CN108660127B - 一种人工设计的青霉素g酰化酶原及其编码序列与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工设计的青霉素G酰化酶原及其编码序列与应用。本发明通过将野生型青霉素G酰化酶原的底物结合口袋附近的大侧链氨基酸中的一个以上突变为比突变前氨基酸更小的侧链氨基酸，减少底物结合位阻效应，促使底物能迅速进入活性口袋；同时将活性口袋中与底物‑活性中心距离较近的关键亲水性氨基酸或弱疏水性氨基酸中的一个以上突变为疏水性比突变前氨基酸更强的氨基酸，增加底物结合口袋周围的疏水性，减少水分子结合，减少水解，从减少水解和增加合成两方面增加S/H，最终大幅提高青霉素G酰化酶合成阿莫西林的能力。本发明提供了目前为止S/H最高的青霉素G酰化酶原，其在阿莫西林合成中的潜力大。

Description

一种人工设计的青霉素G酰化酶原及其编码序列与应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种人工设计的青霉素G酰化酶原及其编码序列与应用。
背景技术
青霉素酰化酶(E.C.3.5.1.11)是一种重要的工业酶，广泛应用于抗生素工业生产。由于这些酶的底物特异性不同，可以分为三类：青霉素G酰化酶(PGA)，青霉素V酰化酶(PVA)和氨苄青霉素酰化酶(AEH)。青霉素G酰化酶能催化水解青霉素G生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)或水解头孢霉素G生成7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)。此外，该酶还可以催化上述水解反应的逆反应，即在6-APA和7-ADCA母核上连接不同的侧链，生成不同类型的半合成抗生素，如阿莫西林等。但是不同来源的青霉素G酰化酶性质不同，一些酶倾向于催化分解反应，而另外一些倾向于催化合成反应。此外，青霉素G酰化酶还可以用于多肽合成和外消旋体溶解，具有很广的工业应用。
大肠杆菌青霉素G酰化酶酶原由pac基因编码，酶原由4部分组成：信号肽序列(26个氨基酸残基)，可以定位到大肠杆菌周质空间；青霉素G酰化酶α亚基(209个氨基酸残基)；连接肽(54个氨基酸残基)，可以辅助蛋白折叠和切割成成熟肽；青霉素G酰化酶β亚基(557个氨基酸残基)(Sudhakaran V K,Deshpande B S,Ambedkar S S,et al.ProcessBiochemistry,1992,27(3):131-143.)。酶原经过加工切除信号肽和连接肽，形成由α和β亚基组成的异二聚体。暴露出β亚基的丝氨酸(Srirangan K,Orr V,Akawi L,etal.Biotechnology Advances,2013,31(8):1319-1332)。酶原经过加工切除信号肽和连接肽，形成由α和β亚基组成的异二聚体成熟酶。成熟酶β亚基的第一个氨基酸-丝氨酸是酶催化中心，可以酶切底物的酰胺键，青霉素G酰化酶能催化水解青霉素G生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)。青霉素G酰化酶丝氨酸R基上的羟基与对羟基苯甘氨酸甲酯的羰基形成氢键，形成酶-酰基共价四面体中间体，当中间体遇到亲核试剂6-APA即发生耦合，形成阿莫西林。与此同时，水作为竞争性亲核试剂与亲核试剂6-APA竞争结合酰基，引起酶-酰基中间体的水解，产生不必要的副产物羧酸，会降低S/H，减少产物合成，同时消耗对羟基苯甘氨酸甲酯，增加阿莫西林酶法合成成本。
近年来，随着结构生物学的发展，青霉素G酰化酶的三维结构，其与底物的结合中心和结合方式已经研究的比较清楚。结合结构分析，很多研究者也做了很多工作突变青霉素G酰化酶，使其具有更高的合成酶活/水解酶活比值(S/H)。Senwen Deng等人(Deng S,SuE,Ma X,et al.Journal of Biotechnology,2015,199:62-68.)将粪产碱菌PGAβ24F分别突变成G、A、S和P可以增加氨苄西林S/H比值，从0.49分别提升到4.2、2.07、1.31、0.74。Alkema等人将大肠杆菌野生型青霉素G酰化酶α亚基146氨基酸苯丙氨酸突变成疏水性的A丙氨酸和L亮氨酸，发现可以提高合成酶活/水解酶活比值(S/H)，从1.4提升到3.1和4.2，而突变成亲水性的Y络氨酸和W色氨酸则大幅降低S/H比值，从1.4降低到0.03和0.033(Alkema W BL,Dijkhuis A,De Vries E,et al.European Journal of Biochemistry,2002,269(8):2093-2100.)。
现有的方案仅通过将突变底物结合口袋附近的大侧链氨基酸突变为小侧链氨基酸，虽然增强了合成活性，但是水解活性也有一定水平的提高，最终造成合成酶活/水解酶活(S/H)增幅有限，目前已知的大肠杆菌青霉素G酰化酶合成酶活/水解酶活比值(S/H)最高仅为4.2。本公司2013年申请的突变型青霉素G酰化酶专利[公开号为：103275960B]中所设计的突变型青霉素G酰化酶有很高的水解活性，但合成酶活明显偏低，最终的合成酶活/水解酶活(S/H)较低。因此，还得对青霉素G酰化酶进一步改进。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人工设计的青霉素G酰化酶原。该青霉素G酰化酶原以6-APA和对羟基苯甘氨酸甲酯为底物，高效合成阿莫西林。
本发明的另一目的在于提供编码所述的人工设计的青霉素G酰化酶原的基因序列。
本发明的再一目的在于提供人工设计的青霉素G酰化酶原及编码序列的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人工设计的青霉素G酰化酶原，是将野生型青霉素G酰化酶原的底物结合口袋附近的大侧链氨基酸中的一个以上突变为比突变前氨基酸更小的侧链氨基酸，减少底物结合位阻效应，促使底物能迅速进入活性口袋；同时将活性口袋中与底物-活性中心距离较近的关键亲水性氨基酸或弱疏水性氨基酸中的一个以上突变为疏水性比突变前氨基酸更强的氨基酸，增加底物结合口袋周围的疏水性，减少水分子结合，减少水解，从减少水解和增加合成两方面增加S/H，最终大幅提高青霉素G酰化酶合成阿莫西林的能力。
所述的野生型青霉素G酰化酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其由四部分组成，从蛋白质的N端到C端依次为：第1～26位为信号肽，第27～235位为α亚基，第236～289位为连接肽、第290～846位为β亚基。
所述的底物结合口袋附近的大侧链氨基酸位点优选为β亚基的第24位Phe、β亚基的第71位Phe、β亚基的第363位Ile和β亚基的第460位Phe。
所述的比突变前氨基酸更小的侧链氨基酸优选为Ala、Gly、Val、Leu或Ile。
所述的关键亲水性氨基酸或弱疏水性氨基酸优选为α亚基的第3位Ser、α亚基的第149位Ser和β亚基的第148位Val。
所述的疏水性比突变前氨基酸更强的氨基酸优选为Val、Leu或Ile。
所述的人工设计的青霉素G酰化酶原，优选为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型青霉素G酰化酶原中的部分氨基酸按方式(1)和方式(2)改变得到：
(1)改变底物结合口袋的附近结构：将β亚基的第24位Phe、β亚基的第71位Phe、β亚基的第363位Ile和β亚基的第460位Phe中的至少一个突变为Ala、Gly、Val或Leu；
(2)改变底物结合口袋的疏水性，通过方式①和/或②实现：
①将α亚基的第3位Ser和α亚基的第149位Ser中的一个或两个突变为Val、Leu或Ile；
②将β亚基的第148位Val突变为Leu或Ile。
所述的人工设计的青霉素G酰化酶原，优选为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型青霉素G酰化酶原中的部分氨基酸按方式(A)、(B)、(C)和(D)同时改变得到：
(A)将β亚基的第24位Phe、β亚基的第363位Ile和β亚基的第460位Phe突变为Ala、Gly、Val或Leu；
(B)将α亚基的第3位Ser突变为Val、Leu或Ile；
(C)将β亚基的第148位Val突变为Leu或Ile；
(D)将α亚基的第149位Ser突变为Val、Leu或Ile；或是将β亚基的第71位Phe突变为Ala、Gly、Val或Leu。
所述的方式(A)优选为将β亚基的第24位Phe突变为Ala、将β亚基的第363位Ile突变为Val、将β亚基的第460位Phe突变为Leu。
所述的方式(B)优选为将α亚基的第3位Ser突变为Leu。
所述的方式(C)优选为将β亚基的第148位Val突变为Leu。
所述的方式(D)优选为将α亚基的第149位Ser突变为Val，或是将β亚基的第71位Phe突变为Val。
所述的人工设计的青霉素G酰化酶原，氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
一种编码所述的人工设计的青霉素G酰化酶原的核苷酸序列，是依据密码子表以及所用的宿主偏好性对上述人工设计的青霉素G酰化酶原转换得到。
所述的编码所述的人工设计的青霉素G酰化酶原的核苷酸序列，优选如SEQ IDNO.5或SEQ ID NO.6所示。
一种表达上述人工设计的青霉素G酰化酶原的重组载体，是将所述的编码所述的人工设计的青霉素G酰化酶原的核苷酸序列克隆岛表达载体上得到。
所述的表达载体优选为pET9a、pET28a、pET28a-c(+)、pET30a-c(+)或pET33b(+)；更优选为pET28a。
一种表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株，是将上述表达人工设计的青霉素G酰化酶原的重组载体转化到宿主菌株得到。
所述的宿主菌株优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述的表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株的发酵方法，包括如下步骤：将表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株接种到发酵培养基中，进行发酵，具体如下：
发酵条件如下：温度控制在28℃～32℃之间，pH值控制在6.5～7.0之间，搅拌转速控制在150rpm～700rpm之间，空气流速控制在200L/h～1600L/h之间，溶解氧(DO)控制在5～50％的最大氧饱和度，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3mM；当碳源耗尽时开始补料，采用匀速补料，补料速率控制在0.6mL·min-1·L-1；
所述的发酵培养基的组成如下：每升含有酵母粉3g、蛋白胨5g、氯化钠1g、磷酸二氢钾3g、磷酸氢二钠3.25g、二水合氯化钙0.014g、硫酸镁1g、甘油4.125g、硫酸铵6g、微量元素0.875mL；用水定容至1L，pH6.5～7.0；
所述的微量元素的组成如下：每升含有四水合氯化亚铁22.87g、氯化锌1.31g、六水合氯化钴2g、二水合钼酸钠2g、二水合氯化钙1g、二水合氯化铜1.25g、硼酸0.5g、一水合硫酸锰2.17g、浓度为质量百分比37％的浓盐酸100mL，用水定容至1L；
所述的补料的组成如下：每升含有500g甘油，25g酵母粉，40g蛋白胨，余量为水。
所述的人工设计的青霉素G酰化酶原在阿莫西林合成中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明利用理性突变技术，通过对关键氨基酸的突变，不仅避免底物的空间位阻效应位置效应，提高酶与底物的反应速率，而且还增强底物结合口袋周围的疏水性，减少水分子结合，最终从两方面提高青霉素G酰化酶合成阿莫西林的能力。通过对青霉素G酰化酶底物活性中心附近的关键氨基酸进行改造，提高青霉素G酰化酶S/H比值，S/H比值高达8.41，高S/H有助于提高阿莫西林的合成效率，降低对羟基苯甘氨酸甲酯的消耗，大幅降低酶法合成阿莫西林成本。经过改造后的大肠杆菌青霉素G酰化酶S/H比值高达8.41，是目前已知S/H比值最高的大肠杆菌青霉素G酰化酶突变酶。
附图说明
图1是重组质粒pET28a-PGA1的构建示意图。
图2是重组质粒点突变方法原理示意图。
图3是BL21(DE3)/pET28a-PGA1菌体诱导前后蛋白电泳图；其中，泳道M为蛋白Marker，各条带大小：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.0KDa、14.4KDa；泳道1为诱导前0h样品，泳道2为诱导18h样品，泳道3为诱导20h样品，并用箭头分别将α亚基和β亚基标出。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
野生型青霉素G酰化酶酶原的密码子优化
大肠杆菌青霉素G酰化酶酶原(NCBI：WP_062871965.1)由信号肽序列(26个氨基酸残基)、α亚基(209个氨基酸残基)、连接肽(54个氨基酸残基)以及β亚基(557个氨基酸残基)组成，青霉素G酰化酶酶原在大肠杆菌中表达后，酶原自身的信号肽将酶原定位至周质空间，在周质空间中，青霉素G酰化酶酶原经折叠及蛋白修饰切割，将连接肽切下后，形成由α亚基和β亚基组成的青霉素G酰化酶成熟酶，该酶为二聚体酶。
通过分析野生型青霉素G酰化酶酶原核苷酸序列，其密码子使用有一定的偏好性，有必要对野生型青霉素G酰化酶酶原的核苷酸序列进行优化。依据密码子表将这些氨基酸序列转换为核苷酸序列，在转换过程中，根据宿主菌的密码子使用频率数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)，选择使用频率最优的密码子。本发明根据大肠杆菌的密码子使用数据库，获得了相应的核苷酸序列，优化后的野生型青霉素G酰化酶酶原的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
野生型青霉素G酰化酶酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述的氨基酸序列中，第1～26位为信号肽，第27～235位为α亚基，第236～289位为连接肽、第290～846位为β亚基。
为了方便基因与载体的连接，在该核苷酸序列(如SEQ ID NO:4所示)的5’添加限制性酶切位点NdeI(CATATG)，3’末端添加限制性酶切位点BamHI(GGATCC)，命名为PGA1，将该序列提交到南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，合成的PGA1序列已经由南京金斯瑞生物科技有限公司连接到载体pMD18T，获得的重组载体pMD18T-PGA1。
实施例2重组表达载体的构建
Novagen公司开发的pET系列载体，使用具有强启动能力的T7启动子，可以高效驱动目的基因的表达，现已成为最常用的原核表达载体之一。本发明选用的载体pET28a(+)使用T7lac复合启动子，可以自由关闭和开启基因的表达，在诱导之前基因基本不表达，大大降低了宿主菌的负荷，诱导后可以迅速表达出大量目的蛋白。
使用TaKaRa公司的限制性内切酶NdeI和BamHI对重组载体pMD18T-PGA1进行双酶切，取5μL酶切产物用质量体积比1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，确认酶切完全后，将全部酶切产物进行质量体积比0.8％琼脂糖电泳，割下大小约2500bp的DNA片段的凝胶，使用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒将凝胶中的DNA片段纯化到30μL去离子水中，就得到带粘性末端的基因片段。同样，用NdeI和BamHI对质粒pET28a进行双酶切，将酶切后的质粒片段纯化到20μL去离子水中。使用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit 2.0将基因片段和质粒片段进行连接，连接条件为16℃，过夜。取10μL过夜连接的产物，加入到80μL用CaCl2法(美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》第三版)制备的大肠杆菌Top10F’(购自invitrogen公司)感受态细胞中，42℃处理90s，迅速加入300μL经过37℃预热的LB液体培养基(其中，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0～7.5)，在37℃摇床中低速振荡(150～200rpm)培养45min，然后取100μL培养物涂布添加了卡那霉素(Kanamycin，终浓度为50μg/ml)的固体LB培养基(其中，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0～7.5)。在37℃培养箱中倒置培养该平板约18h，直到长出单菌落，随机挑取部分单菌落进行菌液PCR鉴定，PCR反应的条件为：94℃5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃5min；引物为：T7上游引物5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′、T7下游引物5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。将初步筛选得到的阳性克隆抽提质粒，通过NdeI和BamHI进行酶切鉴定，得到大小约2.5kb的基因片段和5.2kb的载体片段的克隆，即为含有PGA片段的克隆。将鉴定含有PGA片段的克隆送至Invitrogen公司进行测序。将测序证明没有碱基突变和读码框移位的单克隆，接种至50ml添加了卡那霉素(Kanamycin，50μg/ml)的LB液体培养基，37℃，250rpm，培养18h，获得的培养物用TIANGEN公司的质粒小提中量试剂盒抽提质粒(按说明书进行操作)，获得的重组表达质粒命名为pET28a-PGA1。pET28a-PGA1质粒构建图如图1所示。
实施例3定点突变法获得突变型青霉素G酰化酶
1、定点突变获得突变型青霉素G酰化酶PGA2
利用定点突变技术，以pET28a-PGA1质粒为模板，利用点突变引物进行重叠延伸PCR获得突变片段，按照天根核酸纯化试剂盒按照说明书回收PCR产物后。使用商业化的DpnI酶按照说明书酶切回收PCR产物，Dpn I可切断腺嘌呤甲基化的GmATC序列，可消除未突变的模板，未被Dpn I酶消化的PCR产物即为突变质粒。将经Dpn I酶消化后的PCR产物直接加入到80μL用CaCl2法(美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》第三版)制备的大肠杆菌Top10F’(购自invitrogen公司)感受态细胞中，42℃处理90s，迅速加入300μL经过37℃预热的LB液体培养基(其中，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0～7.5)，在37℃摇床中低速振荡(149～200rpm)培养45min，然后取100μL培养物涂布添加了卡那霉素(Kanamycin，终浓度为50μg/ml)的固体LB培养基(其中，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0～7.5)。在37℃培养箱中倒置培养该平板约18h，直到长出单菌落，随机挑取部分单菌落进行菌液PCR鉴定，PCR反应的条件为：94℃5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃5min；引物为：T7上游引物和T7下游引物。将初步筛选得到的阳性克隆抽提质粒，通过NdeI和BamHI进行酶切鉴定，得到大小约2.5kb的基因片段和5.2kb的载体片段的克隆，即为目的克隆。将鉴定含有目的片段的克隆送至Invitrogen公司进行测序。将测序证明已完成点突变的单克隆，接种至50ml添加了卡那霉素(Kanamycin，50μg/ml)的LB液体培养基，37℃，250rpm，培养18h，获得的培养物用TIANGEN公司的质粒小提中量试剂盒抽提质粒(按说明书进行操作)，进行下一轮突变，经6轮突变，最终获得重组表达质粒pET28a-PGA2，其方法原理如图2。
依据上述过程，将重组质粒pET28a-PGA1上的青霉素G酰化酶酶原α亚基第3位Ser突变为Leu、β亚基第24位Phe突变为Ala、β亚基第71位Phe突变为Gly、β亚基第148位Val突变为Leu、β亚基第363位Ile突变为Val、β亚基第460位Phe突变为Leu；所得到的基因命名为PGA2，所得到的突变质粒命名为pET28a-PGA2；其中，
α亚基第3位Ser的点突变引物为(引物方向为5’-3’，下同)：
αSer3-F正向引物：TTTAATTTCAGAGCTCAGTTGTTCAGCCAGAG；
αSer3-R反向引物：CTCTGGCTGAACAACTGAGCTCTGAAATTAAA；
β亚基第24位Phe的点突变引物为：
βPhe24-F正向引物：CATACCAACCTGCTTGAGGACCATTGAC；
βPhe24-R反向引物：GTCAATGGTCCTCAAGCAGGTTGGTATG；
β亚基第71位Phe的点突变引物为：
βPhe71-F正向引物：TCAACGTCATCACCGCCGCCGGCGGTACT；
βPhe71-R反向引物：AGTACCGCCGGCGGCGGTGATGACGTTGA；
β亚基第148位Val的点突变引物为：
βVal148-F正向引物：CCAGCAGTGAAGCCAGTTCCTTGCCATC；
βVal148-R反向引物：GATGGCAAGGAACTGGCTTCACTGCTGG；
β亚基第363位Ile的点突变引物为：
βIle363-F正向引物：CAAACGGCATCGGAACAGCTGCCACGACCGTGCGT；
βIle363-R反向引物：ACGCACGGTCGTGGCAGCTGTTCCGATGCCGTTTG；
β亚基第460位Phe的点突变引物为：
βPhe460-F正向引物：TGCGGGACACCCAGGAAATTGTTCGCGC；
βPhe460-R反向引物：GCGCGAACAATTTCCTGGGTGTCCCGCA。
在构建突变质粒pET28a-PGA2时，以pET28a-PGA1为模板，利用点突变引物进行重叠延伸PCR获得突变片段，将PCR产物经Dpn I酶切消除未突变的模板，酶切完成后使用天根核酸纯化试剂盒按照说明书纯化片段。先利用点突变引物αSer3-F正向引物、αSer3-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶α亚基第3位Ser突变为Leu；再以点突变引物βPhe24-F正向引物、βPhe24-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶β亚基第24位Phe突变为Ala；以点突变引物βPhe71-F正向引物、βPhe71-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶β亚基第71位Phe突变为Gly；以点突变引物βVal148-F正向引物、βVal148-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶β亚基第148位Val突变为Leu；以点突变引物βIle363-F正向引物、βIle363-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶β亚基第363位Ile突变为Val；最后使用点突变引物βPhe460-F正向引物、βPhe460-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶β亚基第460位Phe突变为Leu；突变后的青霉素G酰化酶PGA2氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，测序的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2、定点突变获得突变型青霉素G酰化酶PGA3
如前所述，利用定点突变技术，以pET28a-PGA1质粒为模板，利用点突变引物进行重叠延伸PCR获得突变片段，经6轮突变，最终获得重组表达质粒pET28a-PGA3，其方法原理如图2。
依据上述过程，将重组质粒pET28a-PGA1上的青霉素G酰化酶酶原α亚基第3位Ser突变为Leu、α亚基第149位Ser突变为Val、β亚基第24位Phe突变为Ala、β亚基第148位Val突变为Leu、β亚基第363位Ile突变为Val、β亚基第460位Phe突变为Leu；所得到的基因命名为PGA3，所得到的突变质粒命名为pET28a-PGA3；其中，
α亚基第3位Ser的点突变引物为：αSer3-F正向引物和αSer3-R反向引物(序列同前)；
α亚基第149位Ser的点突变引物为：
αSer149-F正向引物：TGACGTGGAATCGACGAAGCGGTTCGC；
αSer149-R反向引物：GCGAACCGCTTCGTCGATTCCACGTCA；
β亚基第24位Phe的点突变引物为：βPhe24-F正向引物和βPhe24-R反向引物(序列同前)；
β亚基第148位Val的点突变引物为：βVal148-F正向引物和βVal148-R反向引物(序列同前)；
β亚基第363位Ile的点突变引物为：βIle363-F正向引物和βIle363-R反向引物(序列同前)；
β亚基第460位Phe的点突变引物为：βPhe460-F正向引物和βPhe460-R反向引物(序列同前)。
在构建突变质粒pET28a-PGA3时，以pET28a-PGA1为模板，利用点突变引物进行重叠延伸PCR获得突变片段，将PCR产物经Dpn I酶切消除未突变的模板，酶切完成后使用天根核酸纯化试剂盒按照说明书纯化片段。先利用点突变引物αSer3-F正向引物、αSer3-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶α亚基第3位Ser突变为Leu；然后以点突变引物αSer149-F正向引物、αSer149-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶α亚基第191位Ser突变为Val；再以点突变引物βPhe24-F正向引物、βPhe24-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶β亚基第24位Phe突变为Ala；以点突变引物βVal148-F正向引物、βVal148-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶β亚基第148位Val突变为Leu；以点突变引物βIle363-F正向引物、βIle363-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶β亚基第363位Ile突变为Val；最后使用点突变引物βPhe460-F正向引物、βPhe460-F反向引物将青霉素G酰化酶成熟酶β亚基第460位Phe突变为Leu；突变后的青霉素G酰化酶PGA3氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，测序的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
实施例4重组菌株的构建
用氯化钙法将重组表达载体pET28a-PGA1、pET28a-PGA2、pET28a-PGA3导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，转化方法同样按照《分子克隆实验指南》第三版的氯化钙法进行，将转化液分别涂布至添加了卡那霉素(Kanamycin，终浓度为50μg/ml)的固体LB培养基，37℃培养直到出现单菌落，用无菌牙签分别挑生长起来的单克隆到添加了卡那霉素(Kanamycin，终浓度为50μg/ml)的液体LB培养基，37℃，220rpm培养至OD600为2.0左右，按照天根质粒提取试剂盒提取质粒，琼脂糖凝胶电泳验证，使用T7引物PCR初步验证。将所获得的基因工程菌分别命名为BL21(DE3)/pET28a-PGA1、BL21(DE3)/pET28a-PGA2、BL21(DE3)/pET28a-PGA3。
实施例5青霉素G酰化酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-PGA1的发酵小试
1、发酵种子液制备
取20μL在-70℃冷冻保存的菌种BL21(DE3)/pET28a-PGA1接种至50ml添加了卡那霉素(Kanamycin，终浓度为50μg/ml)的LB液体培养基，在28℃，250rpm的摇床中培养16小时，从而活化菌种。再将50ml活化过的菌种接种到400ml添加了50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃，250rpm的条件下继续培养3h，获得种子培养物，控制它的菌体浓度OD600在0.8～1.2之间。
2、发酵罐培养
使用20L搅拌式发酵罐(南京华龙公司)，按照表1所示的发酵培养基配方进行投料，投料体积为8L。严格控制发酵条件：温度控制在28℃～32℃之间，pH控制在6.5～7.0之间，发酵转速控制在150rpm～700rpm(根据DO的变化调控)之间，空气流速控制在200L/h～1600L/h之间(根据DO的变化调控)，溶解氧(DO)控制在5～50％的最大氧饱和度之间。培养至碳源耗尽时开始补料(其中每L含有500g甘油、25g酵母粉、40g蛋白胨，水定容至1L)，采用匀速补料(补料速率控制在0.6mL·min-1·L-1)，补料的用量为4L。当培养至菌体浓度OD600≈30时，开始添加IPTG至终浓度0.3mM，开始诱导。诱导时间为10h，发酵周期为24h。
表1
Figure BDA0001254926460000071
表2
Figure BDA0001254926460000072
Figure BDA0001254926460000081
3、蛋白质电泳分析
取上述步骤2的发酵液离心(12000×g,2min)后得到的菌体2g，用10mL 50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)重悬，超声波处理10分钟(80W破碎10min，破碎3s，间歇5s)。离心(12000×g,2min)分离后，取上清，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％)，结果见图3。由此可见，本发明的青霉素G酰化酶由α、β两个亚基组成，大小分别约为23KD和62KD。
4、青霉素G酰化酶水解酶活的测定
取1mL步骤2得到的发酵液，经离心分离菌体，用1mL蒸馏水洗涤两次，再离心分离，将菌体保存在-20℃。解冻后的菌体重悬在1mL 0.05mol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，即为待测样品。取0.05mol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)100mL，37℃预热数分钟，加入1g青霉素G钾盐，搅拌均匀，然后加入1mL待测样品，待pH至8.00时开始计时，通过滴加0.1mol/L标准NaOH溶液维持pH＝8.00，反应8～10分钟，准确记录消耗NaOH溶液的体积和反应时间。酶活的定义为，在一定条件下，1分钟内水解1μmol青霉素G钾盐所需青霉素G酰化酶的量。酶活的计算公式为：水解酶活＝100×(V÷t)U/L。其中，V表示消耗NaOH溶液的分钟数，t表示反应时间的分钟数。
5、青霉素G酰化酶合成酶活的测定
取1mL发酵液，经离心分离菌体，用1mL蒸馏水洗涤菌体两次，再离心分离，将菌体保存在-20℃。解冻后的菌体重悬在1mL 0.05mol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，即为待测样品。
在100mL水中加入0.5g 6-APA(6-氨基青霉烷酸)，用质量体积比40％的NaOH溶液调pH值至6.3，然后加入0.5g HPGMe.HCl(D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐)，用质量体积比40％的NaOH溶液调pH值至6.3，加入1ml样品，在37℃的水浴条件下，反应30分钟。用高效液相色谱法分析反应产物，色谱柱：Luna，5μC 18，100A，149×4.60mm(Phenomenex)；流动相：
A相：0.05M磷酸钠缓冲液，pH＝3.1；
B相：甲醇；柱温：30℃；
流速：1.0mLmin；
检测波长：215nm。
合成酶活定义为在一定的反应条件下，1分钟内生成1μmol的阿莫西林所需要的酶量定义为1U。
酶活＝[W(液相测出的阿莫西林浓度)g/L×0.1L÷365.4g/mol×106μmol/mol÷30min]÷1ml
＝W(液相测出的阿莫西林浓度)×10÷1.0962U/ml
实施例6青霉素G酰化酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-PGA2的发酵小试
参照基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-PGA1的发酵小试工艺，取20μL在-70℃冷冻保存的菌种BL21(DE3)/pET28a-PGA2接种至50ml添加了卡那霉素(Kanamycin，终浓度为50μg/ml)的LB液体培养基，制备种子液，使用20L搅拌式发酵罐(南京华龙公司)，按照上述表1所示的发酵培养基配方进行投料，投料体积为8L；诱导时间为10h，发酵周期为24h；取1mL发酵结束后的发酵液，分别检测发酵液中青霉素G酰化酶的水解酶活和合成酶活，酶活检测方法见实施5。
实施例7青霉素G酰化酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-PGA3的发酵小试
参照基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-PGA1的发酵小试工艺，取20μL在-70℃冷冻保存的菌种BL21(DE3)/pET28a-PGA3接种至50ml添加了卡那霉素(Kanamycin，终浓度为50μg/ml)的LB液体培养基，制备种子液，使用20L搅拌式发酵罐(南京华龙公司)，按照上述表1所示的发酵培养基配方进行投料，投料体积为8L；诱导时间为10h，发酵周期为24h；取1mL发酵结束后的发酵液，分别检测发酵液中青霉素G酰化酶的水解酶活和合成酶活，酶活检测方法见实施5。
实施例8青霉素G酰化酶合成酶活/水解酶活比值(S/H)比较
青霉素G酰化酶重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PGA1、BL21(DE3)/pET28a-PGA2，BL21(DE3)/pET28a-PGA3合成酶活比水解酶活比值见表3。
以专利号为“201310256792.4”、名称为“一种人工设计的青霉素G酰化酶原及编码序列和发酵方法”的国家发明专利实施例3获得的诱导型青霉素G酰化酶基因工程菌的发酵按实施例5检测，检测结果见表3。
可见，本发明中大肠杆菌野生型青霉素G酰化酶的S/H仅为1.32，通过对青霉素G酰化酶底物活性口袋及口袋周围的多个位点进行理性突变，最终BL21(DE3)/pET28a-PGA2表达的突变型青霉素G酰化酶S/H达到8.30，突变后S/H比值提高了5.29倍；BL21(DE3)/pET28a-PGA3表达的突变型青霉素G酰化酶S/H达到8.41，突变后S/H比值提高了5.37倍。本发明突变后得到的青霉素G酰化酶比申请人2013年的研究成果的S/H比值提高了不少。
表3不同菌株合成酶活/水解酶活(S/H)比值
Figure BDA0001254926460000091
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海联邦制药股份有限公司
<120> 一种人工设计的青霉素G酰化酶原及其编码序列与应用
<130> 1
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 846
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 1
Met Lys Asn Arg Asn Arg Met Ile Val Asn Cys Val Thr Ala Ser Leu
1 5 10 15
Met Tyr Tyr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gln Ser Ser Ser Glu
20 25 30
Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met Pro His Ile Tyr Ala Asn
35 40 45
Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Val Ala Gln Asp
50 55 60
Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Thr Val
65 70 75 80
Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys Phe Asp Lys Asp Ile Arg
85 90 95
Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala Gln Ile Ala Ala Leu Ser
100 105 110
Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Gly Met Asn Ala
115 120 125
Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu Thr Leu Leu Pro Lys Gln
130 135 140
Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg Trp Glu Pro Phe Asp Val
145 150 155 160
Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ser Thr
165 170 175
Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys Tyr
180 185 190
Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn Gln Leu Lys Trp Leu Val
195 200 205
Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val Gln Glu Ser Asn Tyr Pro
210 215 220
Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr Ala Ala Leu Leu Pro Arg
225 230 235 240
Tyr Asp Leu Pro Ala Pro Met Leu Asp Arg Pro Ala Lys Gly Ala Asp
245 250 255
Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Ala
260 265 270
Ala Gln Phe Ala Gln Gly Gly Ala Asn Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Thr
275 280 285
Thr Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys
290 295 300
Ala Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr
305 310 315 320
Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn
325 330 335
Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile
340 345 350
Ser Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala
355 360 365
Glu Arg Leu Ser Ala Glu Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu His Asn Gly Lys
370 375 380
Trp Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly
385 390 395 400
Gln Ala Glu Thr Phe Thr Val Trp Arg Thr Val His Gly Asn Ile Leu
405 410 415
Gln Thr Asp Gln Thr Thr Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Ser Arg Ala Trp
420 425 430
Asp Gly Lys Glu Val Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys
435 440 445
Ala Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu
450 455 460
Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val
465 470 475 480
His Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu
485 490 495
Pro Val Pro Gly Thr Gly Lys Trp Asp Trp Lys Gly Leu Leu Pro Phe
500 505 510
Glu Met Asn Pro Lys Val Tyr Asn Pro Gln Ser Gly Tyr Ile Ala Asn
515 520 525
Trp Asn Asn Ser Pro Gln Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Asp Leu Phe Ala
530 535 540
Phe Leu Trp Gly Gly Ala Asp Arg Val Thr Glu Ile Asp Arg Leu Leu
545 550 555 560
Glu Gln Lys Pro Arg Leu Thr Ala Asp Gln Ala Trp Asp Val Ile Arg
565 570 575
Gln Thr Ser Arg Gln Asp Leu Asn Leu Arg Leu Phe Leu Pro Thr Leu
580 585 590
Gln Ala Ala Thr Ser Gly Leu Thr Gln Ser Asp Pro Arg Arg Gln Leu
595 600 605
Val Glu Thr Leu Thr Arg Trp Asp Gly Ile Asn Leu Leu Asn Asp Asp
610 615 620
Gly Lys Thr Trp Gln Gln Pro Gly Ser Ala Ile Leu Asn Val Trp Leu
625 630 635 640
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645 650 655
Asp Lys Trp Tyr Ser Ala Ser Gly Tyr Glu Thr Thr Gln Asp Gly Pro
660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
Gly Lys Pro Gln Gln Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Glu Asp Thr Trp
705 710 715 720
Glu Thr Leu Ser Lys Arg Tyr Gly Asn Asn Val Ser Asn Trp Lys Thr
725 730 735
Pro Ala Met Ala Leu Thr Phe Arg Ala Asn Asn Phe Phe Gly Val Pro
740 745 750
Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Arg His Gln Ala Glu Tyr Gln Asn Arg
755 760 765
Gly Thr Glu Asn Asp Met Ile Val Phe Ser Pro Thr Thr Ser Asp Arg
770 775 780
Pro Val Leu Ala Trp Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Ile
785 790 795 800
Ala Pro Asp Gly Thr Val Asp Lys His Tyr Glu Asp Gln Leu Lys Met
805 810 815
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Glu Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg
835 840 845
<210> 2
<211> 846
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> 人工设计的青霉素G酰化酶原PGA2
<400> 2
Met Lys Asn Arg Asn Arg Met Ile Val Asn Cys Val Thr Ala Ser Leu
1 5 10 15
Met Tyr Tyr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gln Leu Ser Ser Glu
20 25 30
Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met Pro His Ile Tyr Ala Asn
35 40 45
Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Val Ala Gln Asp
50 55 60
Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Thr Val
65 70 75 80
Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys Phe Asp Lys Asp Ile Arg
85 90 95
Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala Gln Ile Ala Ala Leu Ser
100 105 110
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115 120 125
Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu Thr Leu Leu Pro Lys Gln
130 135 140
Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg Trp Glu Pro Phe Asp Val
145 150 155 160
Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ser Thr
165 170 175
Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys Tyr
180 185 190
Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn Gln Leu Lys Trp Leu Val
195 200 205
Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val Gln Glu Ser Asn Tyr Pro
210 215 220
Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr Ala Ala Leu Leu Pro Arg
225 230 235 240
Tyr Asp Leu Pro Ala Pro Met Leu Asp Arg Pro Ala Lys Gly Ala Asp
245 250 255
Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Ala
260 265 270
Ala Gln Phe Ala Gln Gly Gly Ala Asn Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Thr
275 280 285
Thr Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys
290 295 300
Ala Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Ala Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr
305 310 315 320
Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn
325 330 335
Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile
340 345 350
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355 360 365
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Trp Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly
385 390 395 400
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405 410 415
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Asp Gly Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys
435 440 445
Ala Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu
450 455 460
Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val
465 470 475 480
His Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu
485 490 495
Pro Val Pro Gly Thr Gly Lys Trp Asp Trp Lys Gly Leu Leu Pro Phe
500 505 510
Glu Met Asn Pro Lys Val Tyr Asn Pro Gln Ser Gly Tyr Ile Ala Asn
515 520 525
Trp Asn Asn Ser Pro Gln Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Asp Leu Phe Ala
530 535 540
Phe Leu Trp Gly Gly Ala Asp Arg Val Thr Glu Ile Asp Arg Leu Leu
545 550 555 560
Glu Gln Lys Pro Arg Leu Thr Ala Asp Gln Ala Trp Asp Val Ile Arg
565 570 575
Gln Thr Ser Arg Gln Asp Leu Asn Leu Arg Leu Phe Leu Pro Thr Leu
580 585 590
Gln Ala Ala Thr Ser Gly Leu Thr Gln Ser Asp Pro Arg Arg Gln Leu
595 600 605
Val Glu Thr Leu Thr Arg Trp Asp Gly Ile Asn Leu Leu Asn Asp Asp
610 615 620
Gly Lys Thr Trp Gln Gln Pro Gly Ser Ala Ile Leu Asn Val Trp Leu
625 630 635 640
Thr Ser Met Leu Lys Arg Thr Val Val Ala Ala Val Pro Met Pro Phe
645 650 655
Asp Lys Trp Tyr Ser Ala Ser Gly Tyr Glu Thr Thr Gln Asp Gly Pro
660 665 670
Thr Gly Ser Leu Asn Ile Ser Val Gly Ala Lys Ile Leu Tyr Glu Ala
675 680 685
Val Gln Gly Asp Lys Ser Pro Ile Pro Gln Ala Val Asp Leu Phe Ala
690 695 700
Gly Lys Pro Gln Gln Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Glu Asp Thr Trp
705 710 715 720
Glu Thr Leu Ser Lys Arg Tyr Gly Asn Asn Val Ser Asn Trp Lys Thr
725 730 735
Pro Ala Met Ala Leu Thr Phe Arg Ala Asn Asn Phe Leu Gly Val Pro
740 745 750
Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Arg His Gln Ala Glu Tyr Gln Asn Arg
755 760 765
Gly Thr Glu Asn Asp Met Ile Val Phe Ser Pro Thr Thr Ser Asp Arg
770 775 780
Pro Val Leu Ala Trp Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Ile
785 790 795 800
Ala Pro Asp Gly Thr Val Asp Lys His Tyr Glu Asp Gln Leu Lys Met
805 810 815
Tyr Glu Asn Phe Gly Arg Lys Ser Leu Trp Leu Thr Lys Gln Asp Val
820 825 830
Glu Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg
835 840 845
<210> 3
<211> 846
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> 人工设计的青霉素G酰化酶酶原PGA3
<400> 3
Met Lys Asn Arg Asn Arg Met Ile Val Asn Cys Val Thr Ala Ser Leu
1 5 10 15
Met Tyr Tyr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gln Leu Ser Ser Glu
20 25 30
Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met Pro His Ile Tyr Ala Asn
35 40 45
Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Val Ala Gln Asp
50 55 60
Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Thr Val
65 70 75 80
Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys Phe Asp Lys Asp Ile Arg
85 90 95
Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala Gln Ile Ala Ala Leu Ser
100 105 110
Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Gly Met Asn Ala
115 120 125
Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu Thr Leu Leu Pro Lys Gln
130 135 140
Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg Trp Glu Pro Phe Asp Val
145 150 155 160
Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Val Thr
165 170 175
Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys Tyr
180 185 190
Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn Gln Leu Lys Trp Leu Val
195 200 205
Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val Gln Glu Ser Asn Tyr Pro
210 215 220
Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr Ala Ala Leu Leu Pro Arg
225 230 235 240
Tyr Asp Leu Pro Ala Pro Met Leu Asp Arg Pro Ala Lys Gly Ala Asp
245 250 255
Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Ala
260 265 270
Ala Gln Phe Ala Gln Gly Gly Ala Asn Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Thr
275 280 285
Thr Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys
290 295 300
Ala Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Ala Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr
305 310 315 320
Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn
325 330 335
Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile
340 345 350
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355 360 365
Glu Arg Leu Ser Ala Glu Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu His Asn Gly Lys
370 375 380
Trp Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly
385 390 395 400
Gln Ala Glu Thr Phe Thr Val Trp Arg Thr Val His Gly Asn Ile Leu
405 410 415
Gln Thr Asp Gln Thr Thr Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Ser Arg Ala Trp
420 425 430
Asp Gly Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys
435 440 445
Ala Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu
450 455 460
Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val
465 470 475 480
His Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu
485 490 495
Pro Val Pro Gly Thr Gly Lys Trp Asp Trp Lys Gly Leu Leu Pro Phe
500 505 510
Glu Met Asn Pro Lys Val Tyr Asn Pro Gln Ser Gly Tyr Ile Ala Asn
515 520 525
Trp Asn Asn Ser Pro Gln Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Asp Leu Phe Ala
530 535 540
Phe Leu Trp Gly Gly Ala Asp Arg Val Thr Glu Ile Asp Arg Leu Leu
545 550 555 560
Glu Gln Lys Pro Arg Leu Thr Ala Asp Gln Ala Trp Asp Val Ile Arg
565 570 575
Gln Thr Ser Arg Gln Asp Leu Asn Leu Arg Leu Phe Leu Pro Thr Leu
580 585 590
Gln Ala Ala Thr Ser Gly Leu Thr Gln Ser Asp Pro Arg Arg Gln Leu
595 600 605
Val Glu Thr Leu Thr Arg Trp Asp Gly Ile Asn Leu Leu Asn Asp Asp
610 615 620
Gly Lys Thr Trp Gln Gln Pro Gly Ser Ala Ile Leu Asn Val Trp Leu
625 630 635 640
Thr Ser Met Leu Lys Arg Thr Val Val Ala Ala Val Pro Met Pro Phe
645 650 655
Asp Lys Trp Tyr Ser Ala Ser Gly Tyr Glu Thr Thr Gln Asp Gly Pro
660 665 670
Thr Gly Ser Leu Asn Ile Ser Val Gly Ala Lys Ile Leu Tyr Glu Ala
675 680 685
Val Gln Gly Asp Lys Ser Pro Ile Pro Gln Ala Val Asp Leu Phe Ala
690 695 700
Gly Lys Pro Gln Gln Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Glu Asp Thr Trp
705 710 715 720
Glu Thr Leu Ser Lys Arg Tyr Gly Asn Asn Val Ser Asn Trp Lys Thr
725 730 735
Pro Ala Met Ala Leu Thr Phe Arg Ala Asn Asn Phe Leu Gly Val Pro
740 745 750
Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Arg His Gln Ala Glu Tyr Gln Asn Arg
755 760 765
Gly Thr Glu Asn Asp Met Ile Val Phe Ser Pro Thr Thr Ser Asp Arg
770 775 780
Pro Val Leu Ala Trp Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Ile
785 790 795 800
Ala Pro Asp Gly Thr Val Asp Lys His Tyr Glu Asp Gln Leu Lys Met
805 810 815
Tyr Glu Asn Phe Gly Arg Lys Ser Leu Trp Leu Thr Lys Gln Asp Val
820 825 830
Glu Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg
835 840 845
<210> 4
<211> 2538
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 优化后的野生型青霉素G酰化酶酶原的核酸序列
<400> 4
atgaaaaatc gcaaccgtat gatcgtcaac tgtgtcaccg cttctctgat gtattattgg 60
tcgctgccgg ctctggctga acaaagtagc tctgaaatta aaatcgtgcg tgacgaatac 120
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ccggacgcca ttcgtgcaca gatcgcggcc ctgtctccgg aagatatgag tattctgcag 360
ggctatgccg atggtatgaa cgcatggatc gacaaagtta acaccaatcc ggaaacgctg 420
ctgccgaaac agtttaatac ctttggcttc acgccgaagc gttgggaacc gtttgatgtc 480
gctatgattt tcgtgggtac catggcgaac cgcttcagtg attccacgtc agaaatcgac 540
aatctggcac tgctgaccgc tctgaaggat aagtatggcg ttagccaggg tatggcggtc 600
tttaaccagc tgaaatggct ggtgaatccg tctgctccga ccacgattgc ggtccaagaa 660
agtaactacc cgctgaaatt caaccagcaa aattctcaga ccgcagctct gctgccgcgt 720
tatgatctgc cggcaccgat gctggaccgt ccggctaaag gtgcagatgg tgcactgctg 780
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caagatgcca aagcaatcat ggtcaatggt cctcaatttg gttggtatgc tccggcatac 960
acctatggca tcggtctgca tggcgccggt tacgatgtga ccggcaacac gccgtttgca 1020
tatccgggtc tggtgttcgg ccacaatggt gttatttctt ggggcagtac cgccggcttt 1080
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cataatggta aatgggtcaa gatgctgagt cgtgaagaaa ccattacggt gaaaaacggc 1200
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cataccggcg cgtatccgga tcgtcagtcc ggtcacgacc cgcgtctgcc ggtcccgggt 1500
acgggtaaat gggattggaa gggcctgctg ccgtttgaaa tgaacccgaa agtgtacaat 1560
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tcggcgagcg gttatgaaac cacgcaggat ggcccgaccg gttccctgaa tatttcagtt 2040
ggcgccaaaa tcctgtatga agcagtccaa ggtgacaaga gcccgattcc gcaggccgtt 2100
gacctgtttg caggcaaacc gcagcaagaa gttgtcctgg cggccctgga agatacctgg 2160
gaaacgctgt ccaaacgtta cggtaacaat gtttcaaact ggaagacccc ggctatggcg 2220
ctgacgtttc gcgcgaacaa tttcttcggt gtcccgcagg cagctgcaga agaaacccgt 2280
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acgagcgacc gtccggttct ggcttgggat gtggttgcgc cgggccagag tggttttatc 2400
gccccggatg gcaccgtgga caaacactac gaagaccagc tgaagatgta tgaaaatttc 2460
ggtcgtaaat cgctgtggct gaccaagcag gatgttgaag cgcataaaga aagccaagaa 2520
gttctgcacg tccagcgc 2538
<210> 5
<211> 2538
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 人工设计的青霉素G酰化酶酶原PGA2的核苷酸序列
<400> 5
atgaaaaatc gcaaccgtat gatcgtcaac tgtgtcaccg cttctctgat gtattattgg 60
tcgctgccgg ctctggctga acaactgagc tctgaaatta aaatcgtgcg tgacgaatac 120
ggcatgccgc atatttatgc aaacgatacc tggcacctgt tttatggcta cggttatgtg 180
gttgcgcaag atcgcctgtt ccagatggaa atggctcgtc gcagcaccca gggtacggtc 240
gcagaagtgc tgggcaagga tttcgtgaag ttcgataagg acatccgtcg caattactgg 300
ccggacgcca ttcgtgcaca gatcgcggcc ctgtctccgg aagatatgag tattctgcag 360
ggctatgccg atggtatgaa cgcatggatc gacaaagtta acaccaatcc ggaaacgctg 420
ctgccgaaac agtttaatac ctttggcttc acgccgaagc gttgggaacc gtttgatgtc 480
gctatgattt tcgtgggtac catggcgaac cgcttcagtg attccacgtc agaaatcgac 540
aatctggcac tgctgaccgc tctgaaggat aagtatggcg ttagccaggg tatggcggtc 600
tttaaccagc tgaaatggct ggtgaatccg tctgctccga ccacgattgc ggtccaagaa 660
agtaactacc cgctgaaatt caaccagcaa aattctcaga ccgcagctct gctgccgcgt 720
tatgatctgc cggcaccgat gctggaccgt ccggctaaag gtgcagatgg tgcactgctg 780
gcactgaccg ctggcaagaa ccgcgaaacg attgcggccc agtttgcaca aggcggtgca 840
aacggtctgg caggttaccc gaccacgtcg aatatgtggg ttattggtaa aagcaaggct 900
caagatgcca aagcaatcat ggtcaatggt cctcaagcag gttggtatgc tccggcatac 960
acctatggca tcggtctgca tggcgccggt tacgatgtga ccggcaacac gccgtttgca 1020
tatccgggtc tggtgttcgg ccacaatggt gttatttctt ggggcagtac cgccggcggc 1080
ggtgatgacg ttgatatctt cgccgaacgt ctgtctgcag aaaaaccggg ctattacctg 1140
cataatggta aatgggtcaa gatgctgagt cgtgaagaaa ccattacggt gaaaaacggc 1200
caggcggaaa cctttacggt gtggcgcacc gttcacggta atatcctgca gaccgaccaa 1260
accacgcaga cggcctatgc aaaatcccgc gcctgggatg gcaaggaact ggcttcactg 1320
ctggcgtgga cccatcaaat gaaagcaaag aactggcagg aatggaccca gcaagcagct 1380
aaacaggccc tgacgattaa ttggtattac gcagatgtca acggcaatat cggttacgtg 1440
cataccggcg cgtatccgga tcgtcagtcc ggtcacgacc cgcgtctgcc ggtcccgggt 1500
acgggtaaat gggattggaa gggcctgctg ccgtttgaaa tgaacccgaa agtgtacaat 1560
ccgcaatcag gttatattgc aaactggaac aattctccgc agaaggatta tccggctagt 1620
gacctgtttg cgttcctgtg gggcggtgcg gatcgtgtga ccgaaattga ccgcctgctg 1680
gaacaaaaac cgcgtctgac cgcagatcag gcatgggacg ttatccgtca aacgagccgc 1740
caggatctga atctgcgtct gttcctgccg accctgcagg cagcaacctc cggtctgacg 1800
caatcagacc cgcgtcgcca gctggttgaa accctgacgc gttgggatgg tattaacctg 1860
ctgaatgatg acggcaaaac ctggcagcaa ccgggttcgg ccatcctgaa cgtgtggctg 1920
accagcatgc tgaaacgcac ggtcgtggca gctgttccga tgccgtttga caagtggtac 1980
tcggcgagcg gttatgaaac cacgcaggat ggcccgaccg gttccctgaa tatttcagtt 2040
ggcgccaaaa tcctgtatga agcagtccaa ggtgacaaga gcccgattcc gcaggccgtt 2100
gacctgtttg caggcaaacc gcagcaagaa gttgtcctgg cggccctgga agatacctgg 2160
gaaacgctgt ccaaacgtta cggtaacaat gtttcaaact ggaagacccc ggctatggcg 2220
ctgacgtttc gcgcgaacaa tttcctgggt gtcccgcagg cagctgcaga agaaacccgt 2280
catcaagccg aatatcagaa ccgcggtacg gaaaatgata tgattgtgtt ttcgccgacc 2340
acgagcgacc gtccggttct ggcttgggat gtggttgcgc cgggccagag tggttttatc 2400
gccccggatg gcaccgtgga caaacactac gaagaccagc tgaagatgta tgaaaatttc 2460
ggtcgtaaat cgctgtggct gaccaagcag gatgttgaag cgcataaaga aagccaagaa 2520
gttctgcacg tccagcgc 2538
<210> 6
<211> 2538
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 人工设计的青霉素G酰化酶酶原PGA3的核苷酸序列
<400> 6
atgaaaaatc gcaaccgtat gatcgtcaac tgtgtcaccg cttctctgat gtattattgg 60
tcgctgccgg ctctggctga acaactgagc tctgaaatta aaatcgtgcg tgacgaatac 120
ggcatgccgc atatttatgc aaacgatacc tggcacctgt tttatggcta cggttatgtg 180
gttgcgcaag atcgcctgtt ccagatggaa atggctcgtc gcagcaccca gggtacggtc 240
gcagaagtgc tgggcaagga tttcgtgaag ttcgataagg acatccgtcg caattactgg 300
ccggacgcca ttcgtgcaca gatcgcggcc ctgtctccgg aagatatgag tattctgcag 360
ggctatgccg atggtatgaa cgcatggatc gacaaagtta acaccaatcc ggaaacgctg 420
ctgccgaaac agtttaatac ctttggcttc acgccgaagc gttgggaacc gtttgatgtc 480
gctatgattt tcgtgggtac catggcgaac cgcttcgtcg attccacgtc agaaatcgac 540
aatctggcac tgctgaccgc tctgaaggat aagtatggcg ttagccaggg tatggcggtc 600
tttaaccagc tgaaatggct ggtgaatccg tctgctccga ccacgattgc ggtccaagaa 660
agtaactacc cgctgaaatt caaccagcaa aattctcaga ccgcagctct gctgccgcgt 720
tatgatctgc cggcaccgat gctggaccgt ccggctaaag gtgcagatgg tgcactgctg 780
gcactgaccg ctggcaagaa ccgcgaaacg attgcggccc agtttgcaca aggcggtgca 840
aacggtctgg caggttaccc gaccacgtcg aatatgtggg ttattggtaa aagcaaggct 900
caagatgcca aagcaatcat ggtcaatggt cctcaagcag gttggtatgc tccggcatac 960
acctatggca tcggtctgca tggcgccggt tacgatgtga ccggcaacac gccgtttgca 1020
tatccgggtc tggtgttcgg ccacaatggt gttatttctt ggggcagtac cgccggcttt 1080
ggtgatgacg ttgatatctt cgccgaacgt ctgtctgcag aaaaaccggg ctattacctg 1140
cataatggta aatgggtcaa gatgctgagt cgtgaagaaa ccattacggt gaaaaacggc 1200
caggcggaaa cctttacggt gtggcgcacc gttcacggta atatcctgca gaccgaccaa 1260
accacgcaga cggcctatgc aaaatcccgc gcctgggatg gcaaggaact ggcttcactg 1320
ctggcgtgga cccatcaaat gaaagcaaag aactggcagg aatggaccca gcaagcagct 1380
aaacaggccc tgacgattaa ttggtattac gcagatgtca acggcaatat cggttacgtg 1440
cataccggcg cgtatccgga tcgtcagtcc ggtcacgacc cgcgtctgcc ggtcccgggt 1500
acgggtaaat gggattggaa gggcctgctg ccgtttgaaa tgaacccgaa agtgtacaat 1560
ccgcaatcag gttatattgc aaactggaac aattctccgc agaaggatta tccggctagt 1620
gacctgtttg cgttcctgtg gggcggtgcg gatcgtgtga ccgaaattga ccgcctgctg 1680
gaacaaaaac cgcgtctgac cgcagatcag gcatgggacg ttatccgtca aacgagccgc 1740
caggatctga atctgcgtct gttcctgccg accctgcagg cagcaacctc cggtctgacg 1800
caatcagacc cgcgtcgcca gctggttgaa accctgacgc gttgggatgg tattaacctg 1860
ctgaatgatg acggcaaaac ctggcagcaa ccgggttcgg ccatcctgaa cgtgtggctg 1920
accagcatgc tgaaacgcac ggtcgtggca gctgttccga tgccgtttga caagtggtac 1980
tcggcgagcg gttatgaaac cacgcaggat ggcccgaccg gttccctgaa tatttcagtt 2040
ggcgccaaaa tcctgtatga agcagtccaa ggtgacaaga gcccgattcc gcaggccgtt 2100
gacctgtttg caggcaaacc gcagcaagaa gttgtcctgg cggccctgga agatacctgg 2160
gaaacgctgt ccaaacgtta cggtaacaat gtttcaaact ggaagacccc ggctatggcg 2220
ctgacgtttc gcgcgaacaa tttcctgggt gtcccgcagg cagctgcaga agaaacccgt 2280
catcaagccg aatatcagaa ccgcggtacg gaaaatgata tgattgtgtt ttcgccgacc 2340
acgagcgacc gtccggttct ggcttgggat gtggttgcgc cgggccagag tggttttatc 2400
gccccggatg gcaccgtgga caaacactac gaagaccagc tgaagatgta tgaaaatttc 2460
ggtcgtaaat cgctgtggct gaccaagcag gatgttgaag cgcataaaga aagccaagaa 2520
gttctgcacg tccagcgc 2538
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> T7上游引物
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> T7下游引物
<400> 8
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<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
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<400> 9
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<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> βPhe24-R反向引物
<400> 12
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<210> 13
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> βPhe71-F正向引物
<400> 13
tcaacgtcat caccgccgcc ggcggtact 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> βPhe71-R反向引物
<400> 14
agtaccgccg gcggcggtga tgacgttga 29
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<213> artificial sequence
<220>
<223> βVal148-F正向引物
<400> 15
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> βVal148-R反向引物
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<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> βIle363-F正向引物
<400> 17
caaacggcat cggaacagct gccacgaccg tgcgt 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> βIle363-R反向引物
<400> 18
acgcacggtc gtggcagctg ttccgatgcc gtttg 35
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> βPhe460-F正向引物
<400> 19
tgcgggacac ccaggaaatt gttcgcgc 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> βPhe460-R反向引物
<400> 20
gcgcgaacaa tttcctgggt gtcccgca 28
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> αSer149-F正向引物
<400> 21
tgacgtggaa tcgacgaagc ggttcgc 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> αSer149-R反向引物
<400> 22
gcgaaccgct tcgtcgattc cacgtca 27

Claims (8)

1.一种人工设计的青霉素G酰化酶原，其特征在于：所述的人工设计的青霉素G酰化酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或如SEQ ID NO.3所示。
2.一种编码人工设计的青霉素G酰化酶原的核苷酸序列，其特征在于：是依据密码子表以及所用的宿主偏好性对权利要求1所述的人工设计的青霉素G酰化酶原转换得到。
3.一种表达人工设计的青霉素G酰化酶原的重组载体，其特征在于：是将权利要求2所述的编码所述的人工设计的青霉素G酰化酶原的核苷酸序列克隆到表达载体上得到。
4.根据权利要求3所述的表达人工设计的青霉素G酰化酶原的重组载体，其特征在于：所述的表达载体为pET9a、pET28a、pET28a-c(+)、pET30a-c(+)或pET33b(+)。
5.一种表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株，其特征在于：是将权利要求4所述的人工设计的青霉素G酰化酶原的重组载体转化到宿主菌株得到。
6.根据权利要求5所述的表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株，其特征在于：所述的宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.权利要求5或6所述的表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株的发酵方法，其特征在于包括如下步骤：将所述的表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株接种到发酵培养基中，进行发酵，具体如下：
发酵条件如下：温度控制在28℃～32℃之间，pH值控制在6.5～7.0之间，搅拌转速控制在150rpm～700rpm之间，空气流速控制在200L/h～1600L/h之间，溶解氧（DO）控制在5～50%的最大氧饱和度，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3mM；当碳源耗尽时开始补料，采用匀速补料，补料速率控制在0.6mL•min-1•L-1；
所述的发酵培养基的组成如下：每升含有酵母粉3g、蛋白胨5g、氯化钠1g、磷酸二氢钾3g、磷酸氢二钠3.25g、二水合氯化钙0.014g、硫酸镁1g、甘油4.125g、硫酸铵6g、微量元素0.875mL；用水定容至1L，pH6.5～7.0；
所述的微量元素的组成如下：每升含有四水合氯化亚铁22.87g、氯化锌1.31g、六水合氯化钴2g、二水合钼酸钠2g、二水合氯化钙1g、二水合氯化铜1.25g、硼酸0.5g、一水合硫酸锰2.17g、浓度为质量百分比37%的浓盐酸100mL，用水定容至1L；
所述的补料的组成如下：每升含有500g甘油，25g酵母粉，40g蛋白胨，余量为水。
8.权利要求1所述的人工设计的青霉素G酰化酶原在阿莫西林合成中的应用。
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