引物，然后逐步进行PCR扩增，最终获得具有6个突变点的葡萄糖氧化酶突变体基因GOD-MT5。

上述一种重组载体的制备方法，包括以下步骤：将上述葡萄糖氧化酶编码基因GOD、GOD-OP和GOD-MT5经EcoR I和Not I双酶切后，分别与同样经过EcoR I和Not I双酶切的pPICZα载体连接，分别得到酵母重组表达载体GOD/pPICZα、GOD-OP/pPICZα和GOD-MT5/pPICZα。

上述一种重组基因工程菌株的制备方法，包括以下步骤：将上述的重组载体分别经过电转化转入宿主细胞，然后经过平板筛选获得含有重组载体的阳性转化子，由此获得葡萄糖氧化酶毕赤酵母重组细胞GOD/pPICZα/X33、GOD-OP/pPICZα/X33和GOD-MT5/pPICZα/X33。

一种重组葡萄糖氧化酶的制备方法，包括以下步骤：培养上述重组基因工程菌株，诱导葡萄糖氧化酶基因的表达，收获表达产物。

上述一种葡萄糖氧化酶GOD在制备饲料添加剂、食品添加剂中的应用。

上述一种葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5在制备饲料添加剂、食品添加剂中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明通过酶学性质检验对葡萄糖氧化酶GOD及其突变体GOD-MT5的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性及比活力进行分析，证明本发明的葡萄糖氧化酶GOD及其突变体GOD-MT5具有很好的pH稳定性、良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力，能够很好的满足和适应饲料和食品行业对该产品的应用要求。

附图说明

图1：黑曲霉CGMCC 3.4523总RNA电泳图；泳道M为Maker，泳道1为CGMCC 3.4523总RNA。

图2：黑曲霉CGMCC 3.4523 GOD基因电泳图；泳道M为Maker，泳道1为克隆的黑曲霉葡萄糖氧化酶GOD的DNA 。

图3：重组毕氏酵母葡萄糖氧化酶5L罐上发酵液电泳分析；泳道M为Maker，泳道1为重组葡萄糖氧化酶GOD，泳道2为重组葡萄糖氧化酶GOD-OP，泳道3为重组葡萄糖氧化酶GOD-MT5。

图4：重组葡萄糖氧化酶GOD-OP和GOD-MT5的最适反应pH对比分析。

图5：重组葡萄糖氧化酶GOD-OP和GOD-MT5的pH耐受性分析。

图6：重组葡萄糖氧化酶GOD-OP和GOD-MT5的最适反应温度对比分析。

图7：重组葡萄糖氧化酶GOD-OP和GOD-MT5的温度耐受性分析。

图8：重组葡萄糖氧化酶GOD-OP和GOD-MT5的蛋白酶抗性分析。

图9：重组葡萄糖氧化酶GOD-OP和GOD-MT5的体外产酸效果测试。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步阐述和充分说明本发明。但这些实施例仅是示范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

以下实施例中所用到的实验材料及实验方法如下：

1. 菌株和载体

黑曲霉CGMCC 3.4523购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌JM109、DH5α及表达载体pET28a(+)均购自安诺伦（北京）生物科技有限公司；毕氏酵母（Pichiapastoris）X33及表达载体pPICZα均购自美国英杰生命技术有限公司。

2. 酶类及其他生化试剂

PTM1：30mM硫酸铜，0.54mM碘化钠，17.6mM硫酸锰，0.80mM钼酸钠，0.32mM硼酸，2.4mM氯化钴，0.18mM氯化锌，0.24mM硫酸亚铁，1.6mM生物素，0.19M硫酸。

限制性内切酶EcoR I和Not I、DNA Maker、Protein Maker、T4连接酶、Primescript double strand cDNA synthesis kit均购自宝日医生物技术（大连）有限公司；pfu DNA合成酶购自富酶泰斯生物技术（深圳）有限公司；SanPreP Column PlasmidMini-Preps Kit、SanPreP Column DNA Gel Extraction Kit、胶回收试剂盒和PCR产物回收试剂盒均购自生物工程（上海）股份有限公司；RNA抽提试剂盒RNeasy Mini Kit（cat.nos. 74104）购自凯杰企业管理（上海）有限公司；琼胶购自美国英杰生命技术有限公司。

其他常规试剂均为国产或进口。

3. 培养基

发酵基本培养基：26.2ml/L磷酸，0.80g/L硫酸钙，18.7g/L硫酸钾，15.5g/L硫酸镁，4.17g/L氢氧化钾，40g/L葡萄糖。

除发酵基本培养基，以下实施例中使用的其他培养基均参照美国英杰生命技术有限公司毕氏酵母操作手册进行配制。

4. 实验方法

本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用（第二版）；朱检等，生物化学实验[M]。

本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指葡萄糖氧化酶活性，均采用邻联茴香胺分光光度法。在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。在460nm下测定反应液吸光值，依据标准曲线计算葡萄糖氧化酶的酶活。

实施例1 葡萄糖氧化酶编码基因的克隆

1. RNA提取

挑取黑曲霉CGMCC 3.4523冻存菌种在PDA平板上划线并于30℃培养3d；挑取菌丝在50mL含有4%（w/v）葡萄糖的PDA培养基上，30℃、200rpm过夜培养；然后12000rpm离心10min收集菌体；将菌体沉淀物转移至研钵中，加液氮，研磨成粉末状；用RNA抽提试剂盒RNeasy Mini Kit进行RNA提取，将提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示；以oligo dT为引物，用Primescript double strand cDNA synthesis kit进行ds cDNA合成；最后用胶回收试剂盒进行纯化获得RNA。oligo dT引物序列如下：

oligo dT（SEQ ID NO.1）5'-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTT)-3'

2. 基因克隆

以上述的cDNA为模板，用pfu DNA合成酶及引物GOD F和GOD R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，52℃ 30sec，72℃ 1min30sec，30个循环；72℃ 6min30sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（见图2），并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。然后用限制性内切酶EcoR I和Not I进行分步酶切，酶切产物用PCR回收试剂盒回收后，用T4连接酶与经过相同酶切的质粒pPICZα片段连接，16℃连接过夜后，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，LB平板筛选得到阳性菌落（以Amp为抗性）GOD/pPICZα/DH5α。用质粒提取试剂盒从阳性菌落的培养物中提取质粒，送上海英骏生物技术有限公司进行测序。由此获得葡萄糖氧化酶的编码基因GOD，其基因序列如SEQ ID NO.2所示，相应的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。引物GOD F和GOD R的核苷酸序列如下：

GOD F（SEQ ID NO.4）：5'-actgaattcCCTAGGGGAATTGAAGCAAGCCTC-3'（小写部分为为引入EcoR I的酶切位点及改变引物的GC含量和退火温度所补充的碱基）

GOD R（SEQ ID NO.5）：5'-atcacgacggcggccgcTCACTGCATAGAAGC-3'（小写部分为为引入Not I的酶切位点及改变引物的退火温度所补充的碱基）

实施例2 葡萄糖氧化酶编码基因的优化

首先对从黑曲霉CGMCC 3.4523中克隆获得的葡萄糖氧化酶原始基因GOD的序列进行分析，在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率的调整、GC 含量的平衡及不稳定序列的删除，并按照巴斯德毕氏酵母的密码子偏好对葡萄糖氧化酶编码基因GOD进行优化。

黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶原基因GOD全长1746bp，共编码581个氨基酸和1个终止子，GC含量为58.08%（G25.89%，A20.68%，T21.25%，C32.19%）。优化后的葡萄糖氧化酶基因GOD-OP的GC含量为54.81%（G25.09%，A21.76%，T23.42%，C29.73%），共改变了119个碱基，涉及40个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。优化后的葡萄糖氧化酶基因GOD-OP与葡萄糖氧化酶原基因GOD所编码的氨基酸序列完全相同，即葡萄糖氧化酶基因GOD-OP可编码葡萄糖氧化酶GOD。

实施例3 葡萄糖氧化酶的分子改造

1. 突变点选取

通过多序列比对分析、酶分子功能/结构域分析及酶分子稳定性及热力学分析，选取6个突变点：N11E、T165K、R185D、S360T、T502Q、S570A，对葡萄糖氧化酶基因GOD-OP进行定点突变。突变方案如下：

N11E：SEQ ID NO.6所示第31-33位AAC突变为GAG；

T165K：SEQ ID NO.6所示第493-495位ACC突变为AAA；

R185D：SEQ ID NO.6所示第553-555位AGG突变为GAT；

S360T：SEQ ID NO.6所示第1078-1080位TCC突变为ACC；

T502Q：SEQ ID NO.6所示第1504-1506位ACT突变为CAA；

S570A：SEQ ID NO.6所示第1708-1710位TCG突变为GCG。

2. 引物设计

根据上述突变点位置及方案，以优化后的编码基因GOD-OP（SEQ ID NO.6）为出发模板，设计突变所需的引物，并引入酶切位点，具体如下：

全序列上下游引物：

GOD-OP F（SEQ ID NO.7）：5'-actgaattcGGTATTGAGGCCAGCCTCCTG-3'（小写部分为为引入EcoR I的酶切位点及改变引物的GC含量和退火温度所补充的碱基）

GOD-OP R（SEQ ID NO.8）：5'-actgcggccgcTCACTGCATAGAAGCGTAATCTTC C-3'（小写部分为为引入Not I的酶切位点及改变引物的退火温度所补充的碱基）

突变点引物：

GOD-11 F（SEQ ID NO.9）：

5'-actgaattcGGTATTGAGGCCAGCCTCCTGACAGACCCCGAGGATGTCTCCGGCCGCACCGTTG-3'（小写部分为为引入EcoR I的酶切位点及改变引物的GC含量和退火温度所补充的碱基，划线部分为引入的突变点）

GOD-165 F（SEQ ID NO.10）：5'-CCTGTCATGGTAAAAATGGAACTGTCCACGCCG-3'（划线部分为引入的突变点）

GOD-165 R（SEQ ID NO.11）：5'-CAGTTCCATTTTTACCATGACAGGAAGCGTTG-3'

GOD-185 F（SEQ ID NO.12）：5'-CTCCAATCGTCGATGCTCTCATGAGCGCTGTTG-3'（划线部分为引入的突变点）

GOD-185 R（SEQ ID NO.13）：5'-CATGAGAGCATCGACGATTGGAGAGTAGTCATCG-3'

GOD-360 F（SEQ ID NO.14）：5'-GGTGACTACACCGAAAAGGCACATGAGCTGCC-3'（划线部分为引入的突变点）

GOD-360 R（SEQ ID NO.15）：5'-GCCTTTTCGGTGTAGTCACCAAAGGTTTCGTTG-3'

GOD-502 F（SEQ ID NO.16）：

5'-GAGCGCCTGGCAAGAATACATCCCGTACCACTTCCGTC-3'（划线部分为引入的突变点）

GOD-502 R（SEQ ID NO.17）：5'-GATGTATTCTTGCCAGGCGCTCAAATCGGCATC-3'

GOD-570-R（SEQ ID NO.18）：

5'-actGCGGCCGCTCACTGCATAGAAGCGTAATCTTCCAAGATAGCATCCGCAATCTTCAACGCCATAGCG-3'（划线部分为引入的突变点）

3. 突变体扩增

以实施例2中优化后的葡萄糖氧化酶基因GOD-OP（SEQ ID NO.6）为模板，用引物GOD-11 F和GOD-570 R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，55℃ 30sec，72℃1min40sec，30个循环；72℃ 6min30sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。获得含突变位点N11E和S570A的葡萄糖氧化酶基因GOD-MT1。

以含突变位点N11E和S570A的葡萄糖氧化酶基因GOD-MT1为模板，分别用引物GOD-OP F和GOD-165 R与GOD-165 F和GOD-OP R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，55℃ 30sec，72℃ 1min20sec，30个循环；72℃ 6min10sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。分别获得512bp和1276bp大小的葡萄糖氧化酶基因片段。然后以两种PCR产物的混合物作为模板，用引物GOD-OP F和GOD-OP R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，55℃ 30sec，72℃ 1min40sec，30个循环；72℃6min30sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。获得含突变位点N11E、T165K和S570A的葡萄糖氧化酶基因GOD-MT2。

以含突变位点N11E、T165K和S570A的葡萄糖氧化酶基因GOD-MT2为模板，分别用引物GOD-OP F和GOD-185 R与GOD-185 F和GOD-OP R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃20sec，55℃ 30sec，72℃ 1min20sec，30个循环；72℃ 6min10sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。分别获得573bp和1216bp大小的葡萄糖氧化酶基因片段。然后以两种PCR产物的混合物作为模板，用引物GOD-OP F和GOD-OP R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，55℃ 30sec，72℃ 1min40sec，30个循环；72℃6min30sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。获得含突变位点N11E、T165K、R185D和S570A的葡萄糖氧化酶基因GOD-MT3。

以含突变位点N11E、T165K、R185D和S570A的葡萄糖氧化酶基因GOD-MT3为模板，分别用引物GOD-OP F和GOD-360 R与GOD-360 F和GOD-OP R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，55℃ 30sec，72℃ 1min10sec，30个循环；72℃ 6min10sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。分别获得1097bp和689bp大小的葡萄糖氧化酶基因片段。然后以两种PCR产物的混合物作为模板，用引物GOD-OP F和GOD-OPR进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，55℃ 30sec，72℃ 1min40sec，30个循环；72℃ 6min30sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。获得含突变位点N11E、T165K、R185D、S360T和S570A的葡萄糖氧化酶基因GOD-MT4。

以含突变位点N11E、T165K、R185D、S360T和S570A的葡萄糖氧化酶基因GOD-MT4为模板，分别用引物GOD-OP F和GOD-502 R与GOD-502 F和GOD-OP R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，55℃ 30sec，72℃ 1min30sec，30个循环；72℃ 6min30sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。分别获得1525bp和264bp大小的葡萄糖氧化酶基因片段。然后以两种PCR产物的混合物作为模板，用引物GOD-OP F和GOD-OP R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，55℃ 30sec，72℃1min40sec，30个循环；72℃ 6min30sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。得含突变位点N11E、T165K、R185D、S360T、T502Q和S570A的葡萄糖氧化酶基因GOD-MT5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所对应的氨基酸序列如SEQ IDNO.20所示。

实施例4 突变体鉴定

将葡萄糖氧化酶基因GOD-MT5的PCR扩增产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶EcoR I和Not I进行分步酶切，酶切产物用PCR产物回收试剂盒回收后，用T4连接酶与经过相同酶切的质粒pPICZα片段连接，16℃连接过夜后，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，LB平板筛选得到阳性菌落（以Amp为抗性）GOD-MT5/pPICZα/DH5α。用质粒提取试剂盒从阳性菌落的培养物中提取质粒，送上海英骏生物技术有限公司进行测序。测序使用通用引物5’AOX1和3’AOX1，测序结果表明获得的GOD-MT5基因序列与预期设计完全一致。用VectorNTI软件对突变体GOD-MT5的氨基酸序列进行分析，得到其理论分子量和理论等电点pI值分别为63.11kDa和4.62。通用引物5'AOX1和3'AOX1的核苷酸序列如下：

5'AOX1（SEQ ID NO.21）：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'

3'AOX1（SEQ ID NO.22）：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'

实施例5 毕氏酵母重组工程菌株的构建

将实施例1和实施例4所制备的GOD/pPICZα/DH5α和GOD-MT5/pPICZα/ DH5α分别接种到LB培养基，37℃过夜培养，然后用质粒抽提试剂盒提取获得质粒GOD/pPICZα和GOD-MT5/pPICZα，分别用限制性内切酶Bgl II 酶切，胶回收纯化大片段，即得到酵母转化所需含突变基因的线性DNA，然后分别用电转化法将上述线性DNA转化至毕赤酵母菌株X33，经筛选和鉴定获得重组毕赤酵母菌株GOD/pPICZα/X33和GOD-MT5/pPICZα/X33。

以实施例2优化后的葡萄糖氧化酶基因GOD-OP为模板，用实施例3中的引物GOD-OPF和GOD-OP R进行扩增，PCR条件为：95℃ 3min；95℃ 20sec，55℃ 30sec，72℃ 1min40sec，30个循环；72℃ 6min30sec。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目标产物条带。用限制性内切酶EcoR I和Not I进行分步酶切，酶切产物用PCR回收试剂盒回收后，用T4连接酶与经过相同酶切的质粒pPICZα片段连接，16℃连接过夜后，用电转化法将其转化至毕赤酵母菌株X33，经筛选和鉴定获得重组毕赤酵母菌株GOD-OP/pPICZα/X33。

实施例6 毕氏酵母发酵制备重组葡萄糖氧化酶

取实施例5所构建的重组毕氏酵母菌株GOD/pPICZα/X33、GOD-OP/pPICZα/X33和GOD-MT5/pPICZα/X33，分别接种于150ml YPD培养液中，30℃、250rpm振荡培养至OD_600nm＝0.3-0.5（约20h），然后分别接种于3L发酵基本培养基（26.2ml/L磷酸，0.80g/L硫酸钙，18.7g/L硫酸钾，15.5g/L硫酸镁，4.17g/L氢氧化钾，40g/L葡萄糖）中，各自于容积为5L的发酵罐中进行发酵。

在起始菌体生长阶段，过程中用25％（v/v）的氨水调节pH，使其维持在6.5-6.6，并且以4.0ml/h的速度流加PTM1，进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24h，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100％，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80％，此时菌湿重可达到85-95g/L。

进入碳源饲喂阶段，以25ml/hr的速度流加用蒸馏水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持续流加4-6h，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到该阶段的末期，菌湿重可达到160-170g/L。

进入诱导阶段，以10-15ml/h的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量搅拌转速，使溶氧维持在20％上下。发酵到达189h时，菌湿重可达到290-320g/L，葡萄糖氧化酶GOD、GOD-OP和GOD-MT5的表达水平（以发酵液上清的酶活力表示）分别达到380U/mL、4175U/mL和4250U/mL，SDS-PAGE分析结果显示GOD-OP和GOD-MT5的目标蛋白量显著高于GOD（见图3），这说明黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因及其突变体基因均在毕氏酵母中得到了表达。

实施例7 重组葡萄糖氧化酶的酶学性质表征

分别将实施例6所制备的重组葡萄糖氧化酶GOD-OP和GOD-MT5在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液的pH范围为3.0-9.0（pH3.0-8.0范围内采用50mMNa₂HPO₄-C₆H₈O₇缓冲液，pH8.0-9.0采用50mM Gly-NaOH缓冲液）。葡萄糖氧化酶在不同的pH的缓冲液中、30℃下测定酶活性结果表明GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶的最适pH分别为4.0和4.0-6.0（见图4）。分别将GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶发酵液用不同pH值的缓冲液（pH2.0-10.0）稀释5倍后置于室温下处理60min，然后再用pH6.0的缓冲液稀释适当倍数后测定残余酶活性以研究葡萄糖氧化酶的pH稳定性。结果表明，在pH2.0下处理60min，GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶分别有59.7%和75.2%的残余酶活力；在pH3.0-7.0的范围内处理60min，GOD-OP和GOD-MT5均能保持90%以上的残余酶活力；两者在pH10.0下处理60min，仍有50%左右的残余酶活力（见图5）。这说明该葡萄糖氧化酶具有很广泛的pH适用范围和很好的pH稳定性，相对而言，突变体GOD-MT5具有更宽的pH适用范围和更好的酸耐受性。

在磷酸氢二钠-柠檬酸（pH6.0，50mM）缓冲体系及不同温度下（30℃-80℃）进行酶促反应，以测定最适反应温度。结果表明，GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶的最适反应温度均为30-60℃（图6）。在不同温度下（60℃-90℃）处理酶3min后测定残余酶活性，以进行热稳定性研究。结果表明，在70℃下内处理3min，GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶的残余酶活力分别为40.8%和81.1%；在75℃下内处理3min，GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶的残余酶活力分别为11.1%和67.9%；在80℃下内处理3min，GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶的残余酶活力分别为0%和40.5%；在85℃和90℃下处理3min，GOD-MT5葡萄糖氧化酶仍有19.5%和8.3%的残余酶活力（图7）。说明GOD-MT5葡萄糖氧化酶的耐热性比GOD-OP有显著的提升。

分别在GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶溶液中加入0.05ml胰蛋白酶（0.1mg/mL，用pH7.0 PBS缓冲液配置）或胃蛋白酶（0.1mg/ml，用pH2.0甘氨酸-HCL缓冲液配置），于37℃处理120min，用pH6.0的缓冲液做适当稀释后再测定葡萄糖氧化酶活性。经胰蛋白酶或胃蛋白酶分别处理2h后，GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶的残余酶活力均在95%以上（图8），说明该葡萄糖氧化酶具有较好的抗蛋白酶水解能力。

实施例8 体外反应产酸效果测试

分别向0.18g/mL的葡萄糖溶液中加入GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶，使溶液中最终的葡萄糖氧化酶酶活力均为1.5U/mL。然后置于恒温震荡水浴中37℃、150r/min进行反应6h。过程中每隔1h，测定一次反应液的pH，通过pH值的降低来判断酶促反应的产算量，从而对比葡萄糖氧化酶的产酸能力。结果表明，GOD-OP和GOD-MT5葡萄糖氧化酶均有较高的反应速率和产酸效果，能够在1h内使pH降低至3以下（图9）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建福大百特生物科技有限公司

<120> 一种葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和高效重组表达

<130>

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

dttttttttt ttttttttt 19

<210> 2

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaattgaag caagcctcct gactgatccc aacgatgtct ccggccgcac ggtcgactac 60

atcatcgctg gtggaggtct gactggactc accaccgctg ctcgtctgac ggagaacccc 120

aacatcagtg tgctcgtcat cgaaagtggc tcctacgagt cggacagagg tcctatcatt 180

gaggacctga acgcctacgg cgacatcttt ggcagcagtg tagaccacgc ctacgagacc 240

gtggagctcg ctaccaacaa tcaaactgcg ctgatccgct ccggaaatgg tctcggtggc 300

tctactctag tgaatggtgg cacctggact cgcccccaca aggctcaggt tgactcctgg 360

gagactgtct ttggaaatga gggctggaac tgggacaatg tggccgccta ctccctccag 420

gctgagcgtg ctcgcgcacc aaatgccaaa cagatcgctg ctggccacta cttcaacgca 480

tcctgtcatg gtaccaatgg tactgtccat gccggacccc gtgacaccgg cgatgactat 540

tcccccatcg tcagggctct catgagcgct gtcgaagacc ggggcgttcc caccaagaag 600

gacttcggat gcggtgaccc tcatggtgtg tccatgttcc ccaacacctt gcacgaagac 660

caagttcgct ccgatgccgc tcgcgaatgg ctccttccca actaccaacg tcccaacctg 720

caagtcctga ccggacaata tgttggtaag gtgctcctta gccagaacgg caccacccct 780

cgtgctgtcg gcgtggaatt cggcacccac aagggcaaca cccacaacgt ttacgctaag 840

cacgaggtcc tcctggccgc gggctccgct gtctctccca caatcctgga atattccggt 900

atcggaatga agtccatcct ggagcccctt ggtatcgaca ccgtcgttga cctgcccgtc 960

ggcctgaacc tgcaggacca gaccaccgct accgtccgca gccgcatcac ctctgctggt 1020

gccggacagg gtcaggctgc ttggttcgcc accttcaacg agacctttgg tgactattcc 1080

gaaaaggcac acgagctgcc caacaccaag ctggagcagt gggccgaaga ggccgtcgcc 1140

cgtggcggat tccacaacac caccgccttg ctcatccagt acgagaacta ccgcgactgg 1200

attgtcaacc acaacgtcgc gtactcggaa ctcttcctcg acactgccgg agtggccagc 1260

ttcgatgtgt gggaccttct gcccttcacg agaggatacg tccacatcct cgacaaggac 1320

ccctacctcc accacttcgc ctacgaccct cagtacttcc tcaacgagct cgacctgctc 1380

ggtcaggctg ccgctactca gctggcccgc aacatctcca actccggtgc catgcagacc 1440

tacttcgctg gggagactat ccccggtgat aaccttgcgt atgatgccga tttgagcgcc 1500

tggactgagt acatcccgta ccacttccgt cctaactacc atggcgtggg tacttgctcc 1560

atgatgccga aggagatggg cggtgttgtc gataatgctg cccgtgtgta tggtgtgcag 1620

ggactgcgtg tcattgatgg ttctattccc cctacgcaga tgtcgtccca tgtcatgacg 1680

gtgttctacg ccatggcgtt gaaaatttcg gatgctatct tggaggatta cgcttctatg 1740

cagtga 1746

<210> 3

<211> 581

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Asn Asp Val Ser Gly Arg

1 5 10 15

Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr

20 25 30

Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu

35 40 45

Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn

50 55 60

Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr

65 70 75 80

Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn

85 90 95

Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro

100 105 110

His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly

115 120 125

Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala

130 135 140

Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala

145 150 155 160

Ser Cys His Gly Thr Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr

165 170 175

Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Arg Ala Leu Met Ser Ala Val Glu

180 185 190

Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His

195 200 205

Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser

210 215 220

Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu

225 230 235 240

Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn

245 250 255

Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly

260 265 270

Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly

275 280 285

Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys

290 295 300

Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val

305 310 315 320

Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile

325 330 335

Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe

340 345 350

Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu Pro Asn

355 360 365

Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe

370 375 380

His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp

385 390 395 400

Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala

405 410 415

Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly

420 425 430

Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr

435 440 445

Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala

450 455 460

Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr

465 470 475 480

Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala

485 490 495

Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn

500 505 510

Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly

515 520 525

Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val

530 535 540

Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val Met Thr

545 550 555 560

Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp

565 570 575

Tyr Ala Ser Met Gln

580

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actgaattcc ctaggggaat tgaagcaagc ctc 33

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcacgacgg cggccgctca ctgcatagaa gc 32

<210> 6

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtattgagg ccagcctcct gacagacccc aacgatgtct ccggccgcac cgttgactac 60

atcattgctg gtggaggtct gaccggactc accactgccg ctcgtttgac ggaaaatccc 120

aacatcagtg ttctcgtcat cgagagtggc tcttacgagt ctgacagagg tcctattatc 180

gaggacttga acgcttacgg cgacattttt ggcagcagtg ttgaccatgc ctacgagaca 240

gtggagctcg ctaccaacaa tcagactgcg ttgatccgct ccggaaatgg tctcggtgga 300

tctactctag tgaatggtgg tacctggact cgcccacaca aggctcaggt tgactcttgg 360

gagactgtct ttggaaacga gggctggaac tgggataatg tggcagccta ctccctccaa 420

gctgaacgtg ctcgcgctcc aaatgctaag caaatcgctg ctggccatta cttcaacgct 480

tcctgtcatg gtaccaatgg aactgtccac gccggacccc gcgacactgg cgatgactac 540

tctccaatcg tcagggctct catgagcgct gttgaagacc ggggagtccc caccaagaag 600

gacttcggat gtggtgaccc ccatggtgtg tccatgttcc caaacacatt gcacgaagac 660

caagttcgct ctgatgccgc tcgcgaatgg ctacttccaa actaccaacg tccaaacctg 720

caggtcctga ctggacagta tgttggtaag gtgctcctta gccaaaacgg cactacccct 780

cgtgctgtcg gcgtggagtt cggcacccac aagggtaaca cccacaacgt ttacgctaag 840

catgaggtcc tcttggccgc gggttccgct gtttctccca ccatcctcga atattccgga 900

atcggtatga agtccattct ggagcccctt ggtattgaca ccgtcgttga tctgccagtc 960

ggtttgaacc tgcaggacca gactaccgct accgtccgct cccgcatcac ctctgctggt 1020

gcaggacaag gtcaggctgc atggttcgcc accttcaacg aaacctttgg tgactactcc 1080

gaaaaggcac atgagctgcc caacaccaag ctggaacagt gggccgaaga ggccgttgcc 1140

cgtggtggat tccacaatac cactgccttg ctcatccaat acgagaacta ccgcgactgg 1200

attgtcaacc acaacgttgc gtactcggaa ctcttcctcg acaccgccgg agtagccagc 1260

ttcgatgttt gggaccttct gcccttcacc agaggatacg ttcacatcct cgataaggac 1320

ccctaccttc accacttcgc ctacgaccct cagtacttcc tcaacgagct ggacctgctc 1380

ggtcaagctg ccgctactca actggcccgc aacatctcca actccggtgc catgcagacc 1440

tacttcgctg gtgagactat cccaggtgat aacctcgcgt atgatgccga tttgagcgcc 1500

tggactgaat acatcccgta ccacttccgt cctaactacc atggcgtggg tacttgctcc 1560

atgatgccga aggagatggg aggtgttgtc gataatgctg cccgtgtgta tggagtgcag 1620

ggactgcgtg tcattgatgg ttctattcct cctacgcaaa tgtcgtccca tgtcatgacg 1680

gtgttctacg ctatggcgtt gaagatttcg gatgctatct tggaagatta cgcttctatg 1740

cagtga 1746

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

actgaattcg gtattgaggc cagcctcctg 30

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actgcggccg ctcactgcat agaagcgtaa tcttcc 36

<210> 9

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

actgaattcg gtattgaggc cagcctcctg acagaccccg aggatgtctc cggccgcacc 60

gttg 64

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctgtcatgg taaaaatgga actgtccacg ccg 33

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagttccatt tttaccatga caggaagcgt tg 32

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctccaatcgt cgatgctctc atgagcgctg ttg 33

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

catgagagca tcgacgattg gagagtagtc atcg 34

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggtgactaca ccgaaaaggc acatgagctg cc 32

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccttttcgg tgtagtcacc aaaggtttcg ttg 33

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gagcgcctgg caagaataca tcccgtacca cttccgtc 38

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatgtattct tgccaggcgc tcaaatcggc atc 33

<210> 18

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

actgcggccg ctcactgcat agaagcgtaa tcttccaaga tagcatccgc aatcttcaac 60

gccatagcg 69

<210> 19

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggtattgagg ccagcctcct gacagacccc gaggatgtct ccggccgcac cgttgactac 60

atcattgctg gtggaggtct gaccggactc accactgccg ctcgtttgac ggaaaatccc 120

aacatcagtg ttctcgtcat cgagagtggc tcttacgagt ctgacagagg tcctattatc 180

gaggacttga acgcttacgg cgacattttt ggcagcagtg ttgaccatgc ctacgagaca 240

gtggagctcg ctaccaacaa tcagactgcg ttgatccgct ccggaaatgg tctcggtgga 300

tctactctag tgaatggtgg tacctggact cgcccacaca aggctcaggt tgactcttgg 360

gagactgtct ttggaaacga gggctggaac tgggataatg tggcagccta ctccctccaa 420

gctgaacgtg ctcgcgctcc aaatgctaag caaatcgctg ctggccatta cttcaacgct 480

tcctgtcatg gtaaaaatgg aactgtccac gccggacccc gcgacactgg cgatgactac 540

tctccaatcg tcgatgctct catgagcgct gttgaagacc ggggagtccc caccaagaag 600

gacttcggat gtggtgaccc ccatggtgtg tccatgttcc caaacacatt gcacgaagac 660

caagttcgct ctgatgccgc tcgcgaatgg ctacttccaa actaccaacg tccaaacctg 720

caggtcctga ctggacagta tgttggtaag gtgctcctta gccaaaacgg cactacccct 780

cgtgctgtcg gcgtggagtt cggcacccac aagggtaaca cccacaacgt ttacgctaag 840

catgaggtcc tcttggccgc gggttccgct gtttctccca ccatcctcga atattccgga 900

atcggtatga agtccattct ggagcccctt ggtattgaca ccgtcgttga tctgccagtc 960

ggtttgaacc tgcaggacca gactaccgct accgtccgct cccgcatcac ctctgctggt 1020

gcaggacaag gtcaggctgc atggttcgcc accttcaacg aaacctttgg tgactacacc 1080

gaaaaggcac atgagctgcc caacaccaag ctggaacagt gggccgaaga ggccgttgcc 1140

cgtggtggat tccacaatac cactgccttg ctcatccaat acgagaacta ccgcgactgg 1200

attgtcaacc acaacgttgc gtactcggaa ctcttcctcg acaccgccgg agtagccagc 1260

ttcgatgttt gggaccttct gcccttcacc agaggatacg ttcacatcct cgataaggac 1320

ccctaccttc accacttcgc ctacgaccct cagtacttcc tcaacgagct ggacctgctc 1380

ggtcaagctg ccgctactca actggcccgc aacatctcca actccggtgc catgcagacc 1440

tacttcgctg gtgagactat cccaggtgat aacctcgcgt atgatgccga tttgagcgcc 1500

tggcaagaat acatcccgta ccacttccgt cctaactacc atggcgtggg tacttgctcc 1560

atgatgccga aggagatggg aggtgttgtc gataatgctg cccgtgtgta tggagtgcag 1620

ggactgcgtg tcattgatgg ttctattcct cctacgcaaa tgtcgtccca tgtcatgacg 1680

gtgttctacg ctatggcgtt gaagattgcg gatgctatct tggaagatta cgcttctatg 1740

cagtga 1746

<210> 20

<211> 581

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Glu Asp Val Ser Gly Arg

1 5 10 15

Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr

20 25 30

Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu

35 40 45

Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn

50 55 60

Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr

65 70 75 80

Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn

85 90 95

Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro

100 105 110

His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly

115 120 125

Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala

130 135 140

Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala

145 150 155 160

Ser Cys His Gly Lys Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr

165 170 175

Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Asp Ala Leu Met Ser Ala Val Glu

180 185 190

Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His

195 200 205

Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser

210 215 220

Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu

225 230 235 240

Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn

245 250 255

Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly

260 265 270

Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly

275 280 285

Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys

290 295 300

Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val

305 310 315 320

Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile

325 330 335

Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe

340 345 350

Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Thr Glu Lys Ala His Glu Leu Pro Asn

355 360 365

Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe

370 375 380

His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp

385 390 395 400

Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala

405 410 415

Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly

420 425 430

Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr

435 440 445

Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala

450 455 460

Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr

465 470 475 480

Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala

485 490 495

Asp Leu Ser Ala Trp Gln Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn

500 505 510

Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly

515 520 525

Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val

530 535 540

Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val Met Thr

545 550 555 560

Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu Glu Asp

565 570 575

Tyr Ala Ser Met Gln

580

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims

1.一种葡萄糖氧化酶GOD，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶GOD来源于黑曲霉CGMCC3.4523，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因GOD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶GOD的基因GOD-OP，其特征在于：所述基因GOD-OP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；该基因是通过结合密码子使用频率的调整、GC含量的平衡及不稳定序列的删除，并按照巴斯德毕氏酵母的密码子偏好对葡萄糖氧化酶编码基因GOD进行优化得到的。

3.一种葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5是通过将权利要求1所述葡萄糖氧化酶GOD的氨基酸序列中第11位氨基酸由N变为E、第165位氨基酸由T变为K、第185位氨基酸由R变为D、第360位氨基酸由S变为T、第502位氨基酸由T变为Q、第570位氨基酸由S变为A而获得的；所述葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。

4.根据权利要求3所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5具有如下特征：

①理论分子量为63.11kDa；

②理论pI值为4.62；

③最适pH范围为4.0-6.0，其中最高点为6.0；

④最适反应温度范围为30-60℃，其中最高点为40℃；

⑥在70℃、75℃、80℃、85℃和90℃下分别处理3min后，分别有81.1%、67.9%、40.5%、19.5%和8.3%的残余酶活力；且经胰蛋白酶或胃蛋白酶分别处理2h后，仍有95%以上的残余酶活力。

5.一种编码如权利要求3所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5的基因GOD-MT5，其特征在于：所述基因GOD-MT5的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

6.一种高效重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体携带基因GOD-OP、GOD-MT5中的任意一种。

7.一种重组基因工程菌株，其特征在于：所述重组基因工程菌株包含如权利要求6所述的重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的重组基因工程菌株，其特征在于：所述重组基因工程菌株以毕氏酵母X33为宿主细胞。

9.一种重组葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：培养如权利要求7所述的重组基因工程菌株，诱导葡萄糖氧化酶基因的表达，收获表达产物。

10.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶GOD在制备食品或饲料添加剂中的应用。

11.如权利要求3所述的葡萄糖氧化酶突变体GOD-MT5在制备食品或饲料添加剂中的应用。