CN103993010A - 用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌 - Google Patents
用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。本发明提供的DNA分子,包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因,由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达。本发明提供了一个能稳定、大量地表达D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的DNA分子、以及基于该DNA分子的重组载体和重组菌。同时本发明还提供了应用所述重组菌或该重组菌的发酵物将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的方法,只生成D-对羟基苯甘氨酸,无需拆分分离对映体,转化率高,整个生产过程具有条件温和、操作简单、对环境友好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。
背景技术
D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的医药中间体,用于生产β-内酰胺类半合成抗生素。β-内酰胺类半合成抗生素包括羟氨苄青霉素(阿莫西林)、头孢羟氨苄(欧意)等。与传统的青霉素G类抗生素相比,β-内酰胺类半合成抗生素具有抗菌谱广、毒性低、口服效果好等优点,临床应用广泛,市场非常巨大。据统计,2009年全球抗生素药物市场销售额为280亿美元,其中β-内酰胺类半合成抗生素约占65%,为182亿美元。从2000到2009年,仅阿莫西林和头孢羟氨苄产量就分别增长了614%和762%。这些药物的大规模生产使得D-对羟基苯甘氨酸的需求大幅增加。据悉,目前全球D-对羟基苯甘氨酸的需求量近3万吨,国内也接近2万吨。数据显示,每年全球D-对羟基苯甘氨酸的供应缺口约为6000吨,国内约3000吨,且供需矛盾随着需求量的逐年增加而越发严重。因此,开发高效的D-对羟基苯甘氨酸的生产方法非常重要。
目前,D-对羟基苯甘氨酸的生产方法主要有化学法和生物法。
化学法通过先合成DL-对羟基苯甘氨酸,然后再拆分得到D-对羟基苯甘氨酸。合成DL-对羟基苯甘氨酸主要有苯甲醛法和乙醛酸法。苯甲醛法通过使用对羟基苯甲醛与氰化钠作用生成对羟基-α-羟基苯乙腈,然后酸水解生成DL-对羟基苯甘氨酸,该法原料价格较高,且使用剧毒的氰化物,生产中存在HCN气体及含CN-废水的处理问题。乙醛酸法通过使用乙醛酸、苯酚等生成DL-对羟基苯甘氨酸,反应过程中需要大量酸碱,且需要高压。将DL-对羟基苯甘氨酸拆分成D-对羟基苯甘氨酸的常用方法有化学拆分法和诱导结晶法。化学拆分法是先将DL-对羟基苯甘氨酸在甲醇中以硫酸为催化剂制成甲醛,加入拆分剂制成DL-对羟基苯甘氨酸甲酯,再将其与拆分试剂作用生成盐,利用盐的溶解度不同分离。该法反应周期长,单程转化率低。诱导结晶法是将DL-对羟基苯海因与拆分剂在含有水醇溶液中加热制成饱和溶液,然后通过降温分离,操作繁琐,且产物不纯。综上所述,化学法在生产D-对羟基苯甘氨酸方面存在步骤繁琐、副反应多、收率较低的问题,给后续产物纯化带来困难。另外,化学法生产普遍需要高温高压,且经常使用大量酸碱,对环境污染较为严重。
生物法是以DL-对羟基苯海因作为底物,利用微生物中特定的酶或者利用其完整细胞将其转化为D-对羟基苯甘氨酸。单酶法主要是通过表达海因酶将DL-对羟基苯海因转变成N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸,然后再经过化学法水解获得D-对羟基苯甘氨酸。由于D-海因酶可以特异性地生产D-对羟基苯甘氨酸,因此该法专一性强,收率较高,但缺点是反应过程仍然需要添加大量酸,对后续处理带来问题。
发明内容
本发明的目的是提供用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。
本发明提供的DNA分子,包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因,由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达;
所述D-海因酶是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将DL-对羟基苯海因转化为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的功能的由序列1衍生的蛋白质;
所述述N-氨甲酰水解酶是如下(c)或(d):
(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸的功能的由序列3衍生的蛋白质。
所述PL启动子为如下1)或2)或3)的DNA分子:
1)序列表中序列5所示的DNA分子;
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子;
3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
所述D-海因酶基因为如下4)或5)或6)的DNA分子:
4)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子;
5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述D-海因酶的DNA分子;
6)与4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述D-海因酶的DNA分子;
所述N-氨甲酰水解酶基因为如下7)或8)或9)的DNA分子:
7)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子;
8)在严格条件下与7)限定的DNA序列杂交且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子;
9)与7)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC,0.5%SDS的溶液中,在65℃下杂交,然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
所述DNA分子可依次包括如下元件:所述PL启动子、所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因。具体来说,所述DNA分子依次由如下元件组成:所述PL启动子、限制性内切酶Sal I的酶切识别序列、所述D-海因酶基因、限制性内切酶Xba I的酶切识别序列和所述N-氨甲酰水解酶基因。
含有所述DNA分子的重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为在载体pUC18的多克隆位点(如Hind III和Kpn I酶切位点之间)插入所述DNA分子得到的重组质粒。
所述重组菌可为所述重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌DH5α。
以上任一所述DNA分子,以上任一所述重组载体,或以上任一所述重组菌,均可用于生产D-对羟基苯甘氨酸。所述应用中,用于生产D-对羟基苯甘氨酸的底物为DL-对羟基苯海因。
本发明还保护所述重组菌的发酵物。所述发酵物的制备方法可包括如下步骤:将所述重组菌进行发酵,然后收集菌体并进行超声破碎,离心收集上清液。所述发酵的条件具体可为:将所述重组菌接种至含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm、振荡培养12小时。所述超声破碎的条件具体可为:超声功率为200w,处理时间为4min,每超声3s停3s。所述离心的条件具体可为:10000rpm离心1min。
本发明还保护一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法,包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物,加入所述发酵物,反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。
本发明还保护另一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法,包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物,加入所述重组菌,反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。
本发明提供了一个能稳定、大量地表达D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的DNA分子、以及基于该DNA分子的重组载体和重组菌。该重组菌或该重组菌的发酵物可以高效转化DL-对羟基苯海因生产D-对羟基苯甘氨酸,无需添加任何诱导剂。同时本发明还提供了应用所述重组菌或该重组菌的发酵物将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的方法,只生成D-对羟基苯甘氨酸,无需拆分分离对映体,转化率高,整个生产过程具有条件温和、操作简单、对环境友好的优点。
附图说明
图1为不同重组菌生产D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的能力-电泳图;1对应重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car,2对应重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car,3对应重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car。
图2为重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car得到的上清液的HPLC图谱。
图3为三种重组菌的D-海因酶酶活和N-氨甲酰水解酶酶活的比较。
图4为实施例4的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
来源为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的D-海因酶如序列表的序列1所示,其编码基因如序列表的序列2所示。来源为假单胞菌(Pseudomonas sp.)的N-氨甲酰水解酶如序列表的序列3所示,其编码基因如序列表的序列4所示。PL启动子(又称pPL)如序列表的序列5所示。PAND启动子(又称pPAND)如序列表的序列6所示。T7A1启动子(又称pT7A1)如序列表的序列7所示。
载体pUC18:宝生物工程(大连)有限公司。大肠杆菌DH5α:天根生化科技(北京)有限公司。DL-对羟基苯海因(DL-对羟基苯海因标准品):梯希爱(上海)化成工业发展有限公司,产品编号H0806。D-对羟基苯甘氨酸标准品:梯希爱(上海)化成工业发展有限公司,产品编号H0758。N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸标准品:用D-海因酶水解DL-对羟基苯海因获得(参考文献:Dong-Cheol Lee,Hak-Sung Kim.Optimization ofa heterogeneous reaction system for the production of optically active D-aminoacids using thermostable D-hydantoinase.BiotechnologyBioengineering.1998,60(6),729-738.)。
实施例1、重组质粒的构建
一、重组质粒pUC-hyd-car的构建
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板,用hyd-for和hyd-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
hyd-for:5’-TGCTTGTCGACATGAGCACTGTCATCAAGGG-3’;
hyd-rev:5’-ACGAACTCTAGATCAGACGCCGCTTGCGGGAAT-3’。
3、用限制性内切酶Sal I和Xba I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Sal I和Xba I双酶切载体pUC18,回收载体骨架(约2680bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-hyd。
6、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。。
7、以步骤6合成的双链DNA分子为模板,用car-for和car-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
car-for:5’-TGCTTTCTAGAATGACACGCATCGTCAATGCAGCCG-3’;
car-rev:5’-TGCTTGGTACCTCACTGCGGCGGCGGCACA-3’。
8、用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切步骤7的PCR扩增产物,回收酶切产物。
9、用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切重组质粒pUC-hyd,回收载体骨架(约4135bp)。
10、将步骤8的酶切产物和步骤9的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-hyd-car。
根据测序结果,对重组质粒pUC-hyd-car进行结构描述如下:以载体pUC18为骨架载体,在Sal I和Xba I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的D-海因酶基因,在Xba I和Kpn I酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的N-氨甲酰水解酶基因。
二、重组质粒pUC-pPL-hyd-car的构建
1、合成序列表的序列5所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板,用pPL-FOR和pPL-REV组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
pPL-FOR:5’-TGCTTAAGCTTCATACAGATAACCATCTGCG-3’;
pPL-REV:5’-TGCTTGTCGACGTGGTCAGTGCGTCCTGCTG-3’。
3、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切重组质粒pUC-hyd-car,回收载体骨架(约5056bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-pPL-hyd-car。
根据测序结果,对重组质粒pUC-pPL-hyd-car进行结构描述如下:在重组质粒pUC-hyd-car的Hind III和Sal I酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的PL启动子。
三、重组质粒pUC-pPAND-hyd-car的构建
1、合成序列表的序列6所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板,用pPAND-FOR和pPAND-REV组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
pPAND-FOR:5’-TGCTTAAGCTTAATATTCCTTTCCTTGTC-3’;
pPAND-REV:5’-TGCTTGTCGACCTGTGGTGTCCTTATGGGGG-3’。
3、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切重组质粒pUC-hyd-car,回收载体骨架(约5056bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-pPAND-hyd-car。
根据测序结果,对重组质粒pUC-pPAND-hyd-car进行结构描述如下:在重组质粒pUC-hyd-car的Hind III和Sal I酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的PAND启动子。
四、重组质粒pUC-pT7A1-hyd-car的构建
1、合成序列表的序列7所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板,用pT7A1-FOR和pT7A1-REV组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
pT7A1-FOR:5’-GCTTAAGCTTTCTTTATTAATACAACTCAC-3’;
pT7A1-REV:5’-TGCTTGTCGACCTATTCGCCGTGTCCCTCTC-3’。
3、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切重组质粒pUC-hyd-car,回收载体骨架(约5056bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-pT7A1-hyd-car。
根据测序结果,对重组质粒pUC-pT7A1-hyd-car进行结构描述如下:在重组质粒pUC-hyd-car的Hind III和Sal I酶切位点之间插入了序列表的序列7所示的T7A1启动子。
实施例2、重组菌的制备
将重组质粒pUC-pPL-hyd-car导入大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car。
将重组质粒pUC-pPAND-hyd-car导入大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car。
将重组质粒pUC-pT7A1-hyd-car导入大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car。
实施例3、不同重组菌表达目的蛋白水平的比较
分别将实施例2制备的各个重组菌进行如下操作:
1、挑取重组菌单菌落接种于15ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm振荡培养,得到OD600nm=2.8的菌液。
2、取10ml步骤1得到的菌液,转接至100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,得到OD600nm=3.0的初始发酵体系,37℃、200rpm、振荡培养12小时,得到终止发酵体系。
3、取2mL终止发酵体系,10000rpm离心1min,收集菌体沉淀,超声破碎(超声功率为200w,处理时间为4min,每超声3s停3s),然后10000rpm离心1min,收集上清液。
4、取步骤3得到的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,见图1。
D-海因酶的预期分子量为53KD,N-氨甲酰水解酶的预期分子量为35KD。三种重组菌均显示有对应D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的预期分子量的条带,且重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car发酵产生的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶最多,显著高于重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car和重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car。
5、取800μL步骤3得到的上清液,加入0.02g DL-对羟基苯海因,37℃静置反应30min,然后12000rpm离心1min,取上清液,用双蒸水稀释至50倍体积后进行HPLC检测。
HPLC检测采用Agilent色谱柱(Eclipse XDB-C18,5μm,4.6×150mm),流动相为0.041g/L的乙酸钠水溶液(pH2.7),流速1ml/min,紫外检测波长为270nm。重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car步骤3得到的上清液的HPLC图谱见图2,DL-对羟基苯海因、N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸、D-对羟基苯甘氨酸的出峰位置分别为5.600min、3.863min、1.655min,均与DL-对羟基苯海因标准品、N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸标准品和D-对羟基苯甘氨酸标准品的出峰位置相同。重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car步骤3得到的上清液和重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car步骤3得到的上清液的HPLC图谱与重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car得到的上清液的HPLC图谱一致。
用DL-对羟基苯海因标准品制作的标准曲线方程为:y=554x,y代表峰面积,x代表DL-对羟基苯海因浓度(单位mM)。
用N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸标准品制作的标准曲线方程为:y=520.68x,y代表峰面积,x代表N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸浓度(单位mM)。
用D-对羟基苯甘氨酸标准品制作的标准曲线方程为:y=577.96x,y代表峰面积,x代表D-对羟基苯甘氨酸浓度(单位mM)。
每分钟生成1μmol产物所需要的酶量定义为一个酶活单位。计算D-海因酶酶活时,底物为DL-对羟基苯海因,产物为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸。计算N-氨甲酰水解酶酶活时,底物为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸,产物为D-对羟基苯甘氨酸。
重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活为0.6±0.02U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活为0.8±0.02U/ml。重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活为0.5±0.04U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活为0.67±0.07U/ml。重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活为0.31±0.05U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活为0.54±0.04U/ml。
三种重组菌的D-海因酶酶活和N-氨甲酰水解酶酶活的比较见图3。结果表明,重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car发酵产生的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶最多,因此其步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活和和N-氨甲酰水解酶的酶活也最高。
实施例4、采用重组菌全细胞生产D-对羟基苯甘氨酸
分别将实施例2制备的各个重组菌进行如下操作:
1、挑取重组菌单菌落接种于30ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm振荡培养,得到OD600nm=2.6的菌液。
2、取30ml步骤1得到的菌液,转接至300ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,得到OD600nm=2.8的初始发酵体系,37℃、200rpm振荡培养12小时,得到终止发酵体系。
重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car得到的终止发酵体系的OD600nm=2.8。重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car得到的终止发酵体系的OD600nm=2.9。重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car得到的终止发酵体系的OD600nm=2.78。
3、取整个终止发酵体系,10000rpm离心3min,收集菌体沉淀,加入300ml30g/L的DL-对羟基苯海因水溶液,37℃、350rpm振荡反应10小时,从加入DL-对羟基苯海因水溶液的时刻开始计时(初始时刻为0时刻),每隔两小时取样,采用HPLC检测D-对羟基苯甘氨酸的浓度(HPLC检测方法见实施例3,将对应D-对羟基苯甘氨酸的峰面积代入实施例3中的用D-对羟基苯甘氨酸标准品制作的标准曲线方程)。
结果见图4。采用重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car全细胞对DL-对羟基苯海因作用10小时后,体系中的D-对羟基苯甘氨酸浓度为14.73g/L,生产速率为1.4g/L/h。采用重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car全细胞对DL-对羟基苯海因作用10小时后,体系中的D-对羟基苯甘氨酸浓度为12.29g/L。采用重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car全细胞对DL-对羟基苯海因作用10小时后,体系中的D-对羟基苯甘氨酸浓度为7.59g/L。
Claims (10)
1.一种DNA分子,包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因,由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达;
所述D-海因酶是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将DL-对羟基苯海因转化为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的功能的由序列1衍生的蛋白质;
所述述N-氨甲酰水解酶是如下(c)或(d):
(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸的功能的由序列3衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的DNA分子,其特征在于:所述PL启动子为如下1)或2)或3)的DNA分子:
1)序列表中序列5所示的DNA分子;
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子;
3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的DNA分子,其特征在于:
所述D-海因酶基因为如下4)或5)或6)的DNA分子:
4)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子;
5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述D-海因酶的DNA分子;
6)与4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述D-海因酶的DNA分子;
所述N-氨甲酰水解酶基因为如下7)或8)或9)的DNA分子:
7)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子;
8)在严格条件下与7)限定的DNA序列杂交且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子;
9)与7)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子。
4.含有权利要求1至3中任一所述DNA分子的重组载体或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体,其特征在于:所述重组载体为在载体pUC18的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌,其特征在于:所述重组菌是将权利要求5所述重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌。
7.权利要求1至3中任一所述的DNA分子,或权利要求4所述的重组载体,或权利要求5所述的重组载体,或权利要求4所述的重组菌,或权利要求6所述的重组菌,在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用。
8.权利要求4或6所述重组菌的发酵物。
9.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法,包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物,加入权利要求8所述发酵物,反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。
10.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法,包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物,加入权利要求4或6所述重组菌,反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。
Priority Applications (1)
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CN103981228A (zh) * | 2014-03-31 | 2014-08-13 | 浙江工业大学 | 一种脂肪酶催化苯海因制备n-氨甲酰基苯甘氨酸的方法 |
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