CN103993010A - 用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌 - Google Patents

用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌 Download PDF

Info

Publication number
CN103993010A
CN103993010A CN201310054139.XA CN201310054139A CN103993010A CN 103993010 A CN103993010 A CN 103993010A CN 201310054139 A CN201310054139 A CN 201310054139A CN 103993010 A CN103993010 A CN 103993010A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
dna
dna molecular
recombinant
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201310054139.XA
Other languages
English (en)
Inventor
蔡真
张君丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology of CAS filed Critical Institute of Microbiology of CAS
Priority to CN201310054139.XA priority Critical patent/CN103993010A/zh
Publication of CN103993010A publication Critical patent/CN103993010A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。本发明提供的DNA分子,包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因,由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达。本发明提供了一个能稳定、大量地表达D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的DNA分子、以及基于该DNA分子的重组载体和重组菌。同时本发明还提供了应用所述重组菌或该重组菌的发酵物将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的方法,只生成D-对羟基苯甘氨酸,无需拆分分离对映体,转化率高,整个生产过程具有条件温和、操作简单、对环境友好的优点。

Description

用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌
技术领域
本发明涉及用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。
背景技术
D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的医药中间体,用于生产β-内酰胺类半合成抗生素。β-内酰胺类半合成抗生素包括羟氨苄青霉素(阿莫西林)、头孢羟氨苄(欧意)等。与传统的青霉素G类抗生素相比,β-内酰胺类半合成抗生素具有抗菌谱广、毒性低、口服效果好等优点,临床应用广泛,市场非常巨大。据统计,2009年全球抗生素药物市场销售额为280亿美元,其中β-内酰胺类半合成抗生素约占65%,为182亿美元。从2000到2009年,仅阿莫西林和头孢羟氨苄产量就分别增长了614%和762%。这些药物的大规模生产使得D-对羟基苯甘氨酸的需求大幅增加。据悉,目前全球D-对羟基苯甘氨酸的需求量近3万吨,国内也接近2万吨。数据显示,每年全球D-对羟基苯甘氨酸的供应缺口约为6000吨,国内约3000吨,且供需矛盾随着需求量的逐年增加而越发严重。因此,开发高效的D-对羟基苯甘氨酸的生产方法非常重要。
目前,D-对羟基苯甘氨酸的生产方法主要有化学法和生物法。
化学法通过先合成DL-对羟基苯甘氨酸,然后再拆分得到D-对羟基苯甘氨酸。合成DL-对羟基苯甘氨酸主要有苯甲醛法和乙醛酸法。苯甲醛法通过使用对羟基苯甲醛与氰化钠作用生成对羟基-α-羟基苯乙腈,然后酸水解生成DL-对羟基苯甘氨酸,该法原料价格较高,且使用剧毒的氰化物,生产中存在HCN气体及含CN-废水的处理问题。乙醛酸法通过使用乙醛酸、苯酚等生成DL-对羟基苯甘氨酸,反应过程中需要大量酸碱,且需要高压。将DL-对羟基苯甘氨酸拆分成D-对羟基苯甘氨酸的常用方法有化学拆分法和诱导结晶法。化学拆分法是先将DL-对羟基苯甘氨酸在甲醇中以硫酸为催化剂制成甲醛,加入拆分剂制成DL-对羟基苯甘氨酸甲酯,再将其与拆分试剂作用生成盐,利用盐的溶解度不同分离。该法反应周期长,单程转化率低。诱导结晶法是将DL-对羟基苯海因与拆分剂在含有水醇溶液中加热制成饱和溶液,然后通过降温分离,操作繁琐,且产物不纯。综上所述,化学法在生产D-对羟基苯甘氨酸方面存在步骤繁琐、副反应多、收率较低的问题,给后续产物纯化带来困难。另外,化学法生产普遍需要高温高压,且经常使用大量酸碱,对环境污染较为严重。
生物法是以DL-对羟基苯海因作为底物,利用微生物中特定的酶或者利用其完整细胞将其转化为D-对羟基苯甘氨酸。单酶法主要是通过表达海因酶将DL-对羟基苯海因转变成N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸,然后再经过化学法水解获得D-对羟基苯甘氨酸。由于D-海因酶可以特异性地生产D-对羟基苯甘氨酸,因此该法专一性强,收率较高,但缺点是反应过程仍然需要添加大量酸,对后续处理带来问题。
发明内容
本发明的目的是提供用于生产D-对羟基苯甘氨酸的DNA分子、重组质粒以及重组菌。
本发明提供的DNA分子,包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因,由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达;
所述D-海因酶是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将DL-对羟基苯海因转化为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的功能的由序列1衍生的蛋白质;
所述述N-氨甲酰水解酶是如下(c)或(d):
(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸的功能的由序列3衍生的蛋白质。
所述PL启动子为如下1)或2)或3)的DNA分子:
1)序列表中序列5所示的DNA分子;
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子;
3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
所述D-海因酶基因为如下4)或5)或6)的DNA分子:
4)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子;
5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述D-海因酶的DNA分子;
6)与4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述D-海因酶的DNA分子;
所述N-氨甲酰水解酶基因为如下7)或8)或9)的DNA分子:
7)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子;
8)在严格条件下与7)限定的DNA序列杂交且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子;
9)与7)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC,0.5%SDS的溶液中,在65℃下杂交,然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
所述DNA分子可依次包括如下元件:所述PL启动子、所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因。具体来说,所述DNA分子依次由如下元件组成:所述PL启动子、限制性内切酶Sal I的酶切识别序列、所述D-海因酶基因、限制性内切酶Xba I的酶切识别序列和所述N-氨甲酰水解酶基因。
含有所述DNA分子的重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为在载体pUC18的多克隆位点(如Hind III和Kpn I酶切位点之间)插入所述DNA分子得到的重组质粒。
所述重组菌可为所述重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌DH5α。
以上任一所述DNA分子,以上任一所述重组载体,或以上任一所述重组菌,均可用于生产D-对羟基苯甘氨酸。所述应用中,用于生产D-对羟基苯甘氨酸的底物为DL-对羟基苯海因。
本发明还保护所述重组菌的发酵物。所述发酵物的制备方法可包括如下步骤:将所述重组菌进行发酵,然后收集菌体并进行超声破碎,离心收集上清液。所述发酵的条件具体可为:将所述重组菌接种至含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm、振荡培养12小时。所述超声破碎的条件具体可为:超声功率为200w,处理时间为4min,每超声3s停3s。所述离心的条件具体可为:10000rpm离心1min。
本发明还保护一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法,包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物,加入所述发酵物,反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。
本发明还保护另一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法,包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物,加入所述重组菌,反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。
本发明提供了一个能稳定、大量地表达D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的DNA分子、以及基于该DNA分子的重组载体和重组菌。该重组菌或该重组菌的发酵物可以高效转化DL-对羟基苯海因生产D-对羟基苯甘氨酸,无需添加任何诱导剂。同时本发明还提供了应用所述重组菌或该重组菌的发酵物将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的方法,只生成D-对羟基苯甘氨酸,无需拆分分离对映体,转化率高,整个生产过程具有条件温和、操作简单、对环境友好的优点。
附图说明
图1为不同重组菌生产D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的能力-电泳图;1对应重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car,2对应重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car,3对应重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car。
图2为重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car得到的上清液的HPLC图谱。
图3为三种重组菌的D-海因酶酶活和N-氨甲酰水解酶酶活的比较。
图4为实施例4的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
来源为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的D-海因酶如序列表的序列1所示,其编码基因如序列表的序列2所示。来源为假单胞菌(Pseudomonas sp.)的N-氨甲酰水解酶如序列表的序列3所示,其编码基因如序列表的序列4所示。PL启动子(又称pPL)如序列表的序列5所示。PAND启动子(又称pPAND)如序列表的序列6所示。T7A1启动子(又称pT7A1)如序列表的序列7所示。
载体pUC18:宝生物工程(大连)有限公司。大肠杆菌DH5α:天根生化科技(北京)有限公司。DL-对羟基苯海因(DL-对羟基苯海因标准品):梯希爱(上海)化成工业发展有限公司,产品编号H0806。D-对羟基苯甘氨酸标准品:梯希爱(上海)化成工业发展有限公司,产品编号H0758。N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸标准品:用D-海因酶水解DL-对羟基苯海因获得(参考文献:Dong-Cheol Lee,Hak-Sung Kim.Optimization ofa heterogeneous reaction system for the production of optically active D-aminoacids using thermostable D-hydantoinase.BiotechnologyBioengineering.1998,60(6),729-738.)。
实施例1、重组质粒的构建
一、重组质粒pUC-hyd-car的构建
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板,用hyd-for和hyd-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
hyd-for:5’-TGCTTGTCGACATGAGCACTGTCATCAAGGG-3’;
hyd-rev:5’-ACGAACTCTAGATCAGACGCCGCTTGCGGGAAT-3’。
3、用限制性内切酶Sal I和Xba I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Sal I和Xba I双酶切载体pUC18,回收载体骨架(约2680bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-hyd。
6、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。。
7、以步骤6合成的双链DNA分子为模板,用car-for和car-rev组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
car-for:5’-TGCTTTCTAGAATGACACGCATCGTCAATGCAGCCG-3’;
car-rev:5’-TGCTTGGTACCTCACTGCGGCGGCGGCACA-3’。
8、用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切步骤7的PCR扩增产物,回收酶切产物。
9、用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切重组质粒pUC-hyd,回收载体骨架(约4135bp)。
10、将步骤8的酶切产物和步骤9的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-hyd-car。
根据测序结果,对重组质粒pUC-hyd-car进行结构描述如下:以载体pUC18为骨架载体,在Sal I和Xba I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的D-海因酶基因,在Xba I和Kpn I酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的N-氨甲酰水解酶基因。
二、重组质粒pUC-pPL-hyd-car的构建
1、合成序列表的序列5所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板,用pPL-FOR和pPL-REV组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
pPL-FOR:5’-TGCTTAAGCTTCATACAGATAACCATCTGCG-3’;
pPL-REV:5’-TGCTTGTCGACGTGGTCAGTGCGTCCTGCTG-3’。
3、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切重组质粒pUC-hyd-car,回收载体骨架(约5056bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-pPL-hyd-car。
根据测序结果,对重组质粒pUC-pPL-hyd-car进行结构描述如下:在重组质粒pUC-hyd-car的Hind III和Sal I酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的PL启动子。
三、重组质粒pUC-pPAND-hyd-car的构建
1、合成序列表的序列6所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板,用pPAND-FOR和pPAND-REV组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
pPAND-FOR:5’-TGCTTAAGCTTAATATTCCTTTCCTTGTC-3’;
pPAND-REV:5’-TGCTTGTCGACCTGTGGTGTCCTTATGGGGG-3’。
3、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切重组质粒pUC-hyd-car,回收载体骨架(约5056bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-pPAND-hyd-car。
根据测序结果,对重组质粒pUC-pPAND-hyd-car进行结构描述如下:在重组质粒pUC-hyd-car的Hind III和Sal I酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的PAND启动子。
四、重组质粒pUC-pT7A1-hyd-car的构建
1、合成序列表的序列7所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板,用pT7A1-FOR和pT7A1-REV组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
pT7A1-FOR:5’-GCTTAAGCTTTCTTTATTAATACAACTCAC-3’;
pT7A1-REV:5’-TGCTTGTCGACCTATTCGCCGTGTCCCTCTC-3’。
3、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Sal I双酶切重组质粒pUC-hyd-car,回收载体骨架(约5056bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒pUC-pT7A1-hyd-car。
根据测序结果,对重组质粒pUC-pT7A1-hyd-car进行结构描述如下:在重组质粒pUC-hyd-car的Hind III和Sal I酶切位点之间插入了序列表的序列7所示的T7A1启动子。
实施例2、重组菌的制备
将重组质粒pUC-pPL-hyd-car导入大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car。
将重组质粒pUC-pPAND-hyd-car导入大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car。
将重组质粒pUC-pT7A1-hyd-car导入大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car。
实施例3、不同重组菌表达目的蛋白水平的比较
分别将实施例2制备的各个重组菌进行如下操作:
1、挑取重组菌单菌落接种于15ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm振荡培养,得到OD600nm=2.8的菌液。
2、取10ml步骤1得到的菌液,转接至100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,得到OD600nm=3.0的初始发酵体系,37℃、200rpm、振荡培养12小时,得到终止发酵体系。
3、取2mL终止发酵体系,10000rpm离心1min,收集菌体沉淀,超声破碎(超声功率为200w,处理时间为4min,每超声3s停3s),然后10000rpm离心1min,收集上清液。
4、取步骤3得到的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,见图1。
D-海因酶的预期分子量为53KD,N-氨甲酰水解酶的预期分子量为35KD。三种重组菌均显示有对应D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的预期分子量的条带,且重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car发酵产生的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶最多,显著高于重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car和重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car。
5、取800μL步骤3得到的上清液,加入0.02g DL-对羟基苯海因,37℃静置反应30min,然后12000rpm离心1min,取上清液,用双蒸水稀释至50倍体积后进行HPLC检测。
HPLC检测采用Agilent色谱柱(Eclipse XDB-C18,5μm,4.6×150mm),流动相为0.041g/L的乙酸钠水溶液(pH2.7),流速1ml/min,紫外检测波长为270nm。重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car步骤3得到的上清液的HPLC图谱见图2,DL-对羟基苯海因、N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸、D-对羟基苯甘氨酸的出峰位置分别为5.600min、3.863min、1.655min,均与DL-对羟基苯海因标准品、N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸标准品和D-对羟基苯甘氨酸标准品的出峰位置相同。重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car步骤3得到的上清液和重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car步骤3得到的上清液的HPLC图谱与重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car得到的上清液的HPLC图谱一致。
用DL-对羟基苯海因标准品制作的标准曲线方程为:y=554x,y代表峰面积,x代表DL-对羟基苯海因浓度(单位mM)。
用N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸标准品制作的标准曲线方程为:y=520.68x,y代表峰面积,x代表N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸浓度(单位mM)。
用D-对羟基苯甘氨酸标准品制作的标准曲线方程为:y=577.96x,y代表峰面积,x代表D-对羟基苯甘氨酸浓度(单位mM)。
每分钟生成1μmol产物所需要的酶量定义为一个酶活单位。计算D-海因酶酶活时,底物为DL-对羟基苯海因,产物为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸。计算N-氨甲酰水解酶酶活时,底物为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸,产物为D-对羟基苯甘氨酸。
重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活为0.6±0.02U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活为0.8±0.02U/ml。重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活为0.5±0.04U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活为0.67±0.07U/ml。重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活为0.31±0.05U/ml,N-氨甲酰水解酶酶活为0.54±0.04U/ml。
三种重组菌的D-海因酶酶活和N-氨甲酰水解酶酶活的比较见图3。结果表明,重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car发酵产生的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶最多,因此其步骤3得到的上清液的D-海因酶酶活和和N-氨甲酰水解酶的酶活也最高。
实施例4、采用重组菌全细胞生产D-对羟基苯甘氨酸
分别将实施例2制备的各个重组菌进行如下操作:
1、挑取重组菌单菌落接种于30ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm振荡培养,得到OD600nm=2.6的菌液。
2、取30ml步骤1得到的菌液,转接至300ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,得到OD600nm=2.8的初始发酵体系,37℃、200rpm振荡培养12小时,得到终止发酵体系。
重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car得到的终止发酵体系的OD600nm=2.8。重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car得到的终止发酵体系的OD600nm=2.9。重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car得到的终止发酵体系的OD600nm=2.78。
3、取整个终止发酵体系,10000rpm离心3min,收集菌体沉淀,加入300ml30g/L的DL-对羟基苯海因水溶液,37℃、350rpm振荡反应10小时,从加入DL-对羟基苯海因水溶液的时刻开始计时(初始时刻为0时刻),每隔两小时取样,采用HPLC检测D-对羟基苯甘氨酸的浓度(HPLC检测方法见实施例3,将对应D-对羟基苯甘氨酸的峰面积代入实施例3中的用D-对羟基苯甘氨酸标准品制作的标准曲线方程)。
结果见图4。采用重组菌DH5α/pUC-pPL-hyd-car全细胞对DL-对羟基苯海因作用10小时后,体系中的D-对羟基苯甘氨酸浓度为14.73g/L,生产速率为1.4g/L/h。采用重组菌DH5α/pUC-pT7A1-hyd-car全细胞对DL-对羟基苯海因作用10小时后,体系中的D-对羟基苯甘氨酸浓度为12.29g/L。采用重组菌DH5α/pUC-pPAND-hyd-car全细胞对DL-对羟基苯海因作用10小时后,体系中的D-对羟基苯甘氨酸浓度为7.59g/L。

Claims (10)

1.一种DNA分子,包括PL启动子、D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因,由所述PL启动子启动所述D-海因酶基因和所述N-氨甲酰水解酶基因的表达;
所述D-海因酶是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将DL-对羟基苯海因转化为N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸的功能的由序列1衍生的蛋白质;
所述述N-氨甲酰水解酶是如下(c)或(d):
(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有将N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸转化为D-对羟基苯甘氨酸的功能的由序列3衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的DNA分子,其特征在于:所述PL启动子为如下1)或2)或3)的DNA分子:
1)序列表中序列5所示的DNA分子;
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子;
3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的DNA分子,其特征在于:
所述D-海因酶基因为如下4)或5)或6)的DNA分子:
4)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子;
5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述D-海因酶的DNA分子;
6)与4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述D-海因酶的DNA分子;
所述N-氨甲酰水解酶基因为如下7)或8)或9)的DNA分子:
7)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子;
8)在严格条件下与7)限定的DNA序列杂交且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子;
9)与7)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述N-氨甲酰水解酶的DNA分子。
4.含有权利要求1至3中任一所述DNA分子的重组载体或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体,其特征在于:所述重组载体为在载体pUC18的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌,其特征在于:所述重组菌是将权利要求5所述重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌。
7.权利要求1至3中任一所述的DNA分子,或权利要求4所述的重组载体,或权利要求5所述的重组载体,或权利要求4所述的重组菌,或权利要求6所述的重组菌,在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用。
8.权利要求4或6所述重组菌的发酵物。
9.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法,包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物,加入权利要求8所述发酵物,反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。
10.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法,包括如下步骤:以DL-对羟基苯海因为底物,加入权利要求4或6所述重组菌,反应后得到D-对羟基苯甘氨酸。
CN201310054139.XA 2013-02-20 2013-02-20 用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌 Pending CN103993010A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310054139.XA CN103993010A (zh) 2013-02-20 2013-02-20 用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310054139.XA CN103993010A (zh) 2013-02-20 2013-02-20 用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103993010A true CN103993010A (zh) 2014-08-20

Family

ID=51307343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310054139.XA Pending CN103993010A (zh) 2013-02-20 2013-02-20 用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103993010A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103981228A (zh) * 2014-03-31 2014-08-13 浙江工业大学 一种脂肪酶催化苯海因制备n-氨甲酰基苯甘氨酸的方法
CN111621452A (zh) * 2019-02-28 2020-09-04 中国科学院微生物研究所 一株生产d-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101260381A (zh) * 2008-04-15 2008-09-10 山西大学 一种工程菌及其构建和用其制备d-缬氨酸的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101260381A (zh) * 2008-04-15 2008-09-10 山西大学 一种工程菌及其构建和用其制备d-缬氨酸的方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA ISABEL MARTI´NEZ-GO´MEZ ET AL.: "Recombinant Polycistronic Structure of Hydantoinase Process Genes in Escherichia coli for the Production of Optically Pure D-Amino Acids", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
ANA ISABEL MARTı´NEZ-GO´MEZ ET AL.: "Recombinant Polycistronic Structure of Hydantoinase Process Genes in Escherichia coli for the Production of Optically Pure D-Amino Acids", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》, vol. 73, no. 5, 12 January 2007 (2007-01-12), pages 1525 - 1531 *
GENBANK: "Genbank Accession:AB248920.1", 《WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/GENBANK》 *
WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/GENBANK: "Genbank Accession:AGA07475.1", 《WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/GENBANK》 *
WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/GENBANK: "Genbank Accession:BAD00008.1", 《WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/GENBANK》 *
YANGQIU LIU ET AL.: "Construction and co-expression of polycistronic plasmid encoding d-hydantoinase and d-carbamoylase for the production of d-amino acids", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *
YANGQIU LIU ET AL.: "Construction and co-expression of polycistronic plasmid encoding d-hydantoinase and d-carbamoylase for the production of d-amino acids", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》, vol. 101, no. 17, 10 April 2010 (2010-04-10), pages 6761 - 6767, XP022635372, DOI: doi:10.1016/j.enzmictec.2008.02.013 *
胡晓佳 等: "重组大肠杆菌共表达D-海因酶和N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶", 《过程工程学报》 *
胡晓佳 等: "重组大肠杆菌共表达D-海因酶和N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶", 《过程工程学报》, vol. 6, no. 6, 30 December 2006 (2006-12-30), pages 948 - 953 *
袁静明 等: "D-海因酶基因重组子的构建和酶的表达活性", 《山西大学学报(自然科学版)》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103981228A (zh) * 2014-03-31 2014-08-13 浙江工业大学 一种脂肪酶催化苯海因制备n-氨甲酰基苯甘氨酸的方法
CN111621452A (zh) * 2019-02-28 2020-09-04 中国科学院微生物研究所 一株生产d-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104388373A (zh) 一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌系统的构建
Liu et al. Fed-batch production of Thermothelomyces thermophilus lignin peroxidase using a recombinant Aspergillus nidulans strain in stirred-tank bioreactor
CN106520715B (zh) 一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌及其在虾青素手性中间体合成中的应用
CN103421823B (zh) 源于雷弗松氏菌的短链脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及应用
CN104560905B (zh) 一种源自假单胞菌的硫醚单加氧酶及其合成应用
CN101921742A (zh) 一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用
CN102994470A (zh) 一种环氧化物水解酶基因(eh-b)原核表达及手性环氧氯丙烷的制备
CN114134134B (zh) L-苏氨酸醛缩酶突变体及其在合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸中的应用
CN101429519A (zh) 重组人胰岛素样生长因子-1(igf-1)融合蛋白的制备方法
CN103993010A (zh) 用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌
CN104962540A (zh) 一种腈水解酶、编码基因、载体及应用
CN106244569A (zh) 一种酯酶EstC10及其编码基因和应用
CN102286563A (zh) 一种采用固定化酶制备l-鸟氨酸的方法
CN105969785A (zh) 一种4-羟基异亮氨酸的合成方法
CN101407780B (zh) 利用定点突变改变辅酶特异性和立体选择性制备(r)-苯基乙二醇的方法
CN107012178A (zh) 一种酶法合成l‑2‑氨基丁酸的方法
CN103131659B (zh) 一种耐有机溶剂脂肪酶、其编码基因、产生菌株及应用
CN105602913B (zh) 重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut、编码基因、工程菌及应用
CN102796719B (zh) 一种(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用
CN105296513A (zh) 一种海洋酯酶及其编码基因e22与应用
CN105238769B (zh) 一种脂肪酶lipase7及其编码基因和应用
CN113481233B (zh) 构建依克多因生产菌的方法
CN105132394B (zh) 一种脂肪酶lipase6及其编码基因和应用
CN104560912B (zh) 酯酶及其编码基因和应用
CN105950595A (zh) (-)-γ-内酰胺酶、基因、突变体、载体及其制备与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140820

RJ01 Rejection of invention patent application after publication