CN111621452A - 一株生产d-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株生产D‑对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌。本发明提供了重组菌，为共表达海因酶编码基因和N‑氨甲酰水解酶编码基因的枯草芽孢杆菌。本发明通过表达经过密码子优化的来源于Bacillus stearothermophilus SD‑1的D‑海因酶基因和来源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291的N‑氨甲酰水解酶基因，更换Pcry3A启动子，成功构建出了一株可催化生产D‑对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌菌株，通过加入不同浓度甲苯溶液，发现细胞壁通透性为限制催化反应的主要因素，为后续实验提供基础。其中加入甲苯浓度为0.2％时，可使产量稳定提高约39.6％。

Description

一株生产D-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株生产D-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌。
背景技术
具有光学活性的D-氨基酸是医药、化妆品和食品的重要原料，广泛用作半合成抗生素、肽类激素和拟除虫菊酯等杀虫剂的中间体。其中D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)主要用于半合成β-内酰胺类抗生素，如头孢氨苄、头孢羟基卞、阿莫西林(羟氨苄青霉素)等，在临床上的应用十分广泛。因此D-对羟基苯甘氨酸在抗生素工业中具有重要价值。
由于化学法在进行去氨基甲酰化生产中具有产率低和产生大量废物等问题，因此越来越多的关注点集中在生物酶法催化。生物转化生成D-对羟基苯甘氨酸主要由海因酶、N-氨甲酰水解酶联合催化。
以E.coli为宿主催化D-对羟基苯甘氨酸的生产仍存在许多不利因素，如共表达N-氨甲酰水解酶易形成包涵体，加大酶活性的不平衡等问题，因此急需更有利于该酶表达的宿主，而枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)其基因操作水平成熟，作为GRAS(GenerallyRecognized as Safe)等级菌株，有长期制备发酵食品的历史，可尝试来克服E.coli的缺陷。
发明内容
为了以枯草芽孢杆菌为宿主催化D-对羟基苯甘氨酸的生产，本发明的一个目的是提供一种重组菌。
本发明提供的重组菌，为共表达海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的枯草芽孢杆菌。
上述重组菌中，所述海因酶编码基因源于Bacillus stearothermophilus SD-1，且进行2个位点的突变M63I和F159S，具体基因编码的氨基酸序列为序列2；
所述N-氨甲酰水解酶编码基因源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291；
和/或，所述海因酶的氨基酸序列为序列2；
所述N-氨甲酰水解酶的氨基酸序列为序列4；
和/或，所述海因酶编码基因的核苷酸序列为序列1；
所述N-氨甲酰水解酶编码基因的核苷酸序列为序列3。
上述重组菌中，所述海因酶编码基因紧邻启动海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因共表达的启动子(顺序为启动子、海因酶编码基因、N-氨甲酰水解酶编码基因)。
上述重组菌中，所述重组菌中，启动所述海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因表达的启动子为Pcry3A；
和/或，所述枯草芽孢杆菌WB600。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述重组菌的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将含有海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的融合基因片段及其启动子导入枯草芽孢杆菌中，得到重组菌。
上述方法中，所述将含有海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的融合基因片段及其启动子导入枯草芽孢杆菌中为将所述融合基因片段及其启动子通过重组载体导入所述枯草芽孢杆菌；
所述重组载体为将所述融合基因片段插入表达载体得到的载体，且所述融合基因片段与所述表达载体中的所述启动子共表达。
上述方法中，所述重组载体中，所述海因酶编码基因紧邻所述启动子；
和/或，所述启动子为Pcry3A；
和/或，所述海因酶编码基因源于Bacillus stearothermophilus SD-1含突变M63I/F159S；
所述N-氨甲酰水解酶编码基因源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291；
和/或，所述海因酶的氨基酸序列为序列2；
所述N-氨甲酰水解酶的氨基酸序列为序列4；
和/或，所述海因酶编码基因的核苷酸序列为序列1；
所述N-氨甲酰水解酶编码基因的核苷酸序列为序列3。
上述重组菌在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第3个目的是提供一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述重组菌催化底物D-对羟基苯海因，得到D-对羟基苯甘氨酸。
上述方法中，所述催化反应体系中含有甲苯；
和/或，所述甲苯在所述催化反应体系中的体积百分含量为0.05％-2.0％。
有益效果：
本发明通过表达经过密码子优化的来源于Bacillus stearothermophilus SD-1的D-海因酶基因和来源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291的N-氨甲酰水解酶基因，成功构建出了一株可催化生产D-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌菌株，并且实现了该两种外源蛋白在菌体内的良好表达；确定了适合于枯草系统内表达的两基因位置关系后，通过启动子优化，更换Pcry3A启动子可使产量提高10.44％，反应2h转化率至51.8％，效果显著；通过加入不同浓度甲苯溶液，发现细胞壁通透性为限制催化反应的主要因素，为后续实验提供基础。其中加入甲苯浓度为0.2％时，可使产量稳定提高约39.6％。
附图说明
图1为D-对羟基苯甘氨酸的反应流程。
图2为重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)的粗酶提取物进行SDS-PAGE分析。
图3为重组载体pMA501中基因位置图。
图4为重组菌中D-海因酶基因(Hase)和N-氨甲酰水解酶基因(Case)基因位置对产物的影响。
图5为重组菌中目的基因启动子优化结果。
图6为不同浓度甲苯溶液对枯草芽孢杆菌产量的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
D-对羟基苯甘氨酸的反应流程如图1所示。
实施例1、表达D-海因酶基因(Hase)和N-氨甲酰水解酶基因(Case)的重组枯草芽孢杆菌及其在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用
图1为D-对羟基苯甘氨酸的反应流程。
一、表达D-海因酶基因(Hase)和N-氨甲酰水解酶基因(Case)的重组枯草芽孢杆菌的制备
海因酶蛋白氨基酸序列为序列2，该蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列1；
N-氨甲酰水解酶蛋白氨基酸序列为序列4，该蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列3。
1、重组载体的构建
重组载体pMA50为将含有海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的融合基因片段替换载体pMA5(Zhou et al.Characterization and high efficiency secretedexpression in Bacillus subtilis of a thermo alkaline β mannanase from analkaliphilic Bacillus clausii strain S10,Microb Cell Fact(2018)17:124)的NdeI和BamHI酶切位点间的DNA片段得到载体，且该融合基因片段插入载体的PHpaII启动子的后面，该启动子驱动D-海因酶基因(Hase)和N-氨甲酰水解酶基因(Case)的表达。
含有海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的融合基因片段的核苷酸序列为序列5，序列5中第1-1419为海因酶编码基因，第1458-2372位为N-氨甲酰水解酶编码基因。
2、重组菌的构建及诱导表达
1)重组菌的构建
重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA50为将重组载体pMA50转入枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis WB600中，得到重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA50。
对照菌为将载体pMA5转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中，得到对照菌WB600/pMA5。
2)、重组菌的诱导表达
将重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA50培养在含有20μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培养基中，37℃220rpm培养14h，在600nm吸光值下测量生物量OD值,取8OD的菌体5000xg离心2min,收集菌体；用50mM Tris-HCL buffer(pH 8.0)重悬菌体洗涤一遍,离心，用50mMTris-HCL(pH 8.0)重悬菌体,并加入终浓度为20mg/mL的溶菌酶处理30min,利用超声破碎仪破碎菌体，超声功率为60W，超声3s，停顿5s，破碎10min后离心12000rpm 10min，上清即粗酶提取物。以对照菌WB600/pMA5为对照。
SDS-PAGE分析粗酶提取物，结果如图2所示，1为对照菌WB600/pMA5；2为重组菌WB600/pMA50；M.Marker；可以看出，D-海因酶基因(Hase)和N-氨甲酰水解酶基因(Case)在枯草中表达良好。
二、重组枯草芽孢杆菌生产D-对羟基苯甘氨酸
1、细胞催化
将重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA50培养在含有20μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培养基中，37℃220rpm培养14h，5000xg离心2min收集菌体；用50mM Tris-HCL buffer(pH8.0)重悬菌体洗涤一遍，离心，用反应液(包含20mM底物D-对羟基苯海因，1mM Mncl2、1Mm DTT的50mM Tris-HCL(pH 8.0))重悬菌体，至10OD/mL，37℃条件下220rpm振荡催化反应2h。立即加入100μl 2mol/L的盐酸水溶液终止反应。
2、检测
标品溶液的配置：精密配置0.25mM、0.5mM、1mM的D-对羟基苯甘氨酸作为标品，记录出峰时间及相应的峰面积，根据不同浓度标品的峰面积做出标准曲线(y＝4039.8x-163.4，R2＝0.9997，浓度为横坐标(mM)，峰面积为纵坐标)。
将上述1的反应产物离心(5000xg,10min)收取上清液，进行适当稀释，经0.22μM过滤后，滤液注入高效液相色谱测定(色谱柱：Poroshell 120EC18-2.7m(4.6mm×50mm)；流动相：10％乙腈；检验波长：230nm；流速：0.1ml/min)。
Figure BDA0001981318160000041
经过测定，重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA50通过细胞催化，可将底物D-对羟基苯海因经过两步酶促反应，最终生成D-对羟基苯甘氨酸；反应30min，生成产物D-HPG3.82mM，转化率19.1％。
实施例2、重组菌中D-海因酶基因(Hase)和N-氨甲酰水解酶基因(Case)基因位置对产物的影响
一、表达N-氨甲酰水解酶基因(Case)和D-海因酶基因(Hase)的重组枯草芽孢杆菌的制备
1、重组载体的构建
重组载体pMA501(图3，启动子为HpaII)为将含有N-氨甲酰水解酶编码基因和海因酶编码基因融合基因片段替换载体pMA5的NdeI和BamHI酶切位点间的DNA片段得到载体，表达N-氨甲酰水解酶基因(Case)和D-海因酶基因(Hase)。
含有N-氨甲酰水解酶编码基因和海因酶编码基因融合基因片段的核苷酸序列为序列6，序列6中第1-915位为N-氨甲酰水解酶编码基因,第954-2372为海因酶编码基因。
2、重组菌的构建及诱导表达
与实施例1相同，得到重组菌WB600/pMA501。
二、重组枯草芽孢杆菌生产D-对羟基苯甘氨酸
1、细胞催化
重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA501按照实施例1的方法催化反应。
2、检测
按照实施例1的方法检测催化反应0.5h和2h的反应产物。以重组菌WB600/pMA50为对照。
结果如图4所示，
反应0.5h重组菌WB600/pMA50(Hase+case)产生D-HPG 3.82±0.83mM，2h产生9.38±0.38mM；
反应0.5h重组菌WB600/pMA501(case+Hase)产生D-HPG 3.16±0.01mM，2h产生8.55±0.01mM。
上述结果可以看出重组菌WB600/pMA50产生D-HPG的量较高，因此选择pMA50载体中2种酶基因的连接方式。
实施例3、重组菌中目的基因启动子优化
一、重组菌的制备
1、重组载体的构建
重组载体pMA50-Pcry3A为将重组载体pMA50载体上的PHpaII启动子替换为Pcry3A(序列7，得到重组载体pMA50-Pcry3A。
具体方法如下：使用SpeI-F(5’gtttaaaggtggagatttttACTAGTtgagtgatcttctcaaaaaatac3’(下划线为SpeI酶切位点序列))及它的互补链SpeI-R作为引物，以质粒pMA50(Hase+case)为模板，扩增出整个质粒，得到在启动子PHpaII序列前含有SpeI酶切位点的载体pMA51。通过基因合成，合成启动子Pcry3A序列(金斯瑞，南京)，序列两端含有SpeI及XhoI酶切位点，替换pMA50中SpeI和XhoI中酶切位点间的DNA片段得到载体pMA50-Pcry3A。
2、重组菌的构建及诱导表达
将上述重组载体转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中，得到重组菌WB600/pMA50-Pcry3A。
二、重组枯草芽孢杆菌生产D-对羟基苯甘氨酸
1、细胞催化
采用实施例1的方法将上述重组菌进行细胞催化。
2、检测
取反应0.5h和2h的反应产物按照实施例1二的2的方法检测。以重组菌WB600/pMA50(PHpaII)为对照。
结果如图5所示，HpaII、cry3A分别代表重组菌WB600/pMA50-PHpaII、重组菌WB600/pMA50-Pcry3A；可以看出，重组菌WB600/pMA50-Pcry3A产量最高，反应0.5h产生D-HPG 4.04±0.03mM，2h产生10.36±0.37mM，与原始PHpaII相比提高10.44％。
上述结果表明，重组菌WB600/pMA50-Pcry3A生产D-对羟基苯甘氨酸的产量最高。
实施例4、甲苯溶液对枯草芽孢杆菌产量的影响
添加不同浓度甲苯溶液可不同程度提高细胞通透性，增加细胞对底物的摄取，同时可增加底物的溶解度，因此尝试了不同种类的甲苯溶液，添加量选为0.05％、0.1％、0.2％、0.8％、1.0％和2.0％(v/v)。
1、细胞催化-不同浓度的甲苯溶液
不同浓度的甲苯溶液添加组：将重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA50-PHpaII培养在含有20μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培养基中，37℃220rpm培养14h，离心收集菌体；用50mM Tris-HCL buffer(pH 8.0)重悬菌体洗涤一遍，离心，用反应液重悬菌体，至10OD/mL，37℃条件下220rpm振荡催化反应2h。立即加入100μl 2mol/L的盐酸水溶液终止反应。
上述反应液由20mM底物D-对羟基苯海因、1mM Mncl2、1Mm DTT、不同浓度的甲苯和50mM Tris-HCL(pH 8.0)缓冲液组成。
甲苯不同浓度分别为0.05％或0.1％或0.2％或0.8％或1.0％或2.0％(体积百分含量)。
对照组：与不同浓度的甲苯添加组相比，不额外添加任何甲苯。
2、检测
取反应0.5h、2h和4h的反应产物按照实施例1二的2的方法检测。以不添加甲苯为对照。
结果如图6所示，当甲苯浓度为0.2％时，反应0.5h产生D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)4.45±0.22mM，2h产生9.82±0.25mM，4h产生12.76±0.86mM，与对照组相比约稳定提高39.6％；当甲苯浓度大于等于0.5％，0.5h产生D-HPG约为8.48mM，与对照组相比产量提高了100％。但是由于甲苯的毒性作用，影响了接下来细胞的催化活力，因此本实验中最适合有效的甲苯浓度为0.2％。并且通过该实验确定了在B.subtilis中细胞壁通透性为限制反应的关键因素，为后续实验奠定了基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所 中国科学院大学 北京优酶科技发展有限公司
<120> 一株生产D-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌
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<170> PatentIn version 3.5
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aaaaagggaa cgatcgtggt gggctcagat gcagatctgg tgattttcga cccgaacatc 1200
gaacgcgtga tctcagcgga gacacatcac atggcggtgg actacaacgc gtttgaggga 1260
atgaaagtta cgggcgaacc ggtttcagtt ctgtgccgcg gcgaatttgt ggtgcgcgac 1320
aaacagttcg tgggcaagcc cggttacggc cagtatttaa aaagagcgaa atacggaacg 1380
agcacgatca gcaagcagag cgaagaactt acgatttaa 1419
<210> 2
<211> 472
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Thr Lys Ile Ile Lys Asn Gly Thr Ile Val Thr Ala Thr Asp Thr
1 5 10 15
Tyr Glu Ala His Leu Leu Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Met Ile Gly
20 25 30
Gln Asn Leu Glu Glu Lys Gly Ala Glu Val Ile Asp Ala Lys Gly Cys
35 40 45
Tyr Val Phe Pro Gly Gly Ile Asp Pro His Thr His Leu Asp Ile Pro
50 55 60
Leu Gly Gly Thr Val Thr Lys Asp Asp Phe Glu Ser Gly Thr Ile Ala
65 70 75 80
Ala Ala Phe Gly Gly Thr Thr Thr Ile Ile Asp Phe Cys Leu Thr Asn
85 90 95
Lys Gly Glu Pro Leu Lys Lys Ala Ile Glu Thr Trp His Asn Lys Ala
100 105 110
Asn Gly Lys Ala Val Ile Asp Tyr Gly Phe His Leu Met Ile Ser Glu
115 120 125
Ile Thr Asp Asp Val Leu Glu Glu Leu Pro Lys Val Leu Glu Glu Glu
130 135 140
Gly Ile Thr Ser Leu Lys Val Phe Met Ala Tyr Lys Asn Val Ser Gln
145 150 155 160
Ala Asp Asp Gly Thr Leu Tyr Cys Thr Leu Leu Ala Ala Lys Glu Leu
165 170 175
Gly Ala Leu Val Met Val His Ala Glu Asn Gly Asp Val Ile Asp Tyr
180 185 190
Leu Thr Lys Lys Ala Leu Ala Asp Gly Asn Thr Asp Pro Ile Tyr His
195 200 205
Ala Leu Thr Arg Pro Pro Glu Leu Glu Gly Glu Ala Thr Gly Arg Ala
210 215 220
Cys Gln Leu Thr Glu Leu Ala Gly Ser Gln Leu Tyr Val Val His Val
225 230 235 240
Thr Cys Ala Gln Ala Val Glu Lys Ile Ala Glu Ala Arg Asn Lys Gly
245 250 255
Leu Asp Val Trp Gly Glu Thr Cys Pro Gln Tyr Leu Val Leu Asp Gln
260 265 270
Ser Tyr Leu Glu Lys Pro Asn Phe Glu Gly Ala Lys Tyr Val Trp Ser
275 280 285
Pro Pro Leu Arg Glu Lys Trp His Gln Glu Val Leu Trp Asn Ala Leu
290 295 300
Lys Asn Gly Gln Leu Gln Thr Leu Gly Ser Asp Gln Cys Ser Phe Asp
305 310 315 320
Phe Lys Gly Gln Lys Glu Leu Gly Arg Gly Asp Phe Thr Lys Ile Pro
325 330 335
Asn Gly Gly Pro Ile Ile Glu Asp Arg Val Ser Ile Leu Phe Ser Glu
340 345 350
Gly Val Lys Lys Gly Arg Ile Thr Leu Asn Gln Phe Val Asp Ile Val
355 360 365
Ser Thr Arg Ile Ala Lys Leu Phe Gly Leu Phe Pro Lys Lys Gly Thr
370 375 380
Ile Val Val Gly Ser Asp Ala Asp Leu Val Ile Phe Asp Pro Asn Ile
385 390 395 400
Glu Arg Val Ile Ser Ala Glu Thr His His Met Ala Val Asp Tyr Asn
405 410 415
Ala Phe Glu Gly Met Lys Val Thr Gly Glu Pro Val Ser Val Leu Cys
420 425 430
Arg Gly Glu Phe Val Val Arg Asp Lys Gln Phe Val Gly Lys Pro Gly
435 440 445
Tyr Gly Gln Tyr Leu Lys Arg Ala Lys Tyr Gly Thr Ser Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Gln Ser Glu Glu Leu Thr Ile
465 470
<210> 3
<211> 915
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atgacaagac agatgattct ggcagtgggc cagcaaggtc ctattgcgag agcggaaaca 60
cgcgaacaag ttgtggttcg ccttctggat atgctgacaa aagcggcaag cagaggcgcg 120
aactttatcg tgtttcccga actggcgctg acgacgtttt tcccgcgctg gcattttaca 180
gatgaggcgg agctggacag cttctatgaa acggaaatgc cgggcccggt tgttcgcccg 240
ctgtttgaaa aagcggcaga actgggcatc ggctttaatt taggctatgc agaactggtg 300
gttgaaggcg gcgtgaaacg ccgctttaac acgagcatcc ttgtggacaa gtctggtaag 360
atcgtgggca agtaccgcaa gatccattta ccgggccata aagaatatga ggcgtatcgc 420
ccgtttcagc atttagagaa acgctatttt gagccgggcg atctgggatt tccggtttac 480
gatgtggatg cggcaaagat gggcatgttc atctgcaacg atcgccgctg gccggaagcg 540
tggagagtga tgggtttaag aggagcggaa atcatctgcg gcggctataa tacgccgaca 600
cacaatccgc cggtgcctca gcatgaccat ttaacgagct ttcaccatct gcttagcatg 660
caagcgggaa gctatcagaa cggcgcatgg tcagcagcag cgggcaaagt gggcatggaa 720
gagaactgca tgctgctggg acatagctgc attgtggcgc cgactggtga aatcgtggcg 780
ctgacaacga cactggaaga cgaagtgatc acggcagcgg tggatctgga tagatgccgc 840
gaactgcgcg agcacatctt caacttcaag cagcatcgcc agccgcaaca ttacggactg 900
attgcggaac tttaa 915
<210> 4
<211> 304
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala
1 5 10 15
Arg Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Asp Met Leu
20 25 30
Thr Lys Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu
35 40 45
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu
50 55 60
Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro
65 70 75 80
Leu Phe Glu Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr
85 90 95
Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
100 105 110
Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
115 120 125
His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His
130 135 140
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr
145 150 155 160
Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
165 170 175
Trp Pro Glu Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile
180 185 190
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
195 200 205
Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser
210 215 220
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu
225 230 235 240
Glu Asn Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
245 250 255
Glu Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
260 265 270
Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn
275 280 285
Phe Lys Gln His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu
290 295 300
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
atgacaaaga tcattaaaaa cggcacgatt gtgacggcga cagatacata cgaggcgcat 60
ctgctgatca aggacggcaa aattgcgatg atcggacaga atttagagga aaaaggcgcg 120
gaagtgatcg atgcgaaagg ctgttatgtt tttccgggcg gcatcgaccc gcatacacat 180
ctggatatcc cgctgggagg cacggtgacg aaggacgatt tcgaaagcgg cacaattgcg 240
gcggcgtttg gcggaacgac gacaattatt gatttttgtt taacaaacaa gggcgaaccg 300
ctgaaaaagg caatcgaaac gtggcacaac aaggcgaatg gcaaggcagt gatcgactat 360
ggcttccatt taatgatcag cgagattacg gacgacgttc tggaagaact gccgaaggtg 420
ctggaagaag agggaatcac aagccttaaa gtgttcatgg cgtacaaaaa tgtgagccaa 480
gctgatgacg gcacgctgta ttgcacactt cttgcggcta aagagctggg cgcgctggtt 540
atggtgcacg cggaaaacgg cgatgtgatc gattatttaa cgaagaaagc actggcggat 600
ggcaacacag atccgatcta tcatgcgctg acgagaccgc ccgaactgga aggcgaagca 660
actggtcgcg catgccagct gacagaactg gcgggaagcc agctttatgt ggtgcacgtg 720
acgtgcgcgc aagctgttga gaaaatcgcg gaagcgcgca acaaaggttt agatgtttgg 780
ggcgaaacat gcccgcagta tttagtgctg gaccagtcat atttagagaa accgaacttt 840
gaaggcgcga aatatgtttg gagcccgccg ctgcgcgaga aatggcatca agaggtgctg 900
tggaacgcgc tgaaaaatgg acagctgcag acactgggct cagatcagtg cagcttcgat 960
ttcaagggcc agaaagaact gggccgcggc gattttacga aaatcccgaa cggcggcccg 1020
atcatcgagg atcgcgttag cattttattc agcgaaggcg tgaaaaaggg aagaatcacg 1080
ctgaatcaat ttgttgatat cgtgtcaaca cgcatcgcga agctgttcgg actgtttccg 1140
aaaaagggaa cgatcgtggt gggctcagat gcagatctgg tgattttcga cccgaacatc 1200
gaacgcgtga tctcagcgga gacacatcac atggcggtgg actacaacgc gtttgaggga 1260
atgaaagtta cgggcgaacc ggtttcagtt ctgtgccgcg gcgaatttgt ggtgcgcgac 1320
aaacagttcg tgggcaagcc cggttacggc cagtatttaa aaagagcgaa atacggaacg 1380
agcacgatca gcaagcagag cgaagaactt acgatttaag tcgacaagcg gacgccaagt 1440
ataaaggagg taccaatatg acaagacaga tgattctggc agtgggccag caaggtccta 1500
ttgcgagagc ggaaacacgc gaacaagttg tggttcgcct tctggatatg ctgacaaaag 1560
cggcaagcag aggcgcgaac tttatcgtgt ttcccgaact ggcgctgacg acgtttttcc 1620
cgcgctggca ttttacagat gaggcggagc tggacagctt ctatgaaacg gaaatgccgg 1680
gcccggttgt tcgcccgctg tttgaaaaag cggcagaact gggcatcggc tttaatttag 1740
gctatgcaga actggtggtt gaaggcggcg tgaaacgccg ctttaacacg agcatccttg 1800
tggacaagtc tggtaagatc gtgggcaagt accgcaagat ccatttaccg ggccataaag 1860
aatatgaggc gtatcgcccg tttcagcatt tagagaaacg ctattttgag ccgggcgatc 1920
tgggatttcc ggtttacgat gtggatgcgg caaagatggg catgttcatc tgcaacgatc 1980
gccgctggcc ggaagcgtgg agagtgatgg gtttaagagg agcggaaatc atctgcggcg 2040
gctataatac gccgacacac aatccgccgg tgcctcagca tgaccattta acgagctttc 2100
accatctgct tagcatgcaa gcgggaagct atcagaacgg cgcatggtca gcagcagcgg 2160
gcaaagtggg catggaagag aactgcatgc tgctgggaca tagctgcatt gtggcgccga 2220
ctggtgaaat cgtggcgctg acaacgacac tggaagacga agtgatcacg gcagcggtgg 2280
atctggatag atgccgcgaa ctgcgcgagc acatcttcaa cttcaagcag catcgccagc 2340
cgcaacatta cggactgatt gcggaacttt aa 2372
<210> 6
<211> 2372
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
atgacaagac agatgattct ggcagtgggc cagcaaggtc ctattgcgag agcggaaaca 60
cgcgaacaag ttgtggttcg ccttctggat atgctgacaa aagcggcaag cagaggcgcg 120
aactttatcg tgtttcccga actggcgctg acgacgtttt tcccgcgctg gcattttaca 180
gatgaggcgg agctggacag cttctatgaa acggaaatgc cgggcccggt tgttcgcccg 240
ctgtttgaaa aagcggcaga actgggcatc ggctttaatt taggctatgc agaactggtg 300
gttgaaggcg gcgtgaaacg ccgctttaac acgagcatcc ttgtggacaa gtctggtaag 360
atcgtgggca agtaccgcaa gatccattta ccgggccata aagaatatga ggcgtatcgc 420
ccgtttcagc atttagagaa acgctatttt gagccgggcg atctgggatt tccggtttac 480
gatgtggatg cggcaaagat gggcatgttc atctgcaacg atcgccgctg gccggaagcg 540
tggagagtga tgggtttaag aggagcggaa atcatctgcg gcggctataa tacgccgaca 600
cacaatccgc cggtgcctca gcatgaccat ttaacgagct ttcaccatct gcttagcatg 660
caagcgggaa gctatcagaa cggcgcatgg tcagcagcag cgggcaaagt gggcatggaa 720
gagaactgca tgctgctggg acatagctgc attgtggcgc cgactggtga aatcgtggcg 780
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cgcaagctgt tgagaaaatc gcggaagcgc gcaacaaagg tttagatgtt tggggcgaaa 1740
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tacgttatat agaaatatgt ttgaaccttc ttcagattac aaatatattc ggacggactc 60
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tatacctaac atgatgtagt attaaatgaa tatgtaaata tatttatgat aagaagcgac 300
ttatttataa tcattacata tttttctatt ggaatgatta agattccaat agaatagtgt 360
ataaattatt tatcttgaaa ggagggatgc ctaaaaacga agaacattaa aaacatatat 420
ttgcaccgtc taatggattt atgaaaaatc attttatcag tttgaaaatt atgtattatg 480
aaaagtgagg agggaaccga 500

Claims (10)

1.重组菌，为共表达海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的枯草芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：
所述海因酶编码基因源于Bacillus stearothermophilus SD-1；
所述N-氨甲酰水解酶编码基因源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291；
和/或，所述海因酶的氨基酸序列为序列2；
所述N-氨甲酰水解酶的氨基酸序列为序列4；
和/或，所述海因酶编码基因的核苷酸序列为序列1；
所述N-氨甲酰水解酶编码基因的核苷酸序列为序列3。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌中，所述海因酶编码基因紧邻启动海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因共表达的启动子。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：
所述重组菌中，启动所述海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因表达的启动子为Pcry3A。
5.一种制备权利要求1-4任一所述重组菌的方法，包括如下步骤：将含有海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的融合基因片段及其启动子导入枯草芽孢杆菌中，得到重组菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述将含有海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的融合基因片段及其启动子导入枯草芽孢杆菌中为将所述融合基因片段及其启动子通过重组载体导入所述枯草芽孢杆菌；
所述重组载体为将所述融合基因片段插入表达载体得到的载体，且所述融合基因片段与所述表达载体中的所述启动子共表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述重组载体中，所述海因酶编码基因紧邻所述启动子；
和/或，所述启动子为Pcry3A；
和/或，所述海因酶编码基因源于Bacillus stearothermophilus SD-1含突变M63I/F159S；
所述N-氨甲酰水解酶编码基因源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291；
和/或，所述海因酶的氨基酸序列为序列2；
所述N-氨甲酰水解酶的氨基酸序列为序列4；
和/或，所述海因酶编码基因的核苷酸序列为序列1；
所述N-氨甲酰水解酶编码基因的核苷酸序列为序列3。
8.权利要求1-4任一所述重组菌或由权利要求5-7任一所述方法制备的重组菌在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用。
9.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括如下步骤：用权利要求1-4任一所述重组菌催化底物D-对羟基苯海因，得到D-对羟基苯甘氨酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述催化反应体系中含有甲苯；
和/或，所述甲苯在所述催化反应体系中的体积百分含量为0.05％-2.0％。
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