CN110396507B

CN110396507B - 源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶

Info

Publication number: CN110396507B
Application number: CN201910366923.1A
Authority: CN
Inventors: 应向贤; 汪钊; 赵嫚; 程先锋; 林行; 殷杭华; 陈梁; 毛王伟; 张连春; 白彦兵; 余建新; 娄波; 金文究; 汪军; 刘一骏
Original assignee: Hangzhou Xinfu Technology Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Hangzhou Xinfu Technology Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-05-05
Filing date: 2019-05-05
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2039-05-05
Also published as: CN110396507A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说，涉及L‑泛解酸内酯脱氢酶及其应用。本发明首次揭示了来源于Cnuibacter physcomitrellae的L‑泛解酸内酯脱氢酶，其对L‑泛解酸内酯具有良好的酶活性，可以应用于D‑泛解酸内酯的催化合成中。本发明构建了多酶级联催化L‑泛解酸内酯手性翻转合成D‑泛解酸内酯的体系，以共表达L‑泛解酸内酯脱氢酶、D‑酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶的基因工程菌细胞为催化剂，避免了中间产物酮基泛解酸内酯的积累与自发水解，省去了中间产物的分离、L‑泛解酸内酯的消旋以及D‑泛解酸在酸性条件下内酯化等步骤，简化了反应过程，减少了酸碱的使用，提高了反应效率。

Description

源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，更具体地说，涉及源自Cnuibacterphyscomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶、其编码基因、载体、重组细胞及其应用。

背景技术

D-泛酸钙又称维生素B5，是辅酶A的组成部分，已经广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等行业。D-泛解酸内酯是合成D-泛酸钙的重要原料，在工业化生产上先通过化学法合成DL-泛解酸内酯，再利用内酯水解酶选择性水解混旋泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯生成D-泛解酸，接着分离D-泛解酸和L-泛解酸内酯，分离后的D-泛解酸经酸化成环形成D-泛解酸内酯，而L-泛解酸内酯经消旋化后回用。因此，水解酶催化的手性拆分法尽管工艺成熟，但仍然存在步骤较长、酸碱耗用高等问题。鉴于此，开发更为直接、高效、环保的D-泛解酸内酯不对称合成方法替代现有的手性拆分技术将具有重要的应用价值。D-泛解酸内酯可通过氧化还原法不对称合成，该方法包括两种途径，第一种是以混旋的DL-泛解酸内酯为底物，利用立体选择性专一的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯在D-酮基泛解酸内酯还原酶催化下不对称生成D-泛解酸内酯；第二种途径也是先以L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯自发水解形成酮基泛解酸，然后在D-酮基泛解酸还原酶的作用下生成D-泛解酸，接着D-泛解酸在酸的作用下闭环形成D-泛解酸内酯。该过程以第一条通路更为简捷，与现有的水解酶催化通路相比，工艺更为简单，混旋的底物经生物催化直接得到光学纯产物，不需要消旋步骤，也不需要内酯和酸的分离步骤；在基因工程菌内构建辅酶循环系统，可不需要外加辅酶；以基因工程菌作为整细胞催化剂不需要酶的分离纯化步骤。因此，氧化还原酶不对称合成D-泛解酸内酯的方法是一种非常有前景的生物水解酶法替代者。

氧化还原法中L-泛解酸内酯的脱氢是其关键步骤之一，L-泛解酸内酯脱氢酶是催化该反应的关键酶。目前已知的L-泛解酸内酯脱氢酶数量不多，催化性能优异的L-泛解酸内酯脱氢酶的缺乏限制了氧化还原酶法在不对称合成D-泛解酸内酯中的应用。研究较多的L-泛解酸内酯脱氢酶包括源自红串红球菌的L-泛解酸内酯脱氢酶和源自星状诺卡氏菌的L-泛解酸内酯脱氢酶。源自红串红球菌的L-泛解酸内酯脱氢酶不能在大肠杆菌系统中重组表达，这一特性加大了多酶组合催化的难度。以红串红球菌L-泛解酸内酯脱氢酶基因在相同的红串红球菌中增强表达的基因工程菌AKU2103为生物催化剂，催化0.768M的L-泛解酸内酯脱氢反应144h，反应的转化率为91.9％。L-泛解酸内酯脱氢产物为酮基泛解酸内酯，酮基泛解酸内酯容易自发水解为酮基泛解酸。在上述反应144h后，进一步添加表达了D-酮基泛解酸还原酶的重组大肠杆菌为生物催化剂，所产生的酮基泛解酸在还原反应24h后可以全部转化为D-泛解酸。最终，D-泛解酸再经酸化处理生成D-泛解酸内酯(Si D,Urano N,Nozaki S,et al.L-Pantoyl lactone dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis:genetic analyses and application to the stereospecific oxidation of L-pantoyllactone.Applied Microbiology and Biotechnology,2012,95:431-440)。此外，源自星状诺卡氏菌的L-泛解酸内酯脱氢酶虽然有较详细地酶学性质研究(Kataoka M,Shimizu S,Yamada H.Purification and characterization of a novel FMN-dependent enzyme:membrane-bound L-(+)-pantoyl lactone dehydrogenase from Nocardiaasteroides.European Journal of Biochemistry,1992,204,799-806)，而其编码基因仍不为人知，阻碍了其在生物催化中的进一步应用。

目前尚未见源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶的报道，也未见源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶用于多酶级联催化L-泛解酸内酯手性翻转合成D-泛解酸内酯的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶及其应用。

本发明第一方面，提供一种L-泛解酸内酯脱氢酶，其特征在于，所述L-泛解酸内酯脱氢酶来源于Cnuibacter physcomitrellae，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

本发明另一方面，提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸是编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸。

在一个优选例中，所述多核苷酸的多核苷酸序列选自下组：(3a)SEQ ID No:1所示的核苷酸序列；(3b)与(3a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明另一方面，提供一种载体，所述载体含有编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸。

本发明另一方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞含有所述载体或基因组中整合有编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸。

本发明另一方面，提供所述L-泛解酸内酯脱氢酶在催化L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯中的应用。

本发明另一方面，提供一种多酶重组细胞，所述多酶重组细胞诱导产生所述L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶。

在一个优选例中，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶来源于酿酒酵母，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。

进一步地，编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸序列选自下组：(9a)SEQID No:3所示的核苷酸序列；(9b)与(9a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述多酶重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶。

进一步地，所述葡萄糖脱氢酶来源于微小杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

进一步地，编码所述葡萄糖脱氢酶的多核苷酸序列选自下组：(12a)SEQ ID No:5所示的核苷酸序列；(12b)与(12a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明另一方面，还提供多酶重组细胞的构建方法，包括：

步骤一，将编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸插入第一载体，得到第一重组载体；将编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸插入第二载体，得到第二重组载体；以及

步骤二，将所述第一重组载体和第二重组载体导入宿主细胞，得到多酶重组细胞。

在一个优选例中，所述步骤一中，将编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶和编码所述葡萄糖脱氢酶的多核苷酸分别插入第二载体，得到第二重组载体。

在另一优选例中，所述第一载体为pET-28b，所述第二载体为pACYCDuet-1，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。

本发明另一方面，还提供一种制备D-泛解酸内酯的方法，利用所述多酶重组细胞诱导产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶催化L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯。

在一个优选例中，所述多酶重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶，以葡萄糖作为辅底物，利用所述葡萄糖脱氢酶连续催化反应体系中的NADP⁺转化为NADPH。

在另一优选例中，所述方法还包括：从反应后的反应体系中分离出D-泛解酸内酯。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶、编码基因、载体及重组细胞，该L-泛解酸内酯脱氢酶对L-泛解酸内酯具有优良的酶活性。该源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶应用于多酶级联催化合成D-泛解酸内酯，使L-泛解酸内酯直接手性翻转生成D-泛解酸内酯，避免了中间产物酮基泛解酸内酯的积累与自发水解。本发明提供的D-泛解酸内酯制备方法与选择性拆分工艺相比，避免了中间产物的分离、L-泛解酸内酯的消旋以及D-泛解酸在酸性条件下内酯化等步骤，简化了反应过程，减少了酸碱的使用，提高了反应效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图；

图1为本发明L-泛解酸内酯直接手性翻转生成D-泛解酸内酯的原理图；

图2为本发明实施例1中L-泛解酸内酯脱氢酶的SDS-PAGE检测图，其中：泳道Control对应未诱导的重组细胞；泳道5对应诱导培养后的重组细胞；

图3为本发明实施例6中L-泛解酸内酯脱氢酶、酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶的SDS-PAGE检测图，其中：泳道Control对应未诱导的多酶重组细胞；泳道5对应诱导培养后的多酶重组细胞；

图4为本发明实施例7中D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的气相色谱图；

图5为本发明实施例9中分离的产物D-泛解酸内酯的GC-MS分析谱图；

图6为本发明实施例9中分离的产物D-泛解酸内酯的¹H NMR谱图；

图7为本发明实施例9中分离的产物D-泛解酸内酯的¹³C NMR谱图；

附图标记：

CphLPLDH：源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶；SceCPR1：酿酒酵母D-酮基泛解酸内酯还原酶；EsGDH：微小杆菌葡萄糖脱氢酶；泳道Marker，ProteinMarker。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1～7，图1为本发明L-泛解酸内酯直接手性翻转生成D-泛解酸内酯的原理图；图2为本发明实施例1中L-泛解酸内酯脱氢酶的SDS-PAGE检测图；图3为本发明实施例6中L-泛解酸内酯脱氢酶、酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶的SDS-PAGE检测图；图4为本发明实施例7中D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的气相色谱图；图5为本发明实施例9中分离的产物D-泛解酸内酯的GC-MS分析谱图；图5为本发明实施例9中分离的产物D-泛解酸内酯的¹H NMR谱图；图6为本发明实施例9中分离的产物D-泛解酸内酯的¹³CNMR谱图。

本发明提供了一种来源于Cnuibacter physcomitrellae的氧化酶，该氧化酶对L-泛解酸内酯上的羟基氢具有优良的脱氢酶学活性(即L-泛解酸内酯脱氢酶)，可以应用于D-泛解酸内酯的合成。

本发明还提供了编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸和表达L-泛解酸内酯脱氢酶的多酶重组细胞。

本发明还提供了一种L-泛解酸内酯脱氢酶在催化生成D-泛解酸内酯中的应用。

本发明还构建了多酶级联催化反应系统，实现了L-泛解酸内酯直接手性翻转生成D-泛解酸内酯，简化了反应过程，提高了催化反应的效率，降低了生产成本。

L-泛解酸内酯脱氢酶、其编码多核苷酸、载体、重组细胞

本发明揭示了一种新的、对L-泛解酸内酯上的羟基氢具有脱氢酶活性的、可以应用于生产D-泛解酸内酯的L-泛解酸内酯脱氢酶。所述L-泛解酸内酯脱氢酶来源于Cnuibacter physcomitrellae，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

本发明的酶可以是天然、重组或合成的活性多肽。所述活性多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或是使用重组技术从原核(例如，大肠杆菌)或真核宿主(例如，酵母)中产生的产物。

本发明揭示了编码L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸，优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。所述DNA可以是单链或者双链。单链DNA可以是编码链或非编码链。

本发明中的编码L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。

本发明还包括所述编码L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸的变异体，其编码与SEQID No:2相同氨基酸序列的多肽。所述多核苷酸的变异体可以是天然发生的变异体或非天然发生的变异体。所述多核苷酸的变异体可以是由一个或多个碱基发生取代、缺失和/或插入所产生的变异体。所述多核苷酸的变异体编码的多肽不会丧失对酮基泛解酸内酯的酶学活性。

本发明还包括了所述多核苷酸的载体，如克隆载体和表达载体，通过克隆载体实现相关序列的复制，通过表达载体实现基因功能的表达。

本发明还包括将所述载体导入宿主细胞后产生的重组细胞或基因组中整合有所述多核苷酸的重组细胞，所述重组细胞用于表达L-泛解酸内酯脱氢酶。所述宿主细胞可以是原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等。

优选地，所述编码L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸序列与载体pET-28b连接，再转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，经过诱导培养，高效地表达L-泛解酸内酯脱氢酶。

L-泛解酸内酯脱氢酶在催化生成D-泛解酸内酯中的应用

本发明中的L-泛解酸内酯脱氢酶对L-泛解酸内酯具有酶活性，可以用于生产D-泛解酸内酯。反应中的催化剂可以是经过分离纯化的L-泛解酸内酯脱氢酶，也可以是经过诱导培养的重组细胞。所述重组细胞可以是培养后分离的湿菌体，也可以是细胞冻干粉。不论是上述的哪种形式，其实质都是利用重组细胞产生的L-泛解酸内酯脱氢酶对L-泛解酸内酯进行催化。

多酶重组细胞、涉及的多核苷酸、多酶重组细胞构建方法

本发明还提供了一种多酶重组细胞，其能够同时表达所述L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶。所述多酶重组细胞可以应用于L-泛解酸内酯直接手性翻转生成D-泛解酸内酯的生物催化反应中。

本发明还揭示了所述多酶重组细胞产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶的氨基酸序列和其编码核苷酸序列。

本发明中的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。所述DNA可以是单链或者双链。单链DNA可以是编码链或非编码链。本发明中的编码酶的多核苷酸通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。

优选地，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶为来源于酿酒酵母的D-酮基泛解酸内酯还原酶(SceCPR1)，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；还包括对SEQ ID No:4所示的氨基酸序列在保持活性的范围内，进行一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加所得到的多肽。

本发明还包括编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；还包括所述多核苷酸的变异体，其编码与SEQ ID No:4相同氨基酸序列的多肽。所述多核苷酸的变异体可以是天然发生的变异体或非天然发生的变异体。所述多核苷酸的变异体可以是由一个或多个碱基发生取代、缺失和/或插入所产生的变异体。

多酶重组细胞催化L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯的体系中，需要NADPH作为氢供体。但是，如果在工业生产中直接在反应体系中添加NADPH，会使成本变得非常高昂。因此，为了使多酶重组细胞更加适用于工业生产，经过进一步改造，其还可以诱导产生葡萄糖脱氢酶。反应时，在体系中加入葡萄糖作为辅底物，诱导产生的葡萄糖脱氢酶即可不断将NADP⁺转化为NADPH，同时葡萄糖转变为葡萄糖酸。

优选地，所述葡萄糖脱氢酶为来源于微小杆菌的葡萄糖脱氢酶(EsGDH)，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；还包括所述葡萄糖脱氢酶的衍生物，可以是对SEQ ID No:6所示的氨基酸序列在保持活性的范围内，进行一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加所得到的多肽。

本发明还包括编码所述葡萄糖脱氢酶的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；还包括所述多核苷酸的变异体，其编码与SEQ ID No:6相同氨基酸序列的多肽。所述多核苷酸的变异体可以是天然发生的变异体或非天然发生的变异体。所述多核苷酸的变异体可以是由一个或多个碱基发生取代、缺失和/或插入所产生的变异体。

本发明还揭示了所述多酶重组细胞的构建方法，包括：

S11，将编码L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸插入第一载体，从而获得第一重组载体；将编码D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸分别插入第二载体，从而获得第二重组载体。

S12，将所述第一重组载体和第二重组载体导入宿主细胞，得到多酶重组细胞。所述宿主细胞可以是原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等。

进一步地，为了降低生产成本，使得重组细胞更加适合工业化生产，还可以将编码葡萄糖脱氢酶的基因导入多酶重组细胞。即将编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸和编码所述葡萄糖脱氢酶的多核苷酸分别插入第二载体，得到第二重组载体。然后，将所述第一重组载体和第二重组载体导入宿主细胞，得到多酶重组细胞。所述多酶重组细胞经过诱导培养可以同时产生L-泛解酸内酯脱氢酶、D-酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶。

优选地，所述第一载体为pET-28b，所述第二载体为pACYCDuet-1，，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。

多酶级联催化生成D-泛解酸内酯的方法

本发明还包括一种制备D-泛解酸内酯的方法，利用所述多酶重组细胞诱导产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶催化L-泛解酸内酯直接手性翻转生成D-泛解酸内酯。

上述反应体系中，由于没有辅酶再生系统，因此反应中需要添加价格昂贵的NADPH，这可能是不利于大规模工业化生产的。为了降低大规模工业化生产的成本，所述多酶重组细胞可以同时诱导产生L-泛解酸内酯脱氢酶、D-酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，使得反应体系中建立辅酶再生系统。反应原理如图1所示，底物为L-泛解酸内酯，辅底物为葡萄糖，NADPH为氢供体，而葡萄糖脱氢酶不断将NADP⁺转化为NADPH，同时葡萄糖转变为葡萄糖酸。该方法使L-泛解酸内酯直接手性翻转生成D-泛解酸内酯，避免了中间产物酮基泛解酸内酯的积累与自发水解，避免了中间产物的分离、L-泛解酸内酯的消旋以及D-泛解酸在酸性条件下内酯化等步骤，简化了反应过程，减少了酸碱的使用，提高了反应效率。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的L-泛解酸内酯脱氢酶及其应用进行详细描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子生物领域常规实验方法进行，如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的实验方法，或者按照制造厂商所建议的实验方法。

实施例1L-泛解酸内酯脱氢酶基因工程菌构建及表达

利用已公开的来源于Cnuibacter physcomitrellae的氧化还原酶编码基因(GenBank登录号为ARJ05030.1)，经过密码子优化后，人工合成(苏州金唯智生物技术有限公司提供基因合成服务)L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

将源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶(CphLPLDH)编码基因插入到质粒pET-28b上的HindIII和Xho I位点得到重组质粒pET-28b-CphLPLDH。将pET-28b-CphLPLDH转入E.coli BL21(DE3)获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-CphLPLDH。

将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-CphLPLDH接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜。取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG，在22℃诱导培养16h，然后离心收集湿菌体，并用pH 7.0的磷酸缓冲液重悬湿菌体洗涤2次。如图2所示，诱导的基因工程菌经SDS-PAGE检测表明，源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶在大肠杆菌中成功表达。

实施例2L-泛解酸内酯脱氢酶的底物特异性考察

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-CphLPLDH经诱导表达后所获得的湿菌体，用作为生物催化剂。分别以100mM的D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯、DL-泛解酸内酯、D-泛解酸和L-泛解酸为底物，利用全细胞催化考察源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶的底物特异性。L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢的反应体系为5mL，分别含有：1g湿菌体，100mM底物和200mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。反应液加入三口烧瓶中，在磁力搅拌下维持反应条件为30℃，600rpm和pH 7.0，催化过程通过滴加1M Na₂CO₃溶液维持pH恒定。反应6h后，取100μL反应液加入等体积4M盐酸，离心取上清100μL，加入1mL乙酸乙酯充分萃取。萃取液离心后吸取上层有机相于离心管中，加入无水硫酸钠除水，再离心取上清转移入气相样品瓶中用于气相色谱检测。底物特异性结果如表1所示，源自Cnuibacterphyscomitrellae的L-泛解酸脱氢酶不能催化D-泛解酸内酯、D-泛解酸和L-泛解酸，能催化L-泛解酸内酯和DL-泛解酸内酯。上述结果表明，源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸脱氢酶专一地作用于L-泛解酸内酯的脱氢反应。

表1源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸脱氢酶的底物特异性

实施例3D-酮基泛解酸内酯还原酶编码基因获取

利用已公开的来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的还原酶编码基因(GenBank登录号为CAA98692.1)，经过密码子优化后，人工合成(苏州金唯智生物技术有限公司提供基因合成服务)D-酮基泛解酸内酯还原酶编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

实施例4葡萄糖脱氢酶编码基因获取

利用已公开的来源于微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)的脱氢酶编码基因(GenBank登录号为ACB59697.1)，经过密码子优化后，人工合成(苏州金唯智生物技术有限公司提供基因合成服务)微小杆菌葡萄糖脱氢酶编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

实施例5多酶重组细胞的构建

(1)双酶重组细胞

将酿酒酵母D-酮基泛解酸内酯还原酶编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)插入到质粒pACYCDuet-1上Nco I/Hind III位点获得重组质粒pACYCDuet-1-SceCPR1。将pACYCDuet-1-SceCPR1转入E.coli BL21(DE3)获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1。

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet 1-SceCPR1在含有50μg/mL氯霉素的LB固体培养基上划线分离，挑取单菌落接种与于50mL LB液体培养基中，并加入终浓度50μg/mL氯霉素，在37℃和200rpm恒温摇床培养10h。取1mL种子液转接至50mL含有50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养至OD₆₀₀至0.3～0.5，冰上冷却半小时，取菌液离心并洗涤菌体，用氯化钙溶液处理制成E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1感受态细胞。将重组质粒pET-28b-CphLPLDH导入E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet1-SceCPR1感受态细胞中，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-CphLPLDH/pACYCDuet 1-SceCPR1。

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1以及E.coli BL21(DE3)/pET-28b-CphLPLDH/pACYCDuet 1-SceCPR1经提取质粒测序表明，酶的编码基因在对应的基因工程菌中均插入无误。

(2)三酶重组细胞

将酿酒酵母D-酮基泛解酸内酯还原酶编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)和微小杆菌葡萄糖脱氢酶编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)分别插入到质粒pACYCDuet-1上Nco I/Hind III位点和NdeI/Xho I位点获得重组质粒pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH。将pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH转入E.coli BL21(DE3)获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH。

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet 1-SceCPR1-EsGDH在含有50μg/mL氯霉素的LB固体培养基上划线分离，挑取单菌落接种与于50mL LB液体培养基中，并加入终浓度50μg/mL氯霉素，在37℃和200rpm恒温摇床培养10h。取1mL种子液转接至50mL含有50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养至OD₆₀₀至0.3～0.5，冰上冷却半小时，取菌液离心并洗涤菌体，用氯化钙溶液处理制成E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH感受态细胞。将重组质粒pET-28b-CphLPLDH导入E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet 1-SceCPR1-EsGDH感受态细胞中，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-CphLPLDH/pACYCDuet 1-SceCPR1-EsGDH。

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH以及E.coli BL21(DE3)/pET-28b-CphLPLDH/pACYCDuet 1-SceCPR1-EsGDH经提取质粒测序表明，酶的编码基因在对应的基因工程菌中均插入无误。

实施例6多酶重组细胞的诱导表达

将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-CphLPLDH/pACYCDuet 1-SceCPR1接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜。取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG，在22℃诱导培养16h，然后离心收集湿菌体，并用pH 7.0的磷酸缓冲液重悬湿菌体洗涤2次。诱导的基因工程菌经检测表明，源自Cnuibacterphyscomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶和酿酒酵母酮基泛解酸内酯还原酶均在大肠杆菌中成功表达。

将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-CphLPLDH/pACYCDuet 1-SceCPR1-EsGDH接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜。取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG，在22℃诱导培养16h，然后离心收集湿菌体，并用pH7.0的磷酸缓冲液重悬湿菌体洗涤2次。如图3所示，诱导的基因工程菌经SDS-PAGE检测表明，源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶、酿酒酵母酮基泛解酸内酯还原酶和微小杆菌葡萄糖脱氢酶均在大肠杆菌中成功表达。

实施例7D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的气相色谱分析方法

D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯以及中间产物酮基泛解酸内酯的气相色谱检测条件：Agilent 7890A，手性柱BGB-174(30m×250μm×0.25μm)；进样器和检测器温度250℃，柱温175℃保持7min；载气N2流量30mL/min；空气流量400mL/min，氢气流量40mL/min，分流比：30:1，进样量：1μL。D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯、和酮基泛解酸内酯的保留时间分别为5.32min、5.53min和5.78min，如图4所示。分别称取上述物质，用乙酸乙酯配置成终浓度为5mM，10mM，30mM，50mM，70mM，100mM，利用该气相检测方法，制备浓度与物质峰面积的标准曲线。

实施例8多酶级联催化L-泛解酸内酯手性翻转直接合成D-泛解酸内酯

双酶体系

E.coli BL21(DE3)/pET28b-CphLPLDH/pACYCDuet1-SceCPR1双酶共表达基因工程菌经诱导表达后，所获得的湿菌体作为生物催化剂。多酶级联催化L-泛解酸内酯手性翻转合成D-泛解酸内酯催化体系(5mL)为：1g湿菌体，250mM L-泛解酸内酯和100mM磷酸盐缓冲液(pH 5.0)。反应液加入三口烧瓶中，维持反应条件为30℃和pH 5.0，催化过程通过滴加1MNa₂CO₃溶液维持pH恒定。

实验结果显示，在不额外添加NADPH的情形下，L-泛解酸内酯无法完全转化。额外添加NADPH后，反应24h后，取100μL反应液进行气相色谱检测。气相色谱检测结果表明，反应24h后，D-泛解酸内酯得率大于99％，产物e.e.值大于98％。

三酶体系

E.coli BL21(DE3)/pET28b-CphLPLDH/pACYCDuet1-SceCPR1-EsGDH三酶共表达基因工程菌经诱导表达后，所获得的湿菌体作为生物催化剂。多酶级联催化L-泛解酸内酯手性翻转合成D-泛解酸内酯催化体系(5mL)为：1g湿菌体，250mM L-泛解酸内酯，500mM辅底物葡萄糖和100mM磷酸盐缓冲液(pH 5.0)。反应液加入三口烧瓶中，维持反应条件为30℃和pH5.0，催化过程通过滴加1M Na₂CO₃溶液维持pH恒定。

反应12h和24h后，各取100μL反应液加入等体积4M盐酸，离心取上清100μL，加入1mL乙酸乙酯充分萃取。萃取液离心后吸取上层有机相于离心管中，加入无水硫酸钠除水，再离心取上清转移入气相样品瓶中用于气相色谱检测。气相色谱检测结果表明，反应12h后，D-泛解酸内酯得率达95.1％，而反应24h后，D-泛解酸内酯得率大于99％，产物e.e.值大于98％。

实施例9反应产物D-泛解酸内酯的分离制备与鉴定

以实施例8中的三酶反应体系，在反应24h后的反应液中，加入2倍于反应液的乙酸乙酯，充分搅拌萃取1小时，静置半小时后分离上层萃取液和下层反应液，再向分离的反应液加入10mL乙酸乙酯以同样的操作萃取一次，合并两次萃取液，萃取液经浓缩、结晶、干燥后到产物，产物的总收率大于90％。所获得产物用于气相-质谱联用(GC-MS)和核磁(NMR)检测。

通过使用气相-质谱联用仪分析检测其分子量，同时初步分析出该物质的分子结构。通过检测得产物分子量为130，与预期结果相符，如图5所示。

进一步通过核磁共振谱来分析产物的结构。称取0.01g产物溶于CDCl₃进行检测。得到的氢谱检测结果如图6所示：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ4.14(s,1H),4.02(d,J＝8.9Hz,1H),3.94(d,J＝8.9Hz,1H),1.22(s,3H),1.07(s,3H)。碳谱的结果如图7所示：¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ177.67(s),77.29(s),77.03(s),76.78(s),76.43(s),75.74(s),40.87(s),22.89(s),18.81(s)。利用SciFinder查找D-泛解酸内酯的质谱、氢谱及碳谱图，进行比较后确认所得产物为D-泛解酸内酯。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 杭州鑫富科技有限公司

浙江工业大学

<120> 源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶

<130> MP1908802

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaacccgt ggttcgagac ggtggcggag gcgcagcgtc gggcgaagaa gcggctgccc 60

tcctcggtgt acggcgcgct ggtcgccggg agcgagaagg gggtgacgat cgacgacaac 120

ctcgcggcgt tcagcgagct ggggttcgcc ccgcacgtcg cgggccacaa ggccgaccgc 180

gacctgacca cgagcgtgat gggcatcgac atctccttcc ccgtcatcat ctcgccgacc 240

ggggtccagg cggtccatcc ggacggcgag gtcgccgtgg cccgggccgc agccgcgcgc 300

ggcaccatca tggggctgtc gtcgttcgcc tcgaagcccg tcgaggaggt cgtggcggcg 360

aacccgaaca cgttcttcca gatgtactgg acgggcacgc gcgaggcgat gatccagcgc 420

atggatcgcg cacggaaggc cggcgcgaag gggctcatcg ccaccctcga ctggtcgttc 480

tccaacggcc gcgactgggg gtcgccggcc atcccggaga agctcaacct caagacgatg 540

gtcgacttcg cccccaacgt gctgccgcat ccgagatggc tgtggacgtt cgccaagtcg 600

ggtcgtctgc ccgacctcac cacgccgaac ctccaggcgc ccggcggaga ggcgcccacg 660

ttcttcggcg cctactacga gtggatgcag accccgcctc ccacctggga ggacgtggcc 720

tggttggcga aggagtgggg cggcccgttc atgctgaagg gcgtcacccg cgtcgacgac 780

gccaagcgcg cggtcgacgc cggggtcacc gccatctcgg tgtcgaacca cggcgggaac 840

aacctcgaca ccaccccggc gacgatccgg atgctgccga gcgtcgccga ggcggtgggc 900

gaccagatcg aggtgctcct cgacggcggg gtgcgccgcg gcagcgacgt cgccaaggcg 960

gtcgcgctcg gggcccgtgc ggtcatgatc ggccgcgcct acctctgggg gctcgccgcg 1020

aacggccagg gcggggtgga gaacgtgctc gacatcctgc gcggaggtct cgactcggcc 1080

gtgctcggga ccgggcacac gagcgtgaag gagctcggac ccgaggacct cgtgatcccc 1140

ccgggcttca cacgcacgct gggggcctca ggagccgacg agagcccggc ctcaccggca 1200

cggaagaccg gccaggcgcg agccggtcag cgcacccaga agccgctcgc caaggccgag 1260

gcggagagcg cctga 1275

<210> 2

<211> 424

<212> PRT

<213> Cnuibacter physcomitrellae(Cnuibacter physcomitrellae)

<400> 2

Met Asn Pro Trp Phe Glu Thr Val Ala Glu Ala Gln Arg Arg Ala Lys

1 5 10 15

Lys Arg Leu Pro Ser Ser Val Tyr Gly Ala Leu Val Ala Gly Ser Glu

20 25 30

Lys Gly Val Thr Ile Asp Asp Asn Leu Ala Ala Phe Ser Glu Leu Gly

35 40 45

Phe Ala Pro His Val Ala Gly His Lys Ala Asp Arg Asp Leu Thr Thr

50 55 60

Ser Val Met Gly Ile Asp Ile Ser Phe Pro Val Ile Ile Ser Pro Thr

65 70 75 80

Gly Val Gln Ala Val His Pro Asp Gly Glu Val Ala Val Ala Arg Ala

85 90 95

Ala Ala Ala Arg Gly Thr Ile Met Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ser Lys

100 105 110

Pro Val Glu Glu Val Val Ala Ala Asn Pro Asn Thr Phe Phe Gln Met

115 120 125

Tyr Trp Thr Gly Thr Arg Glu Ala Met Ile Gln Arg Met Asp Arg Ala

130 135 140

Arg Lys Ala Gly Ala Lys Gly Leu Ile Ala Thr Leu Asp Trp Ser Phe

145 150 155 160

Ser Asn Gly Arg Asp Trp Gly Ser Pro Ala Ile Pro Glu Lys Leu Asn

165 170 175

Leu Lys Thr Met Val Asp Phe Ala Pro Asn Val Leu Pro His Pro Arg

180 185 190

Trp Leu Trp Thr Phe Ala Lys Ser Gly Arg Leu Pro Asp Leu Thr Thr

195 200 205

Pro Asn Leu Gln Ala Pro Gly Gly Glu Ala Pro Thr Phe Phe Gly Ala

210 215 220

Tyr Tyr Glu Trp Met Gln Thr Pro Pro Pro Thr Trp Glu Asp Val Ala

225 230 235 240

Trp Leu Ala Lys Glu Trp Gly Gly Pro Phe Met Leu Lys Gly Val Thr

245 250 255

Arg Val Asp Asp Ala Lys Arg Ala Val Asp Ala Gly Val Thr Ala Ile

260 265 270

Ser Val Ser Asn His Gly Gly Asn Asn Leu Asp Thr Thr Pro Ala Thr

275 280 285

Ile Arg Met Leu Pro Ser Val Ala Glu Ala Val Gly Asp Gln Ile Glu

290 295 300

Val Leu Leu Asp Gly Gly Val Arg Arg Gly Ser Asp Val Ala Lys Ala

305 310 315 320

Val Ala Leu Gly Ala Arg Ala Val Met Ile Gly Arg Ala Tyr Leu Trp

325 330 335

Gly Leu Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gly Val Glu Asn Val Leu Asp Ile

340 345 350

Leu Arg Gly Gly Leu Asp Ser Ala Val Leu Gly Thr Gly His Thr Ser

355 360 365

Val Lys Glu Leu Gly Pro Glu Asp Leu Val Ile Pro Pro Gly Phe Thr

370 375 380

Arg Thr Leu Gly Ala Ser Gly Ala Asp Glu Ser Pro Ala Ser Pro Ala

385 390 395 400

Arg Lys Thr Gly Gln Ala Arg Ala Gly Gln Arg Thr Gln Lys Pro Leu

405 410 415

Ala Lys Ala Glu Ala Glu Ser Ala

420

<210> 3

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcatttc accaacagtt ctttaccttg aataatggaa ataaaatccc cgcaatcgcc 60

atcattggga caggtactag atggtataaa aacgaagaaa cggatgctac cttttcgaac 120

agtttggtcg aacagattgt ttatgctctg aagttacctg gcattattca cattgatgct 180

gctgagatct acagaacata tccagaagtt gggaaggcac ttagcctcac cgaaaaacca 240

agaaatgcaa tattcttgac agacaagtac tcacctcaaa tcaagatgtc agattcccca 300

gcggatggac tagatttagc tttgaagaag atgggcactg actatgtcga tctatacctt 360

ttgcatagcc catttgtttc caaagaggtc aacgggttaa gtttggagga agcctggaag 420

gacatggagc aattgtacaa atcaggtaaa gctaaaaata tcggtgtttc caactttgct 480

gtggaagact tgcaaagaat tctgaaagtt gcggaagtca agccccaagt taatcaaatt 540

gagttcagtc ccttcttgca gaatcaaaca ccagggatct acaaattttg ccaagaacat 600

gatatattgg tagaagcata ctcgccacta ggtcccttac aaaagaaaac agcacaagat 660

gactctcaac cgtttttcga atacgtgaaa gagttatccg agaaatatat caaatctgaa 720

gcccaaatta tcctacgttg ggtgaccaaa cgtggcgtgt tgcctgtaac cacctcttcc 780

aaacctcaaa gaatttctga cgcgcaaaat ttattctctt tcgacttgac ggctgaggaa 840

gtcgataaga taacggagtt gggcttggaa catgaaccgc taagattgta ttggaataaa 900

ttgtacggta aatacaacta cgctgctcaa aaagtataa 939

<210> 4

<211> 312

<212> PRT

<213> 酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 4

Met Ser Phe His Gln Gln Phe Phe Thr Leu Asn Asn Gly Asn Lys Ile

1 5 10 15

Pro Ala Ile Ala Ile Ile Gly Thr Gly Thr Arg Trp Tyr Lys Asn Glu

20 25 30

Glu Thr Asp Ala Thr Phe Ser Asn Ser Leu Val Glu Gln Ile Val Tyr

35 40 45

Ala Leu Lys Leu Pro Gly Ile Ile His Ile Asp Ala Ala Glu Ile Tyr

50 55 60

Arg Thr Tyr Pro Glu Val Gly Lys Ala Leu Ser Leu Thr Glu Lys Pro

65 70 75 80

Arg Asn Ala Ile Phe Leu Thr Asp Lys Tyr Ser Pro Gln Ile Lys Met

85 90 95

Ser Asp Ser Pro Ala Asp Gly Leu Asp Leu Ala Leu Lys Lys Met Gly

100 105 110

Thr Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Leu His Ser Pro Phe Val Ser Lys

115 120 125

Glu Val Asn Gly Leu Ser Leu Glu Glu Ala Trp Lys Asp Met Glu Gln

130 135 140

Leu Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Ala

145 150 155 160

Val Glu Asp Leu Gln Arg Ile Leu Lys Val Ala Glu Val Lys Pro Gln

165 170 175

Val Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly

180 185 190

Ile Tyr Lys Phe Cys Gln Glu His Asp Ile Leu Val Glu Ala Tyr Ser

195 200 205

Pro Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Thr Ala Gln Asp Asp Ser Gln Pro

210 215 220

Phe Phe Glu Tyr Val Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Ile Lys Ser Glu

225 230 235 240

Ala Gln Ile Ile Leu Arg Trp Val Thr Lys Arg Gly Val Leu Pro Val

245 250 255

Thr Thr Ser Ser Lys Pro Gln Arg Ile Ser Asp Ala Gln Asn Leu Phe

260 265 270

Ser Phe Asp Leu Thr Ala Glu Glu Val Asp Lys Ile Thr Glu Leu Gly

275 280 285

Leu Glu His Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Trp Asn Lys Leu Tyr Gly Lys

290 295 300

Tyr Asn Tyr Ala Ala Gln Lys Val

305 310

<210> 5

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60

ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120

agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180

ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240

gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300

ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360

gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggttga 789

<210> 6

<211> 262

<212> PRT

<213> 微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)

<400> 6

Met Gly Tyr Asn Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly

20 25 30

Met Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys

35 40 45

Ile Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln

50 55 60

Gly Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr

65 70 75 80

Val Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val

85 90 95

Glu Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys

100 105 110

Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala

115 120 125

Leu Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met

130 135 140

Ser Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu

165 170 175

Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala

195 200 205

Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu

210 215 220

Ile Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val

225 230 235 240

Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser

245 250 255

Phe Gln Ala Gly Arg Gly

260

Claims

1.L-泛解酸内酯脱氢酶在催化L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯中的应用，其特征在于，所述L-泛解酸内酯脱氢酶来源于Cnuibacter physcomitrellae，其氨基酸序列如SEQID No:2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码权利要求1所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。

3.一种多酶重组细胞，其特征在于，所述多酶重组细胞诱导产生权利要求1所述L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶；

所述L-泛解酸内酯脱氢酶来源于Cnuibacter physcomitrellae，其氨基酸序列如SEQID No:2所示；

所述D-酮基泛解酸内酯还原酶来源于酿酒酵母，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；

所述重组细胞为非植物品种。

4.如权利要求3所述的多酶重组细胞，其特征在于，编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸序列为SEQ ID No:3所示的核苷酸序列。

5.如权利要求3所述的多酶重组细胞，其特征在于，所述多酶重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶。

6.如权利要求5所述的多酶重组细胞，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶来源于微小杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

7.如权利要求6所述的多酶重组细胞，其特征在于，编码所述葡萄糖脱氢酶的多核苷酸序列为SEQ ID No:5所示的核苷酸序列。

8.多酶重组细胞的构建方法，其特征在于，包括：

步骤一，将权利要求2所述的多核苷酸插入第一载体，得到第一重组载体；将权利要求4所述的多核苷酸插入第二载体，得到第二重组载体；以及

9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，将权利要求4和权利要求7中所述的多核苷酸分别插入第二载体，得到第二重组载体。

10.如权利要求8或9所述的构建方法，其特征在于，所述第一载体为pET-28b，所述第二载体为pACYCDuet-1，所述宿主细胞为E. coli BL21(DE3)。

11.一种制备D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，利用多酶重组细胞诱导产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶催化L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯；

所述D-酮基泛解酸内酯还原酶来源于酿酒酵母，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述多酶重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶，以葡萄糖作为辅底物，利用所述葡萄糖脱氢酶连续催化反应体系中的NADP⁺转化为NADPH。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：从反应后的反应体系中分离出D-泛解酸内酯。