CN113717965B - 一种链霉菌胰蛋白酶特异性改造的方法及其应用 - Google Patents

一种链霉菌胰蛋白酶特异性改造的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种链霉菌胰蛋白酶特异性改造的方法及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过在毕赤酵母中异源表达灰色链霉菌胰蛋白酶SGT，并对其进行突变，得到了两个能够显著提升对精氨酸特异性识别效率的突变体，使得突变体对Tos‑Gly‑Pro‑Arg‑AMC催化效率达到了36000ml‑1min‑1，适用于胰岛素及胰岛素类似物的生产，从而在工业中具有良好应用前景。

Description

一种链霉菌胰蛋白酶特异性改造的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种链霉菌胰蛋白酶特异性改造的方法及其应用，特别是一种对精氨酸底物识别特异性提高的重组菌株构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
链霉菌胰蛋白酶(SGT)(E.C.3.4.21.4)是一种来源于灰色链霉菌的碱性丝氨酸蛋白酶，能够专一的识别肽链内部的精氨酸(Arg)/赖氨酸(Lys)，并对其肽键羧基末端进行水解，是一种肽链内切酶。
胰蛋白酶主要由底物结合域，底物催化域，氧阴离子结合域组成。底物结合区域中Gly216-Gly226形成的Loop环为底物结合口袋，带负电荷的Asp189(D189)与底物中带正电的Arg或Lys形成强氢键实现特异性的识别(图1)；催化区域由催化三联体His57、Asp102和Ser195组成；氧阴离子结合域中His57接受质子生成正电荷与底物带负电的氮原子形成两个氢键进而稳定过渡态。
在将胰蛋白酶应用到胰岛素类似物的生产过程中时，研究发现会存在错切的情况，而错切的位点主要集中在赖氨酸(Lys)形成肽键的羧基末端(图2)。因此迫切的需要进行链霉菌蛋白酶的底物识别特异性的改造，来提升对于精氨酸识别的特异性。
发明内容
为了解决目前存在的问题，发明人对来源于灰色链霉菌的胰蛋白酶(SGT)进行改造，对其包含结晶体结构的序列第190位氨基酸(即SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第167位进行突变)，从而提升了胰蛋白酶对于精氨酸的识别效率，显著减少了错切的可能。
本发明提供了胰蛋白酶突变体，所述突变体是以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列为亲本序列，将其第167位取代成丙氨酸或丝氨酸。
本发明提供了编码所述突变体的基因。
在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了携带所述基因的载体。
在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pPIC9K、pPIC3K、pET系列载体、Duet系列、pGEX系列。
本发明提供了含有所述载体的微生物细胞。
在一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。
本发明提供了一种生产胰蛋白酶突变体的方法，所述方法是利用所述微生物细胞发酵生产胰蛋白酶。
在一种实施方式中，将所述微生物细胞在BMGY培养基中培养至OD600为4-6，收集菌体转接至新鲜的BMGY培养基，在发酵初始时及每隔24h按培养基体积的1％加入甲醇诱导表达，在28～30℃、700～750rpm培养不少于96h。
在一种实施方式中，将所述微生物细胞在YPD培养基上划线，在28～30℃下培养至长出单菌落，将单菌落接种至含1～1.5mL的YPD液体培养基中，28～30℃、700～750rpm培养过夜得到种子培养物，将种子培养物按体积比10％的量接种至BMGY培养基中培养至OD600为4-6。
本发明提供了一种生产胰岛素的方法，所述方法是以胰岛素前体为底物，将所述胰蛋白酶突变体按不少于1000U/mg底物的量添加至反应体系中，在23～25℃下水解18～20小时结束反应。
本发明提供了所述胰蛋白酶或所述基因或所述微生物细胞在生产胰岛素或胰岛素类似物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过对原始酶的特异性识别位点附近氨基酸做了突变，并采用了真核表达系统Pichia pastoris GS115，获得了两株能够显著提升对精氨酸识别特异性的菌株，其对精氨酸：赖氨酸底物识别催化比例分别达到6.5:1以及5.8:1，对照原始菌株的3.8:1比例有显著提高，且对Tos-Gly-Pro-Arg-AMC催化效率分别达到了36000ml-1min-1以及130000ml- 1min-1，分别为对照菌株的1.5倍以及0.5倍，并同时保持了其原有的良好性能，在工业生产中将会有巨大的应用潜力。
附图说明
图1为链霉菌胰蛋白酶底物结合以及催化结构域示意图。
图2为胰岛素类似物制备原理图。
图3为在毕赤酵母中表达的重组灰色链霉菌源胰蛋白酶SGT及其突变体T167A，T167S的发酵上清SDS-PAGE分析；其中，1：蛋白质Marker；2：P.pastoris-pPIC9K-SGT；3：P.pastoris-pPIC9K-SGT-T167A；4：P.pastoris-pPIC9K-T167S。
图4为诱导第96h，胰蛋白酶突变体对特异性底物Tos-Gly-Pro-Arg/Lys-AMC的催化比率。
图5为诱导第96h，灰色链霉菌源胰蛋白酶SGT及其突变体T167A和T167S的发酵上清特异性酶活分析。
图6为诱导第96h，灰色链霉菌源胰蛋白酶SGT及其突变体T167A和T167S的发酵上清的酰胺酶酶活。
图7为不同胰蛋白酶切割胰岛素前体制备胰岛素结果图。
具体实施方式
(一)菌株及载体
毕赤酵母表达载体pPIC9K及菌株Pichia pastoris GS115、Escherichia coliJM109购自于Novagen公司。
(二)酶类及其他生化试剂
T4 Polynucleotide激酶、T4 DNA连接酶、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶购于宝日医生物技术(北京)有限公司。限制性内切酶Sal I、DNA纯化试剂盒购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。质粒提取试剂盒、透明质酸(Hyaluronic acid)、G418抗生素、氨苄青霉素、卡那霉素、酵母氮源(YNB)购于生工生物工程(上海)有限公司；蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)购于英国OXOID公司，其余试剂为国产分析纯。
(三)培养基
LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH 7.0。固体培养基含20.0g/L琼脂。筛选E.coli克隆或者液体培养时，根据需要在培养基中添加终浓度为100μg/mL氨苄青霉素或50μg/mL卡那霉素。
YPD培养基(g/L)：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。固体培养基含20.0g/L琼脂。根据需要在培养基中添加终浓度为4mg/mL的G418用于筛选重组毕赤酵母拷贝数的转化子。
MD培养基(g/L)：葡萄糖20.0，酵母氮源(YNB)13.4，生物素4×10-4，琼脂20.0。
BMGY培养基(g/L)：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，酵母氮源(YNB)13.4，甘油10mL，生物素4×10-4，100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0。
BMMY培养基(g/L)：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，酵母氮源(YNB)13.4，甲醇10mL，生物素4×10-4，100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0。
大肠杆菌采用LB液体或固体培养基(按需要添加相应的抗生素)在37℃培养16h，液体培养转速为200rpm。毕赤酵母采用YPD或MD固体培养基在30℃培养48h，液体培养置于30℃，200rpm培养。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1：灰色链霉菌来源胰蛋白酶SGT及其突变体的构建
根据氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的，对其核苷酸序列按照毕赤酵母密码子偏好性进行优化，优化后的基因序列SEQ ID NO.2交由金唯智生物科技(苏州)有限公司合成，连接至表达载体pPIC9K的EcoR I和Not I酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K-SGT。接着，设计如表4所示的引物T167X-F和T167X-R，以质粒pPIC9K-SGT为模版，利用快速PCR技术，分别构建167位苏氨酸(Thr)的饱和突变。步骤如下：
(1)以质粒pPIC9K-SGT为模板，分别利用引物T167X-F和T167X-R进行饱和突变PCR克隆；
表1PCR反应体系如下
表2PCR扩增条件
(2)将上述PCR产物进行回收纯化，以如下反应体系将纯化后PCR产物进行5’磷酸化反应并在16℃连接过夜；
表3 5’磷酸化反应体系
(3)将上述连接产物转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落进行测序，得到重组菌E.coli JM109-pPIC9K-T167X。
表4引物序列表
上述得到的重组质粒pPIC9K-SGT、JM109-pPIC9K-T167X分别以如下反应体系在37℃线性化2h。
表5线性化体系
对上述的线性化片段进行回收纯化，纯化后的线性片段以电转方式转化至毕赤酵母GS115，菌悬液涂布于MD平板，30℃培养至单菌落出现，将单菌落挑至含有4mg/mL G418抗性的YPD平板，筛选基因高拷贝转化子，分别记为P.pastoris-pPIC9K-SGT、P.pastoris-pPIC9K-T167X。
实施例2：灰色链霉菌来源胰蛋白酶及其突变体的48深孔板发酵和特异性酶活检测
将重组子P.pastoris-pPIC9K-SGT、P.pastoris-pPIC9K-T167X、在YPD固体琼脂平板上划线，置于30℃恒温培养箱培养2-3天至长出单菌落。单菌落接种于含1.5mL YPD液体培养基的5mL 48深孔板，30℃750rpm培养过夜。种子培养物按10％接种量转接到1.5mLBMGY培养基(5mL 48深孔板)并置于30℃750rpm培养至OD600达到4-6，收集菌体并用0.9％NaCl清洗3次后转移至1.5mL BMMY诱导培养基(5mL 48深孔板)，加入1％(v/v)甲醇诱导表达，置于30℃750rpm培养96h，每间隔24h按1％(v/v)补充一次甲醇。
收集诱导第96h的发酵液上清，SDS-PAGE对发酵液蛋白进行分析。
(1)使用多肽底物Tos-Gly-Pro-Arg/Lys-AMC对胰蛋白酶酶活进行检测，具体方法如下：200μL的反应体系(180μL终浓度50mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液，含0.2mM Tos-Gly-Pro-Arg/Lys-AMC，20μL的粗酶液)在37℃保温5min后加入酶液，酶标仪测定λex390和λem460下的荧光值，增益值选择为55。底物识别效率定义由1mL粗酶液在1min内与底物反应释放的AMC产生的荧光吸收值作为参考。
重组SGT和部分重组胰蛋白酶的SDS-PAGE分析结果如图3所示，均与理论分子量大小25.6kDa保持一致。
测定重组子甲醇诱导第96h发酵液对特异性底物Tos-Gly-Pro-Arg/Lys-AMC的酶活，并进行测序，结果如图4所示，P.pastoris-pPIC9K-T167A和P.pastoris-pPIC9K-T167S的发酵上清液中的胰蛋白酶对底物精氨酸的底物识别效率比较高。
结果如图5所示，P.pastoris-pPIC9K-SGT、P.pastoris-pPIC9K-T167A、P.pastoris-pPIC9K-T167S发酵上清胰蛋白酶对精氨酸(Arg)底物识别效率分别为240000ml-1min-1、130000ml-1min-1、360000ml-1min-1，对Arg/Lys底物识别比例分别为3.8：1、6.5：1、5.8：1。
(2)酰胺酶酶活测定：
配置1mM BAPN的Tris-HCl缓冲液，取100ul的发酵液和900ul的底物反应液混合加入到光径为0.5cm的石英比色皿当中；反应温度为37℃，反应时间为3min，吸收波长为410nm。酶活单位的定义为410nm处酶活每分钟增加0.1为一个酶活单位U。
测定重组子甲醇诱导第96h发酵液对底物BAPNA的酶活，结果如图6所示，P.pastoris-pPIC9K-SGT、P.pastoris-pPIC9K-T167A、P.pastoris-pPIC9K-T167S的酰胺酶酶活分别为2.21U/mL，1.5U/mL，2.07U/mL。
实施例3：应用胰蛋白酶突变体生产胰岛素类似物
底物为重组胰岛素前体(recombinant human insulin precursor，rPI)，添加突变体T167A或T167S酰胺酶比酶活1200U/mg底物，在25℃下水解19小时，然后通过用HCl将pH值调节至3.0来停止。结果显示胰蛋白酶突变体T167A或T167S可成功制备胰岛素。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种链霉菌胰蛋白酶特异性改造的方法及其应用
<130> BAA211188A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Val Gly Gly Thr Arg Ala Ala Gln Gly Glu Phe Pro Phe Met Val
1 5 10 15
Arg Leu Ser Met Gly Cys Gly Gly Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ile Val
20 25 30
Leu Thr Ala Ala His Cys Val Ser Gly Ser Gly Asn Asn Thr Ser Ile
35 40 45
Thr Ala Thr Gly Gly Val Val Asp Leu Gln Ser Ser Ser Ala Val Lys
50 55 60
Val Arg Ser Thr Lys Val Leu Gln Ala Pro Gly Tyr Asn Gly Thr Gly
65 70 75 80
Ala Asp Trp Ala Leu Ile Lys Leu Ala Gln Pro Ile Asn Gln Pro Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ala Thr Thr Thr Ala Tyr Asn Gln Gly Thr Phe Thr Val
100 105 110
Ala Gly Trp Gly Ala Asn Ile Glu Gly Gly Ser Gln Gln Arg Tyr Leu
115 120 125
Leu Lys Ala Asn Val Pro Phe Val Ser Asp Ala Ala Cys Arg Ser Ala
130 135 140
Tyr Gly Asn Glu Leu Val Ala Asn Glu Glu Ile Cys Ala Gly Tyr Pro
145 150 155 160
Asp Thr Gly Gly Val Asp Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met
165 170 175
Phe Val Lys Asp Asn Ala Asp Glu Trp Ile Gln Val Gly Ile Val Ser
180 185 190
Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Thr Glu
195 200 205
Val Ser Thr Phe Ala Ser Ala Ile Ala Ser Ala Ala Arg Thr Leu
210 215 220
<210> 2
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcgtcggcg gaacccgcgc cgcccagggc gagttcccct tcatggtccg gctctccatg 60
ggctgcggcg gcgccctcta cgcccaggac atcgtcctca ccgccgccca ctgcgtgagc 120
ggatcgggca acaacacctc gatcaccgcc accggcggcg tcgttgatct ccagtcgtcc 180
agcgccgtca aggtccgctc caccaaggtc ctccaggccc ccggctacaa cggcaccggc 240
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cgcacgctct ga 672
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tgccgctccg cctacggcaa cgagcttgtg gccaacgagg agatttgcgc cggatacccc 480
gacactggtg gcgttgatgc ttgccagggt gactccggcg gcccgatgtt cgttaaggac 540
aacgccgacg agtggattca ggtcggcatc gtcagctggg gctacggctg cgcccggccc 600
ggctacccgg gtgtctacac cgaggtctcg accttcgctt ccgccatcgc ctcggccgcc 660
cgcacgctct ga 672
<210> 4
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcgtcggcg gaacccgcgc cgcccagggc gagttcccct tcatggtccg gctctccatg 60
ggctgcggcg gcgccctcta cgcccaggac atcgtcctca ccgccgccca ctgcgtgagc 120
ggatcgggca acaacacctc gatcaccgcc accggcggcg tcgttgatct ccagtcgtcc 180
agcgccgtca aggtccgctc caccaaggtc ctccaggccc ccggctacaa cggcaccggc 240
gctgactggg cgctcatcaa gctcgcccag cccatcaacc agcccacgct gaagatcgcc 300
accaccaccg cctacaacca gggcacgttc accgtcgccg gctggggcgc caacattgag 360
ggcggcagcc agcagcgcta cctgctcaag gccaacgtcc cattcgtctc cgacgccgcc 420
tgccgctccg cctacggcaa cgagcttgtg gccaacgagg agatttgcgc cggatacccc 480
gacactggtg gcgttgattc ctgccagggt gactccggcg gcccgatgtt cgttaaggac 540
aacgccgacg agtggattca ggtcggcatc gtcagctggg gctacggctg cgcccggccc 600
ggctacccgg gtgtctacac cgaggtctcg accttcgctt ccgccatcgc ctcggccgcc 660
cgcacgctct ga 672

Claims (10)

1.胰蛋白酶突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列为亲本序列，将其第167位取代成丙氨酸或丝氨酸。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体包括但不限于pPIC9K、pPIC3K、pET系列载体、Duet系列、pGEX系列。
5.含有权利要求2所述基因或权利要求3或4所述载体的微生物细胞。
6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。
7.一种生产胰蛋白酶突变体的方法，其特征在于，利用权利要求5或6所述微生物细胞发酵生产胰蛋白酶突变体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述微生物细胞在BMGY培养基中培养至OD600为4-6，收集菌体转接至新鲜的BMGY培养基，在发酵初始时及每隔20～24h按培养基体积的0.5～1％加入甲醇诱导表达，在28～30℃、700～750rpm培养不少于96h。
9.一种生产胰岛素的方法，其特征在于，以胰岛素前体为底物，将权利要求1所述胰蛋白酶突变体按不少于1000U/mg底物的量添加至反应体系中，在23～25℃下水解18～20小时结束反应。
10.权利要求1所述胰蛋白酶突变体或权利要求2所述基因或权利要求5或6所述微生物细胞在生产胰岛素或胰岛素类似物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104328102A (zh) * 2014-11-04 2015-02-04 江南大学 一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法
CN106893700A (zh) * 2017-04-19 2017-06-27 江南大学 一种人工设计自活化前导肽序列提高胰蛋白酶酶活的方法
CN112280770A (zh) * 2020-10-30 2021-01-29 江南大学 热稳定性提高的胰蛋白酶突变体

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