CN110423717B

CN110423717B - 多酶重组细胞及多酶级联催化合成d-泛解酸内酯的方法

Info

Publication number: CN110423717B
Application number: CN201910366856.3A
Authority: CN
Inventors: 应向贤; 汪钊; 赵嫚; 程先锋; 林行; 殷杭华; 白彦兵; 陈梁; 毛王伟; 张连春; 余建新; 金文究; 姜伟林; 娄波; 汪军; 刘学愚
Original assignee: Hangzhou Xinfu Technology Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Hangzhou Xinfu Technology Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-05-05
Filing date: 2019-05-05
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2039-05-05
Also published as: CN110423717A

Abstract

本发明涉及微生物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种重组细胞及其在催化合成D‑泛解酸内酯中的应用。所述重组细胞诱导产生L‑泛解酸内酯脱氢酶、D‑酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，能够将DL‑泛解酸内酯或L‑泛解酸内酯去直接合成D‑泛解酸内酯。本发明还提供了一种多酶级联直接催化合成D‑泛解酸内酯的方法，与工业上应用的酶法拆分技术相比，简化了反应过程，提高了反应效率。

Description

多酶重组细胞及多酶级联催化合成D-泛解酸内酯的方法

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种多酶重组细胞及其在合成D-泛解酸内酯中的应用。

背景技术

D-泛解酸内酯是合成D-泛酸和D-泛醇的重要中间体。工业化合成D-泛解酸内酯是采用化学法和水解酶拆分法相结合的技术路线，以廉价的异丁醛和甲醛为起始原料，异丁醛与甲醛在碱性、高温条件下羟醛缩合形成羟基特戊醛；再添加氢氰酸氰化，在酸性条件下进行醇氰化反应形成氰醇；氰醇在酸性条件下通过水解环化得到DL-泛解酸内酯；D-泛解酸内酯水解酶选择性水解D-泛解酸内酯生成D-泛解酸，再经内酯化生成D-泛解酸内酯，留下的L-泛解酸内酯经化学消旋化为DL-泛解酸内酯重新循环拆分。DL-泛解酸内酯是合成D-泛解酸内酯中的关键步骤。水解酶的手性拆分制备工艺需要L-泛解酸内酯的消旋，D-泛解酸和L-泛解酸内酯的分离以及D-泛解酸经酸化成环形成D-泛解酸内酯。水解酶催化的手性拆分法尽管工艺成熟，仍然存在过程复杂、能耗物耗较高、需要消耗较多的酸碱等问题。研究者在生物法或酶法高效、绿色地合成高光学纯度的D-泛解酸内酯方面已做了诸多探索，其中又以基于氧化还原酶的多酶级联催化新工艺最具应用潜力。

多酶组合的一锅法催化过程具有相当多的优点：缩短反应时间，降低产品回收过程的步骤和化学品需求，改变可逆反应的平衡使其往期望的方向转移，消除部分或全部的底物产物抑制问题，减少不稳定中间产物的形成和积累等。Si Dayong等人利用三个氧化还原酶的级联构建了L-泛解酸内酯手性反转为D-泛解酸内酯的新工艺，通过Rhodococcuserythropolis中的L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，中间产物酮基泛解酸内酯会自发水解成酮基泛解酸，之后在D-酮基泛解酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的双酶作用下全部的酮基泛解酸被还原成D-泛解酸，D-泛解酸在酸性条件下最终闭环形成D-泛解酸内酯。在该级联反应体系中，当底物浓度为0.768mol/L时，L-泛解酸内酯的转化率为91.9％，当浓度达到1.15mol/L时，其转化率可达80％(Si D,Urano N,Nozaki S,etal.L-Pantoyl lactone dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis:geneticanalyses and application to the stereospecific oxidation of L-pantoyllactone.Applied Microbiology and Biotechnology,2012,95:431-440)。该方法因为涉及中间产物酮基泛解酸内酯的水解，D-酮基泛解酸还原酶的使用以及后续D-泛解酸酸性成环成D-泛解酸内酯，反应步骤较繁琐，消耗较多的酸，反应时长较长，尚达不到工业化应用的要求。

目前，尚未见生物法或酶法催化DL-泛解酸内酯去消旋化直接合成D-泛解酸内酯的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多酶重组细胞以及多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化直接合成D-泛解酸内酯的方法。

本发明第一方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞诱导产生L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶。

在一个优选例中，所述L-泛解酸内酯脱氢酶来源于嗜甲基拟无枝酸菌，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

进一步地，所述L-泛解酸内酯脱氢酶的编码核苷酸序列选自下组：(3a)SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列；(3b)与(3a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶来源于酿酒酵母，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。

进一步地，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的编码核苷酸序列选自下组：(5a)SEQID No:3所示的核苷酸序列；(5b)与(5a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶。

进一步地，所述葡萄糖脱氢酶来源于微小杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

进一步地，所述葡萄糖脱氢酶的编码核苷酸序列选自下组：(8a)SEQ ID No:5所示的核苷酸序列；(8b)与(8a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明的另一方面，提供所述重组细胞的构建方法，包括：

将编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸插入第一载体，得到第一重组载体；将编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸插入第二载体，得到第二重组载体；以及

将所述第一重组载体和第二重组载体导入宿主细胞，得到重组细胞。

在一个优选例中，将编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸和编码所述葡萄糖脱氢酶的多核苷酸分别插入第二载体，得到第二重组载体。

在一个优选例中，所述第一载体为pET-28b，所述第二载体为pACYCDuet-1，所述所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。

本发明的另一方面，提供一种D-泛解酸内酯的制备方法，其特征在于，利用所述重组细胞诱导产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶催化DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯。

在一个优选例中，所述重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶，以葡萄糖作为辅底物，利用所述葡萄糖脱氢酶连续催化反应体系中的NADP⁺转化为NADPH。

在一优选例中，所述DL-泛解酸内酯与葡萄糖的初始摩尔浓度比为1:0.5～1:3。

在另一优选例中，反应温度为20～50℃，pH为4.0～10.0。

在另一优选例中，所述方法还包括：从反应体系中分离出D-泛解酸内酯。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种重组细胞及其构建方法，所述重组细胞经过诱导培养可以产生L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶。本发明还提供了一种利用所述重组细胞所诱导产生的酶高效催化DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯合成D-泛解酸内酯的方法，所述方法以L-泛解酸内酯脱氢酶不可逆地专一作用于L-泛解酸内酯的脱氢，以立体选择性专一的D-酮基泛解酸内酯还原酶不可逆地催化酮基泛解酸内酯的不对称还原，使反应平衡有利于D-泛解酸内酯的积累，在此过程中两个酶均不能作用于底物中的D-泛解酸内酯。此外，该方法避免了中间产物酮基泛解酸内酯的水解，不需要后续的D-酮基泛解酸还原酶以及D-泛解酸在酸性条件下内酯化，简化了反应过程，提高了反应效率。进一步地，所述重组细胞经过诱导培养可以同时产生L-泛解酸内酯脱氢酶、D-酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，以葡萄糖为辅底物，葡萄糖脱氢酶可以不断将NADP⁺转化为NADPH，建立辅酶循环再生体系，从而极大地降低生产成本，更加适于大规模工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图；

图1为多酶级联反应催化DL-泛解酸内酯去消旋制备D-泛解酸内酯的示意图；

图2为重组细胞三酶共表达的SDS-PAGE检测图。其中：泳道M对应Protein Marker；泳道1对应未诱导的基因工程菌；泳道2对应诱导后的基因工程菌；

图3为D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的气相色谱图；

图4为辅底物葡萄糖与底物DL-泛解酸内酯初始摩尔浓度比对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的影响；

图5为pH对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的影响；

图6为温度对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的影响；

图7为不同辅酶添加对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化多酶体系的影响；

图8为不同FMN添加对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的影响；

图9为不同底物浓度下多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的时间进程；

图10为产物D-泛解酸内酯的GC-MS分析谱图；

图11为产物D-泛解酸内酯的¹H NMR谱图；

图12为产物D-泛解酸内酯的¹³C NMR谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1～12，图1为多酶级联反应催化DL-泛解酸内酯去消旋制备D-泛解酸内酯的示意图；图2为重组细胞三酶共表达的SDS-PAGE检测图；图3为D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的气相色谱图；图4为辅底物葡萄糖与底物DL-泛解酸内酯初始摩尔浓度比对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的影响；图5为pH对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的影响；图6为温度对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的影响；图7为不同辅酶添加对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化多酶体系的影响；图8为不同FMN添加对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的影响；图9为不同底物浓度下多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的时间进程；图10为产物D-泛解酸内酯的GC-MS分析谱图；图11为产物D-泛解酸内酯的¹H NMR谱图；图12为产物D-泛解酸内酯的¹³C NMR谱图。

本发明提出了一种重组细胞，其经过诱导可以产生L-泛解酸内酯脱氢酶、D-酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶。本发明还分别揭示了编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶、D-酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列。

本发明还构建了多酶级联催化DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯合成D-泛解酸内酯体系，极大地简化了反应过程，提高了反应效率，降低了生产成本。

重组细胞、编码各酶的多核苷酸及重组细胞构建方法

本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞用于表达L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶。

本发明还揭示了所述重组细胞产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶的氨基酸序列和其编码核苷酸序列。

本发明中的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。所述DNA可以是单链或者双链。单链DNA可以是编码链或非编码链。本发明中的编码酶的多核苷酸通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。

优选地，所述L-泛解酸内酯脱氢酶来源于嗜甲基拟无枝酸菌，其氨基酸序列如SEQID No:2所示。

进一步地，本发明还揭示了编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，以及与SEQ ID No:1互补的核苷酸序列。本发明还包括所述编码L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸的变异体，其编码与SEQ ID No:2相同氨基酸序列的多肽或多肽衍生物。所述变异体可以是天然发生的变异体或非天然发生的变异体。所述多核苷酸的变异体可以是由一个或多个碱基发生取代、缺失和/或插入所产生的变异体。

优选地，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶来源于酿酒酵母，其氨基酸序列如SEQ IDNo:4所示。

进一步地，本发明还揭示了编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，以及与SEQ ID No:3互补的核苷酸序列。本发明还包括所述编码D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸的变异体，其编码与SEQ ID No:4相同氨基酸序列的多肽或多肽衍生物。所述变异体可以是天然发生的变异体或非天然发生的变异体。所述多核苷酸的变异体可以是由一个或多个碱基发生取代、缺失和/或插入所产生的变异体。

重组细胞催化DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯的体系中，需要NADPH作为氢供体。但是，如果在工业生产中直接在反应体系中添加NADPH，会使成本变得非常高昂。因此，为了使重组细胞更加适用于工业生产，经过进一步改造，其还可以诱导产生葡萄糖脱氢酶。反应时，在体系中加入葡萄糖作为辅底物，诱导产生的葡萄糖脱氢酶即可不断将NADP⁺转化为NADPH，同时葡萄糖转变为葡萄糖酸。

优选地，所述葡萄糖脱氢酶来源于微小杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

进一步地，本发明还揭示了编码所述葡萄糖脱氢酶的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，以及与SEQ ID No:5互补的核苷酸序列。本发明还包括所述编码葡萄糖脱氢酶的多核苷酸的变异体，其编码与SEQ ID No:6相同氨基酸序列的多肽或多肽衍生物。所述变异体可以是天然发生的变异体或非天然发生的变异体。所述多核苷酸的变异体可以是由一个或多个碱基发生取代、缺失和/或插入所产生的变异体。

本发明还包括所述重组细胞的构建方法，包括：

S11，将编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸插入第一载体，得到第一重组载体；将编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸插入第二载体，得到第二重组载体。

S12，将所述第一重组载体和第二重组载体导入宿主细胞，得到重组细胞。所述宿主细胞可以是原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等。

进一步地，为了降低生产成本，使得重组细胞更加适合工业化生产，还可以将编码葡萄糖脱氢酶的基因导入重组细胞。即将编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸和编码所述葡萄糖脱氢酶的多核苷酸分别插入第二载体，得到第二重组载体。然后，将所述第一重组载体和第二重组载体导入宿主细胞，得到重组细胞。所述重组细胞经过诱导培养可以同时产生L-泛解酸内酯脱氢酶、D-酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶。

优选地，将如SEQ ID No:1所示的多核苷酸插入第一载体pET-28b，得到第一重组载体；将如SEQ ID No:3和SEQ ID No:5所示的多核苷酸分别插入所述第二载体pACYCDuet-1，得到第二重组载体。将所述第一重组载体和第二重组载体导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组细胞。

重组细胞在催化生成D-泛解酸内酯中的应用

本发明中的重组细胞诱导产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶具有将DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯催化生成D-泛解酸内酯的酶学活性。反应中的催化剂可以是经过一定分离纯化的粗酶或经过精制的纯酶，也可以是经过诱导培养的重组细胞或细胞破碎液。所述重组细胞作为催化剂时，可以是培养后分离的湿菌体，也可以是细胞冻干粉。不论是上述的哪种形式，其实质都是利用重组细胞产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶对DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯进行催化生成D-泛解酸内酯。

进一步地，所述重组细胞经过诱导培养可以同时产生L-泛解酸内酯脱氢酶、D-酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，不仅能将DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯催化生成D-泛解酸内酯，还能大大降低生产成本。

DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯催化生成D-泛解酸内酯的方法

本发明还包括将所述重组细胞应用于生物催化合成D-泛解酸内酯中。利用重组细胞诱导产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶催化DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯的方法。

上述反应体系中，由于没有辅酶再生系统，因此反应中需要添加价格昂贵的NADPH，这可能是不利于大规模工业化生产的。为了降低大规模工业化生产的成本，所述重组细胞可以同时诱导产生L-泛解酸内酯脱氢酶、D-酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，使得反应体系中建立辅酶再生系统。反应原理如图1所示，底物为DL-泛解酸内酯(或L-泛解酸内酯)，辅底物为葡萄糖，NADPH为氢供体，而葡萄糖脱氢酶不断将NADP⁺转化为NADPH，同时葡萄糖转变为葡萄糖酸。该方法通过辅底物葡萄糖的脱氢将氧化型辅酶NADP⁺还原成NADPH，从而实现辅酶循环，降低了生产成本。该方法还可以避免中间产物酮基泛解酸内酯的水解，不需要后续的D-酮基泛解酸还原酶以及D-泛解酸在酸性条件下内酯化，简化了反应过程，提高了反应效率。

优选地，所述DL-泛解酸内酯与葡萄糖的初始摩尔浓度比为1:0.5～1:3，反应温度为20～50℃，pH为4.0～10.0。

优选地，所述方法还包括从反应体系中分离出D-泛解酸内酯的步骤。具体操作为：利用乙酸乙酯对反应液进行反复萃取，萃取液经过浓缩、结晶及干燥等步骤，得到精制的D-泛解酸内酯。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的L-泛解酸内酯脱氢酶及其应用进行详细描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子生物领域常规实验方法进行，如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的实验方法，或者按照制造厂商所建议的实验方法。

实施例1嗜甲基拟无枝酸菌L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因获取

利用已公开的来源于嗜甲基拟无枝酸菌(Amycolatopsis methanolica)的氧化酶编码基因(GenBank登录号为AIJ22255.1)，经过密码子优化后，人工合成(苏州金唯智生物技术有限公司提供基因合成服务)L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因，核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

实施例2酿酒酵母D-酮基泛解酸内酯还原酶编码基因获取

利用已公开的来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的还原酶编码基因(GenBank登录号为CAA98692.1)，经过密码子优化后，人工合成(苏州金唯智生物技术有限公司提供基因合成服务)D-酮基泛解酸内酯还原酶编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

实施例3微小杆菌葡萄糖脱氢酶编码基因获取

利用已公开的来源于微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)的脱氢酶编码基因(GenBank登录号为ACB59697.1)，经过密码子优化后，人工合成(苏州金唯智生物技术有限公司提供基因合成服务)微小杆菌葡萄糖脱氢酶编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

实施例4多酶重组细胞构建

双酶重组细胞

将酿酒酵母D-酮基泛解酸内酯还原酶编码基因插入到质粒pACYCDuet-1上Nco I/Hind III位点获得重组质粒pACYCDuet-1-SceCPR1。将重组质粒pACYCDuet-1-SceCPR1转入E.coli BL21(DE3)获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1。基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1在含有50μg/mL氯霉素的LB固体培养基上划线分离，挑取单菌落接种与于50mL LB液体培养基中，并加入终浓度50 μg/mL氯霉素，在37℃和200rpm恒温摇床培养10h。取1mL种子液转接至50mL含有50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养至OD600至0.3～0.5，冰上冷却半小时，取菌液离心并洗涤菌体，用氯化钙溶液处理制成E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1感受态细胞。

将嗜甲基拟无枝酸菌L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因插入到质粒pET-28b上的HindIII和Xho I位点得到重组质粒pET-28b-AmeLPLDH。将重组质粒pET-28b-AmeLPLDH导入E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1感受态细胞中，获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-AmeLPLDH/pACYCDuet-1-SceCPR1。基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-AmeLPLDH/pACYCDuet-1-SceCPR1经提取质粒测序表明，两个酶的编码基因插入无误。

三酶重组细胞

将酿酒酵母D-酮基泛解酸内酯还原酶编码基因和微小杆菌葡萄糖脱氢酶编码基因分别插入到质粒pACYCDuet-1上Nco I/Hind III位点和Nde I/Xho I位点获得重组质粒pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH。将重组质粒pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH转入E.coli BL21(DE3)获得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH。基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH在含有50μg/mL氯霉素的LB固体培养基上划线分离，挑取单菌落接种与于50mL LB液体培养基中，并加入终浓度50μg/mL氯霉素，在37℃和200rpm恒温摇床培养10h。取1mL种子液转接至50mL含有50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养至OD₆₀₀至0.3～0.5，冰上冷却半小时，取菌液离心并洗涤菌体，用氯化钙溶液处理制成E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH感受态细胞。

将嗜甲基拟无枝酸菌L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因插入到质粒pET-28b上的HindIII和Xho I位点得到重组质粒pET-28b-AmeLPLDH。将重组质粒pET-28b-AmeLPLDH导入E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH感受态细胞中，获得基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28b-AmeLPLDH/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH。基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-AmeLPLDH/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH经提取质粒测序表明，三个酶的编码基因插入无误。

实施例5多酶重组细胞的诱导表达

E.coli BL21(DE3)/pET-28b-AmeLPLDH/pACYCDuet-1-SceCPR1接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG在22℃诱导培养10～18h，然后离心收集湿菌体，并用pH 7.0的磷酸缓冲液重悬湿菌体洗涤2次。

诱导的基因工程菌经检测表明，嗜甲基拟无枝酸菌L-泛解酸内酯脱氢酶和酿酒酒母酮基泛解酸内酯还原酶均在大肠杆菌中成功表达。

E.coliBL21(DE3)/pET-28b-AmeLPLDH/pACYCDuet-1-SceCPR1-EsGDH接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养过夜，取培养物以体积浓度2％的接种量转接于150mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.3mM的IPTG在22℃诱导培养10～18h，然后离心收集湿菌体，并用pH 7.0的磷酸缓冲液重悬湿菌体洗涤2次。

如图2所示，经过诱导的基因工程菌经SDS-PAGE检测表明，嗜甲基拟无枝酸菌L-泛解酸内酯脱氢酶、酿酒酒母酮基泛解酸内酯还原酶和微小杆菌葡萄糖脱氢酶均在大肠杆菌中成功表达。

实施例6D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的气相色谱分析方法

D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯以及中间产物酮基泛解酸内酯的气相色谱检测条件：Agilent 7890A，手性柱BGB-174(30m×250μm×0.25μm)；进样器和检测器温度250℃，柱温175℃保持7min；载气N₂流量30mL/min；空气流量400mL/min，氢气流量40mL/min，分流比：30:1，进样量：1μL。如图3所示，D-泛解酸内酯、L-泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的保留时间分别为5.32min、5.53min和5.78min。分别称取上述物质，用乙酸乙酯配置成终浓度为5mM，10mM，30mM，50mM，70mM，100mM，利用该气相检测方法，制备浓度与物质峰面积的标准曲线。

实施例7多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋合成D-泛解酸内酯

双酶体系

双酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化反应体系为5mL，分别含有：1g湿菌体，500mM外消旋底物DL-泛解酸内酯，200mM PBS缓冲液(pH 7.0)。反应液加入三口烧瓶中，在磁力搅拌下维持反应条件为30℃，600rpm和pH 7.0，催化过程用1M Na₂CO₃维持pH恒定。

当不额外添加NADPH时，反应24h后，取100μL反应液进行气相色谱检测，结果表明DL-泛解酸内酯无法完全转化。当额外添加NADPH时，反应24h后，取100μL反应液进行气相色谱检测，结果表明D-泛解酸内酯得率大于99％，产物e.e.值大于98％。

三酶体系

三酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化反应体系为5mL，分别含有：1g湿菌体，500mM外消旋底物DL-泛解酸内酯，1.5M辅底物葡萄糖和200mM PBS缓冲液(pH 7.0)。反应液加入三口烧瓶中，在磁力搅拌下维持反应条件为30℃，600rpm和pH 7.0，催化过程用1MNa₂CO₃维持pH恒定。反应24h后，取100μL反应液加入等体积4M盐酸或等当量硫酸，离心取上清100μL，加入1mL乙酸乙酯充分萃取。萃取液离心后吸取上层有机相于离心管中，加入无水硫酸钠除水，再离心取上清转移入气相样品瓶中用于气相色谱检测。结果表明，D-泛解酸内酯得率大于99％，产物e.e.值大于98％。

实施例8多酶级联催化L-泛解酸内酯手性翻转合成D-泛解酸内酯

双酶体系

双酶级联催化L-泛解酸内酯手性翻转合成D-泛解酸内酯反应体系为5mL，分别含有：1g湿菌体，250mM L-泛解酸内酯，100mM磷酸盐缓冲液(pH 5.0)。反应液加入三口烧瓶中，维持反应条件为30℃和pH 5.0，催化过程通过滴加1M Na₂CO₃溶液维持pH恒定。

当不额外添加NADPH时，反应24h后，取100μL反应液进行气相色谱检测，结果表明L-泛解酸内酯无法完全转化。当额外添加NADPH时，反应24h后，取100μL反应液进行气相色谱检测，结果表明D-泛解酸内酯得率大于99％，产物e.e.值大于98％。

三酶体系

三酶级联催化L-泛解酸内酯手性翻转合成D-泛解酸内酯催化体系5mL，分别含有：1g湿菌体，250mM L-泛解酸内酯，500mM辅底物葡萄糖和100mM磷酸盐缓冲液(pH 5.0)。反应液加入三口烧瓶中，维持反应条件为30℃和pH5.0，催化过程通过滴加1M Na₂CO₃溶液维持pH恒定。

反应12h和24h后，各取100μL反应液加入等体积4M盐酸，离心取上清100μL，加入1mL乙酸乙酯充分萃取。萃取液离心后吸取上层有机相于离心管中，加入无水硫酸钠除水，再离心取上清转移入气相样品瓶中用于气相色谱检测。气相色谱检测结果表明，反应12h后，D-泛解酸内酯得率达95.9％，而反应24h后，D-泛解酸内酯得率大于99％，产物e.e.值大于98％。

实施例9葡萄糖与底物的初始摩尔比对催化合成D-泛解酸内酯的影响

以实施例7所述的三酶反应体系，通过改变葡萄糖与底物的摩尔比，研究其对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化合成D-泛解酸内酯的影响。葡萄糖与底物的摩尔浓度之比选择1:1，1.5:1，2:1，3:1，即体系中底物浓度为500mM，分别加入500mM，750mM，1M，1.5M的葡萄糖，结果如图4所示。不添加葡萄糖作为对照，DL-泛解酸内酯去消旋化程度很低。随着葡萄糖浓度的增加，葡萄糖与底物的摩尔浓度比在1:1以上时，DL-泛解酸内酯去消旋化的产物得率显著地增加。当葡萄糖与底物的摩尔浓度比在2:1及以上时，底物中L-泛解酸内酯被全部反应且有效转化为D-泛解酸内酯，最终得率达到99％以上。考虑到经济性，葡萄糖与底物的摩尔比优选为2:1。

实施例10pH和反应温度对催化合成D-泛解酸内酯的影响

以实施例7所述的三酶反应体系，在葡萄糖与底物的摩尔比2:1条件下，通过改变反应体系的pH(4.0～10.0)及反应温度(20～40℃)，研究pH和反应温度对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化合成D-泛解酸内酯的影响，结果如图5和图6所示。

从图5中可以看出，当pH为5.0～8.0时，DL-泛解酸内酯去消旋化反应速率较高；当pH为5.0时，DL-泛解酸内酯去消旋化反应速率最大，且最终得率达到99％以上。因此，优选的反应pH为5.0～8.0，并且优选的反应介质为柠檬酸盐缓冲液。

从图6中可以看出，反应温度在25℃～30℃时，DL-泛解酸内酯去消旋化反应速率较高；反应温度维持在30℃时，DL-泛解酸内酯去消旋化反应速率最大，且最终得率达到99％以上。因此，反应温度优选为25℃～30℃，更优选为30℃。

实施例11辅酶FMN与NADP⁺添加对催化合成D-泛解酸内酯的影响

三酶反应体系(5mL)为：1g湿菌体，500mM DL-泛解酸内酯，1.0M辅底物D-葡萄糖和100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)。反应液加入三口烧瓶中，在磁力搅拌下维持反应条件为30℃，600rpm和pH 5.0，催化过程用1M Na₂CO₃维持pH恒定。反应24h后，取样进行气相色谱分析。

添加辅酶FMN和NADP⁺其中一种或两种，考察辅酶FMN与NADP⁺添加对多酶级联催化DL-泛解酸内酯去消旋化的影响。在催化体系中额外加入辅酶NADP⁺至终浓度10mM，与对照相比产物得率无明显变化，而加入FMN时产物得率则出现了明显下降，结果如图7所示。进一步改变FMN的添加量发现，随着FMN的添加量增加，产物得率逐渐下降，结果如图8所示。因此，该反应体系不需要额外添加辅酶FMN与NADP⁺。

实施例12底物浓度对催化合成D-泛解酸内酯的影响

探究不同底物浓度下产物D-泛解酸内酯最终得率的变化，结果如图9所示。在底物浓度高达750mM时，产物得率仍能保持在99％；当底物浓度达到1M时，即底物浓度达到130g/L，产物得率＞90％。随着底物浓度的逐渐升高到1.25M时，产物得率出现了比较明显的下降。

实施例13产物D-泛解酸内酯的制备分离与鉴定

三酶催化体系(5mL)为：1g湿菌体，500mM DL-泛解酸内酯，1.0M辅底物葡萄糖和100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)。反应液加入三口烧瓶中，在反应条件为30℃和pH 5.0，催化过程用1M Na₂CO₃维持pH恒定。反应24h后，反应结束后，加入2倍于反应液的乙酸乙酯(10mL)，充分搅拌萃取1小时，静置半小时后分离上层萃取液和下层反应液，再向分离的反应液加入10mL乙酸乙酯以同样的操作萃取一次，合并两次萃取液，萃取液经浓缩、结晶、干燥后得到产物，产物总收率大于90％。所获得产物用于后续的气相(GC)、气相-质谱联用(GC-MS)和核磁(NMR)检测。

通过使用气相-质谱联用仪(GC-MS)分析检测其分子量，同时初步分析出该物质的分子结构。通过检测得产物分子量为130，与预期结果相符，结果如图10所示。进一步通过核磁共振谱来分析产物的结构。称取0.01g产物溶于CDCl₃进行检测。得到的氢谱检测结果如图11所示：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ4.14(s,1H),4.02(d,J＝8.9Hz,1H),3.94(d,J＝8.9Hz,1H),1.22(s,3H),1.07(s,3H)。碳谱的结果如图12所示：¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ177.67(s),77.29(s),77.03(s),76.78(s),76.43(s),75.74(s),40.87(s),22.89(s),18.81(s)。利用SciFinder查找D-泛解酸内酯的质谱、氢谱及碳谱图，进行比较后确认所得产物为D-泛解酸内酯。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 杭州鑫富科技有限公司

浙江工业大学

<120> 多酶重组细胞及多酶级联催化合成D-泛解酸内酯的方法

<130> MP1908800

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtccaacg gttggttcga gacggtggcc gaagctcagc ggcgggccag gaaacggctg 60

ccgaagtcgg tctacggcgc attggtggcg ggttccgaac gcgggatcac ggtcgacgac 120

aacatcgccg cgttcgccga actcggcttc gccccgcacg tcgccgggct gtccgacaag 180

cgtgagctgg gcacgaccgt gatgggccag ccgatttcgc tgccggtcgt catctccccc 240

accggcgtcc aggccgtgca ccccgacggc gaggtggccg tggcccgcgc cgcagccgcg 300

cgcggcaccg caatggggct gagctcgttc gccagcaagt ccatcgagga ggtcgcggca 360

gccaacccgc agaccttctt ccagatgtac tgggtcggca gccgggacgt gctcgtgcag 420

cgcatggagc gcgccagggc cgccggcgcg gtcgggctga tcatgacgct ggactggtcg 480

ttctccaccg gccgcgactg gggcagcccg gtcatcccgg agaagctgga cctgaaggcg 540

atggcgcggt tcgcgccgga gggcatcacg cggccgaagt ggctgtggga cttcgcgaag 600

acgcgcaagc tgcccgacct gacgaccccg aacctgaccc cgcccggcgg cacggccccg 660

acgttcttcg gcgcgtacgg cgagtggatg cagacgccgc tgccgacgtg ggaggacgtc 720

gcgtggctgc gggagcagtg gggcgggccg ttcatgctca agggcgtcat gcgggtggac 780

gacgccaagc gggccgtgga cgccggcgtc accgcgatct cggtgtccaa ccacggcggc 840

aacaacctgg acggcacacc ggccccgatc cgcgcgctgc ccgcgatcgc ggacgcggtc 900

ggtggcgatg tcgaggtgct gctggacggc ggcatccggc gcggcagcga cgtcgtcaag 960

gcgatcgccc tcggcgcgaa ggccgtgctc atcggccgcg cgtacctgtg gggcctggcg 1020

gccaacgggc aggccggggt ggagaacgtg ctggacatcc tccgcggcgg catcgactcg 1080

gccgtactgg gcctcggcaa gacctcgatc cacgagctca cccgcgacga cgtggtgatc 1140

ccgcctggct tcgaacgcgc cctcggggtg ccgaagagct ga 1182

<210> 2

<211> 393

<212> PRT

<213> 嗜甲基拟无枝酸菌(Amycolatopsis methanolica)

<400> 2

Met Ser Asn Gly Trp Phe Glu Thr Val Ala Glu Ala Gln Arg Arg Ala

1 5 10 15

Arg Lys Arg Leu Pro Lys Ser Val Tyr Gly Ala Leu Val Ala Gly Ser

20 25 30

Glu Arg Gly Ile Thr Val Asp Asp Asn Ile Ala Ala Phe Ala Glu Leu

35 40 45

Gly Phe Ala Pro His Val Ala Gly Leu Ser Asp Lys Arg Glu Leu Gly

50 55 60

Thr Thr Val Met Gly Gln Pro Ile Ser Leu Pro Val Val Ile Ser Pro

65 70 75 80

Thr Gly Val Gln Ala Val His Pro Asp Gly Glu Val Ala Val Ala Arg

85 90 95

Ala Ala Ala Ala Arg Gly Thr Ala Met Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ser

100 105 110

Lys Ser Ile Glu Glu Val Ala Ala Ala Asn Pro Gln Thr Phe Phe Gln

115 120 125

Met Tyr Trp Val Gly Ser Arg Asp Val Leu Val Gln Arg Met Glu Arg

130 135 140

Ala Arg Ala Ala Gly Ala Val Gly Leu Ile Met Thr Leu Asp Trp Ser

145 150 155 160

Phe Ser Thr Gly Arg Asp Trp Gly Ser Pro Val Ile Pro Glu Lys Leu

165 170 175

Asp Leu Lys Ala Met Ala Arg Phe Ala Pro Glu Gly Ile Thr Arg Pro

180 185 190

Lys Trp Leu Trp Asp Phe Ala Lys Thr Arg Lys Leu Pro Asp Leu Thr

195 200 205

Thr Pro Asn Leu Thr Pro Pro Gly Gly Thr Ala Pro Thr Phe Phe Gly

210 215 220

Ala Tyr Gly Glu Trp Met Gln Thr Pro Leu Pro Thr Trp Glu Asp Val

225 230 235 240

Ala Trp Leu Arg Glu Gln Trp Gly Gly Pro Phe Met Leu Lys Gly Val

245 250 255

Met Arg Val Asp Asp Ala Lys Arg Ala Val Asp Ala Gly Val Thr Ala

260 265 270

Ile Ser Val Ser Asn His Gly Gly Asn Asn Leu Asp Gly Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Ile Arg Ala Leu Pro Ala Ile Ala Asp Ala Val Gly Gly Asp Val

290 295 300

Glu Val Leu Leu Asp Gly Gly Ile Arg Arg Gly Ser Asp Val Val Lys

305 310 315 320

Ala Ile Ala Leu Gly Ala Lys Ala Val Leu Ile Gly Arg Ala Tyr Leu

325 330 335

Trp Gly Leu Ala Ala Asn Gly Gln Ala Gly Val Glu Asn Val Leu Asp

340 345 350

Ile Leu Arg Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val Leu Gly Leu Gly Lys Thr

355 360 365

Ser Ile His Glu Leu Thr Arg Asp Asp Val Val Ile Pro Pro Gly Phe

370 375 380

Glu Arg Ala Leu Gly Val Pro Lys Ser

385 390

<210> 3

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcatttc accaacagtt ctttaccttg aataatggaa ataaaatccc cgcaatcgcc 60

atcattggga caggtactag atggtataaa aacgaagaaa cggatgctac cttttcgaac 120

agtttggtcg aacagattgt ttatgctctg aagttacctg gcattattca cattgatgct 180

gctgagatct acagaacata tccagaagtt gggaaggcac ttagcctcac cgaaaaacca 240

agaaatgcaa tattcttgac agacaagtac tcacctcaaa tcaagatgtc agattcccca 300

gcggatggac tagatttagc tttgaagaag atgggcactg actatgtcga tctatacctt 360

ttgcatagcc catttgtttc caaagaggtc aacgggttaa gtttggagga agcctggaag 420

gacatggagc aattgtacaa atcaggtaaa gctaaaaata tcggtgtttc caactttgct 480

gtggaagact tgcaaagaat tctgaaagtt gcggaagtca agccccaagt taatcaaatt 540

gagttcagtc ccttcttgca gaatcaaaca ccagggatct acaaattttg ccaagaacat 600

gatatattgg tagaagcata ctcgccacta ggtcccttac aaaagaaaac agcacaagat 660

gactctcaac cgtttttcga atacgtgaaa gagttatccg agaaatatat caaatctgaa 720

gcccaaatta tcctacgttg ggtgaccaaa cgtggcgtgt tgcctgtaac cacctcttcc 780

aaacctcaaa gaatttctga cgcgcaaaat ttattctctt tcgacttgac ggctgaggaa 840

gtcgataaga taacggagtt gggcttggaa catgaaccgc taagattgta ttggaataaa 900

ttgtacggta aatacaacta cgctgctcaa aaagtataa 939

<210> 4

<211> 312

<212> PRT

<213> 酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 4

Met Ser Phe His Gln Gln Phe Phe Thr Leu Asn Asn Gly Asn Lys Ile

1 5 10 15

Pro Ala Ile Ala Ile Ile Gly Thr Gly Thr Arg Trp Tyr Lys Asn Glu

20 25 30

Glu Thr Asp Ala Thr Phe Ser Asn Ser Leu Val Glu Gln Ile Val Tyr

35 40 45

Ala Leu Lys Leu Pro Gly Ile Ile His Ile Asp Ala Ala Glu Ile Tyr

50 55 60

Arg Thr Tyr Pro Glu Val Gly Lys Ala Leu Ser Leu Thr Glu Lys Pro

65 70 75 80

Arg Asn Ala Ile Phe Leu Thr Asp Lys Tyr Ser Pro Gln Ile Lys Met

85 90 95

Ser Asp Ser Pro Ala Asp Gly Leu Asp Leu Ala Leu Lys Lys Met Gly

100 105 110

Thr Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Leu His Ser Pro Phe Val Ser Lys

115 120 125

Glu Val Asn Gly Leu Ser Leu Glu Glu Ala Trp Lys Asp Met Glu Gln

130 135 140

Leu Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Ala

145 150 155 160

Val Glu Asp Leu Gln Arg Ile Leu Lys Val Ala Glu Val Lys Pro Gln

165 170 175

Val Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly

180 185 190

Ile Tyr Lys Phe Cys Gln Glu His Asp Ile Leu Val Glu Ala Tyr Ser

195 200 205

Pro Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Thr Ala Gln Asp Asp Ser Gln Pro

210 215 220

Phe Phe Glu Tyr Val Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Ile Lys Ser Glu

225 230 235 240

Ala Gln Ile Ile Leu Arg Trp Val Thr Lys Arg Gly Val Leu Pro Val

245 250 255

Thr Thr Ser Ser Lys Pro Gln Arg Ile Ser Asp Ala Gln Asn Leu Phe

260 265 270

Ser Phe Asp Leu Thr Ala Glu Glu Val Asp Lys Ile Thr Glu Leu Gly

275 280 285

Leu Glu His Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Trp Asn Lys Leu Tyr Gly Lys

290 295 300

Tyr Asn Tyr Ala Ala Gln Lys Val

305 310

<210> 5

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60

ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120

agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180

ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240

gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300

ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360

gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggttga 789

<210> 6

<211> 262

<212> PRT

<213> 微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)

<400> 6

Met Gly Tyr Asn Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly

20 25 30

Met Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys

35 40 45

Ile Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln

50 55 60

Gly Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr

65 70 75 80

Val Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val

85 90 95

Glu Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys

100 105 110

Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala

115 120 125

Leu Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met

130 135 140

Ser Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu

165 170 175

Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala

195 200 205

Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu

210 215 220

Ile Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val

225 230 235 240

Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser

245 250 255

Phe Gln Ala Gly Arg Gly

260

Claims

1.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞诱导产生L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶；

所述L-泛解酸内酯脱氢酶来源于嗜甲基拟无枝酸菌，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；

所述D-酮基泛解酸内酯还原酶来源于酿酒酵母，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；

所述重组细胞为非植物品种。

2.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述L-泛解酸内酯脱氢酶的编码核苷酸序列为SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的编码核苷酸序列为SEQ ID No:3所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶。

5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶来源于微小杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的编码核苷酸序列为SEQ ID No:5所示的核苷酸序列。

7.权利要求1所述重组细胞的构建方法，其特征在于，包括：

步骤一，将编码所述L-泛解酸内酯脱氢酶的多核苷酸插入第一载体，得到第一重组载体，将编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸插入第二载体，得到第二重组载体；以及

步骤二，将所述第一重组载体和第二重组载体导入宿主细胞，得到重组细胞。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，将编码所述D-酮基泛解酸内酯还原酶的多核苷酸和编码葡萄糖脱氢酶的多核苷酸分别插入第二载体，得到第二重组载体。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第一载体为pET-28b，所述第二载体为pACYCDuet-1，所述所述宿主细胞为E. coli BL21(DE3)。

10.一种D-泛解酸内酯的制备方法，其特征在于，利用重组细胞诱导产生的L-泛解酸内酯脱氢酶和D-酮基泛解酸内酯还原酶催化DL-泛解酸内酯或L-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯；

所述D-酮基泛解酸内酯还原酶来源于酿酒酵母，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述重组细胞还诱导产生葡萄糖脱氢酶，以葡萄糖作为辅底物，利用所述葡萄糖脱氢酶连续催化反应体系中的NADP⁺转化为NADPH。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述DL-泛解酸内酯与葡萄糖的初始摩尔浓度比为1:0.5~1:3。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，反应温度为20~50℃，pH为4.0~10.0。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：从反应体系中分离出D-泛解酸内酯。