CN109797140B

CN109797140B - 羰基还原酶突变体、编码基因、重组载体和表达转化体及其在制备(r)-烷基内酯的应用

Info

Publication number: CN109797140B
Application number: CN201910112358.6A
Authority: CN
Inventors: 白云鹏; 邓志敏; 邢晨光; 钱小龙; 赵希景; 陈梦; 郑高伟; 潘江; 许建和
Original assignee: Suzhou Baifu Enzyme Technology Co ltd; Xiamen Oamic Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Baifu Enzyme Technology Co ltd; Xiamen Oamic Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-02-13
Filing date: 2019-02-13
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2039-02-13
Also published as: CN109797140A

Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶突变体，其编码基因和氨基酸序列，含有该基因的重组载体和重组表达转化体，以及利用该羰基还原酶突变体作为催化剂催化系列潜手性羰基化合物的不对称还原，特别是催化羰基位于4‑和5‑位的中链脂肪族酮酸(酯)不对称还原，以制备光学纯的(R)‑γ/δ‑烷基内酯香料化合物的应用。与现有技术相比，本发明具有酶促反应底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，具有很好的应用前景。

Description

羰基还原酶突变体、编码基因、重组载体和表达转化体及其在制备(R)-烷基内酯的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体的涉及具体涉及一种催化性能明显提高的羰基还原酶突变体、其编码核酸和氨基酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该羰基还原酶突变体或重组表达转化体催化潜手性羰基化合物不对称还原，特别是催化羰基位于γ和δ位的中链脂肪族酮酸(酯)不对称还原，以制备光学纯的(R)-γ/δ-烷基内酯香料化合物的应用。

背景技术

香料是一类重要的精细化学品，广泛应用于食品和日化产品中，具有着巨大的消费市场。许多内酯化合物由于具有香味，可作为香料广泛使用，其中γ-烷基内酯和δ-烷基内酯，即羟基酸的4-位或5-位上的羟基与链端的羧基脱水形成的内酯，具有天然的奶油和水果香味，是主要的内酯类香料。绝大多数(R)-烷基内酯芳香气味浓郁，是天然香料的主要有效成分，比如：(R)-γ-癸内酯具有桃子、杏子和草莓的香气，而(R)-δ-癸内酯具有椰奶香味。另外，γ-烷基内酯和δ-烷基内酯这两种化合物也是重要的基础化学品，是合成一些聚合物有用的构建模块，同时也是某些重要天然活性物质，比如抗生素、昆虫的信息素等的组成部分。因此，合成高光学纯度的γ-烷基内酯或δ-烷基内酯具有重大的经济价值。

早期，内酯香料化合物主要是从植物中提取获得，由于资源、技术有限，以天然分离提取的方式获得的香料数量非常少，所以香料的价格一直很昂贵。随着科学技术的发展以及对香精香料化合物的需求不断膨胀，采用化学或生物合成的手段制备香精香料化合物受到人们的关注。

1996年Ku la人通过对蓖麻油酸进行臭氧分解获得(R)-(-)-1,3-壬二醇，在后续的合成中，保持手性羟基的构型不变，最后环化生成γ-癸内酯(Tetrahedron,1996,52:11321-11324)。2004年Corma等人使用锡-高硅沸石/过氧化氢作为催化剂，以单加氧的方式获得δ-癸内酯(Adv.Synth.Catal.,2004,346:257-262)。2006年Sabitha等人使用手性烯烃化合物催化加氢的方法获得δ-癸内酯(Tetrahedron Lett.,2007,38:8179-8181)。尽管如此，由于化学法合成的香料化合物中经常存在副产物，还可能产生不必要的色素杂质，因此在食品和饮料中的应用受到了极大限制。此外，化学合成中大量使用的金属催化剂不仅对环境安全不利，而且也不符合食品安全标准。

美国和欧洲立法都提到，“天然”风味物质只能通过物理过程(从天然来源中提取)和酶催化或微生物发酵过程制备。生物法获得香料的方法包括酵母整细胞发酵和酶法催化。发酵技术在香料合成中的应用得到了快速发展。1963年，Francke首次报道可以利用酿酒酵母和面包酵母细胞生成光学纯的γ-和δ-羟基酸(Nature,1963,197,384–385)。目前，工业上主要利用酵母属细胞进行发酵，利用细胞代谢途径将底物蓖麻油或蓖麻酸转化成所需要的内酯。在这些内酯化合物中，γ-癸内酯的代谢通路是第一个被发现的，也是通过生物技术手段实现的产量最大的内酯化合物。Jung-Ung课题组以10-羟基硬脂酸或12-羟基硬脂酸为原料，通过Waltomyces l ipofer细胞的β-氧化可分别得到51g/L的(R)-γ-十二内酯、28g/L的(R)-γ-癸内酯、12g/L的(R)-γ-丁内酯(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2013,97:8265-8272)。但发酵法获得的γ-内酯存在着副产物多、产品光学纯度低等问题，而且γ-癸内酯和它的前体4-羟基癸酸都被证明对酵母具有毒害作用，产量难以提高。为了解决羟基烷酸和烷基内酯对发酵菌株的毒害，研究者采用了使用耐毒性的酵母、使用吸附剂将内酯从发酵液中分离出来或者对酵母细胞进行固定化来保护酵母细胞等措施，但是目标产物的产量依然不高，故其工业应用尚待深入研究。

采用生物催化的方法制备γ-和δ-烷基内酯的技术一直受到人们的关注，对于烷基内酯的生产来说，生物催化制备烷基内酯的方法主要有以下几种：(1)BVMO单加氧酶催化环酮化合物进行Baeyer-Villiger氧化；(2)水解酶催化动力学拆分外消旋的烷基内酯类化合物；(3)醇脱氢酶选择性氧化二醇化合物的末端羟基，生成的羟基醛环合生成半缩醛，再进一步氧化生成内酯。Blanco等发现猪胰脂肪酶(PPL)可以选择性地催化(S)-构型的γ-癸内酯水解，获得75％ee值的(R)-构型的γ-癸内酯(Tetrahedron Lett.,1988,29:1915-1918)。Boratyński等使用Codexis公司的还原酶试剂盒筛选到一个醇脱氢酶PADH III。利用该酶在外加NAD(P)⁺和FMN的条件下催化1,4-癸二醇的1-羟基氧化，然后分子内环化生成1,4-缩醛，进一步氧化形成癸内酯。制备反应的(R)-癸内酯分离得率为16％，产物的ee值为80％，反应过程中会有一部分的副产物如半缩醛生成(Plos One.2016,11:e0146160)。

等人发现Baeyer-Villiger单加氧酶可以催化环酮的Baeyer-Villiger单加氧反应生成相应的烷基内酯(Chem.Commun.,2015,51:450-456)。2014年Liu等使用烯基酰基载体蛋白还原酶(Fab I)选择性地还原潜手性的化合物，生成手性的环状酮，然后利用CHMO催化Baeyer-Villiger单加氧反应，生成手性的癸内酯(Chem.Commum.,2014,50:9729-9732)。以上几种途径虽然都可以制备手性癸内酯，但是这些反应转化率较低，产物癸内酯的ee值也不高，实际应用有限。

由于癸内酯最直接的前体是其开环对应的羟基酸，如果对潜手性的酮酸进行不对称还原获得单一构型的羟基酸，然后环化生成内酯，是一条最有原子经济性的路径。2017年，发明人从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中克隆得到羰基还原酶SmCR(CN107142251 A)，可以催化4-羰基癸酸和5-羰基癸酸的不对称还原，该酶在30℃下相对稳定，半衰期为90h，对于4-羰基癸酸的Km值为1.26mM，kcat为0.128min^-1。进而通过化学-酶法级联反应获得ee值为99％的(R)-γ-癸内酯和ee值为95％的(R)-δ-癸内酯。在制备反应中，底物上载量最高达到75mM，但催化剂上载量高达150g/L，反应时间长，时空产率低(J.Catal.Commun.,2017,102；CN 107142251 A)。

综上所述，在合成光学纯(R)-γ-癸内酯和(R)-δ-癸内酯等内酯香料化合物的研究中存在许多的不足之处，已知的羰基还原酶SmCR存在着催化活性低，底物上载量低，时空得率低等问题。因此，需要催化性能更好的酶催化剂来满足催化反应效率高、底物浓度高，操作简单，产率高的工业化需求。

发明内容

1、发明目的。

本发明提出了一种催化性能明显改善的突变体。

2、本发明所采用的技术方案。

本发明的技术方案之一，获得催化性能明显改善的羰基还原酶突变体。在先前报道中(CN 107142251A)，筛选得到羰基还原酶SmCR，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。本发明中，以该酶基因作为母本，采用易错PCR、迭代饱和突变、DNA shuffling组合突变等策略对其进行定向进化改造，结合酶标仪高通量初筛和紫外分光光度计法活性检测复筛，鉴别获得活性和热稳定性显著改善的羰基还原酶突变体。

本发明所述的羰基还原酶突变体，是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质的第123位精氨酸替换为半胱氨酸；将第61位缬氨酸、第89位异亮氨酸、第119位赖氨酸、第142位苏氨酸、第159位异亮氨酸、第209位亮氨酸、第183位苯丙氨酸或第184位异亮氨酸中的零个到多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基的衍生蛋白质；将其它氨基酸残基替换成不影响羰基还原酶突变体催化性能的其他氨基酸残基的衍生蛋白质也属于本发明权利要求保护的范围。

具体的，所述羰基还原酶突变体具有如下序列中的一种：

(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸；

(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第89位异亮氨酸替换为亮氨酸；

(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸；同时119位赖氨酸替换为精氨酸；

(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第61位缬氨酸替换为丙氨酸；

(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸；

(6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸；

(7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第184位异亮氨酸替换为缬氨酸；

(8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸；

(9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第142位苏氨酸替换为异亮氨酸；

(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第第159位异亮氨酸替换为亮氨酸；

(11)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第184位异亮氨酸替换为缬氨酸；

(12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸；

(13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为苏氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸；

(14)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为苏氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸，184位异亮氨酸替换为缬氨酸；

(15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为丙氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸，184位异亮氨酸替换为缬氨酸；

(16)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸，184位异亮氨酸替换为缬氨酸；

(17)在以上16种氨基酸序列中，将其它氨基酸残基替换成不影响羰基还原酶突变体催化性能的其他氨基酸残基。

本发明的技术方案之二，提供了编码所述羰基还原酶突变体的核酸序列，以及含有所述酶基因核酸序列的重组表达载体。所述核酸编码表达如技术方案一所述的进化改造获得的羰基还原酶突变体，其来源包括：通过基因工程技术对技术方案一所述的系列羰基还原酶突变体的基因序列进行克隆；或者通过人工全序列合成的方法得到编码如技术方案一所述羰基还原酶突变体的核酸分子。

所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将本发明所述的羰基还原酶突变体基因的编码核酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的还原酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。对于大肠杆菌宿主，所述质粒载体优选的为pET-28a(+)质粒。可通过下述方法制得本发明所述的大肠杆菌重组表达载体：将通过PCR扩增所得的羰基还原酶突变体基因片段用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，同时将空载质粒pET-28a(+)同样用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，回收上述酶切后的羰基还原酶突变体的DNA片段以及空载质粒，利用T4DNA连接酶连接，构建获得用于大肠杆菌表达的含有所述羰基还原酶突变体编码核酸的重组表达载体。

本发明的技术方案之三，提供了一种包含本发明所述羰基还原酶突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)用于高效表达本发明所述的羰基还原酶突变体。

本发明的技术方案之四，提供一种重组羰基还原酶突变体催化剂，所述的重组羰基还原酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：

(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述羰基还原酶突变体的转化体细胞；

(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述羰基还原酶突变体的粗酶液；

(3)将所述羰基还原酶突变体的粗酶液冷冻干燥得到的粗酶粉。

其中所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组羰基还原酶。对于重组大肠杆菌，优选培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 6.5-7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100mL的LB培养基(含卡那霉素)的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16-25℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述羰基还原酶突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组羰基还原酶突变体的粗酶液。收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。

本发明中所述羰基还原酶突变体的活力测定方法：将含2mmol/L4-羰基癸酸甲酯和0.1mmol/L NADPH的1mL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量的羰基还原酶突变体，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。

用下式计算得到酶活力：

酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×l)

式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)定义为上述条件下每分钟催化氧化1μmol NADPH所需的酶量。

本发明的技术方案之五，提供了所述重组羰基还原酶突变体或羰基还原酶突变体催化剂在γ/δ-内酯香料化合物合成中的应用，即提供了利用重组羰基还原酶突变体催化潜手性羰基化合物不对称还原，制备多种不同烷基内酯香料化合物的方法，其制备途径可参照如下反应式：

其中所述潜手性羰基化合物可选自如下通式：

具体的，

化合物1：n＝1，R₁＝C₄H₉，R₂＝H

化合物2：n＝1，R₁＝C₅H₁₁，R₂＝H

化合物3：n＝1，R₁＝C₆H₁₃，R₂＝H

化合物4：n＝1，R₁＝C₆H₁₃，R₂＝CH₃

化合物5：n＝2，R₁＝C₅H₁₁，R₂＝H

化合物6：n＝1，R₁＝C₇H₁₅，R₂＝H

化合物7：n＝1，R₁＝C₈H₁₇，R₂＝H

羰基还原酶突变体催化剂可以催化上述7种化合物不对称还原，生成相应的羟基酸(酯)，再环化形成对应的内酯化合物。

在所述应用中，潜手性羰基化合物的浓度可为50-1000mmol/L，所述的羰基还原酶的用量可选用为0.5-50U/mmol潜手性羰基化合物。反应液中NADPH或NADP⁺的用量为0.1-0.5mmol/L。反应过程中可利用葡萄糖作为辅底物，通过葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖氧化反应实现反应体系中NADPH的辅酶循环，所述葡萄糖脱氢酶的用量可为2-200U/mmol潜手性羰基化合物，所述葡萄糖的用量可为潜手性羰基化合物摩尔浓度的1.0-2.0倍。不对称还原过程中所需的磷酸盐缓冲液为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸钠缓冲液，其浓度较佳为100mmol/L。所述的不对称还原反应是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度为20-40℃，优先30℃。所述的不对称还原反应的时间以底物完全转化或反应自行终止的时间为准，优选反应时间小于24h。

还原反应结束后，采用常规方法对反应液中的还原产物羟基酸(酯)进行分离提取。优选的，在反应液中加入强酸，如硫酸将反应液pH调节至强酸性，优选的，将反应液pH调节至2，然后用乙酸乙酯进行萃取，对萃取液进行浓缩除去溶剂，获得羟基酸(酯)粗产品。提取的羟基酸(酯)粗产品无需进行纯化，即可进行后续的化学转化获得烷基内酯。优选的，将羟基酸(酯)粗产品溶解于二氯甲烷中，冰浴冷却至0℃，然后加入三氟乙酸，室温搅拌，使羟基酸(酯)环化，生成相应的(R)-γ/δ-烷基内酯。环化反应结束后，用碳酸氢钠溶液洗涤除去三氯甲烷，然后对有机相进行干燥、浓缩，纯化获得目标(R)-γ/δ-烷基内酯纯品。

3、本发明所产生的技术效果。

(1)本发明本发明提供了一种催化性能更好的羰基还原酶突变体，高效催化中长链γ/δ-酮酸(酯)的羰基不对称还原，制备光学纯的内酯化合物如：(R)-γ-辛内酯、(R)-γ-壬内酯、(R)-γ-癸内酯、(R)-δ-癸内酯、(R)-γ-十一内酯、(R)-γ-十二内酯。所述的内酯化合物由于具有其独特的香味在香料市场上具有广泛的应用价值。所述的羰基还原酶能够催化浓度高达1000mM的疏水性4-羰基癸酸甲酯底物转化，实现99％以上的转化率，时空产率达到1175g L^-1day^-1。相对于母本羰基还原酶SmCR，本发明得到的羰基还原酶突变体具有催化活性高，可耐受高浓度底物，产物光学纯度高，时空产率高等优势，因此具有很好的工业应用前景。

具体实施方式

下列实施例中的材料来源为：

母本重组质粒pET28a-SmCR，含有如序列表SEQ ID No.1所示的核酸序列，为发明人自行构建，在专利CN 107142251 A中也有公开。

空质粒载体pET28a购自Novagen公司。

E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoR I、Hind III均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。

实施例中的mM为mmol/L的简写。

除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。

实施例1随机突变筛选活性提高的羰基还原酶SmCR突变体

采用易错PCR技术对如序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列的羰基还原酶SmCR进行随机突变。

使用的引物为：

上游引物序列：CCGGAATTCATGAGCTTCGAAGGTAA

下游引物序列：CCCAAGCTTTTAAATCATGTACATGCCG

其中上游引物中GAATTC序列为EcoR I的酶切位点，下游引物中AAGCTT序列为HindIII的酶切位点。

以pET28a-SmCR为模板，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。PCR体系(50μL)：rTaq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)5.0μL，dNTP Mixture(各2.0mM)4.0μL，终浓度为150μmol/L的MnCl₂，pET28a-SmCR质粒100ng，上下游引物(10μM)各2μL，加灭菌蒸馏水补足至50μL。PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因DNA片段与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶EcoR I和Hind III在37℃双酶切6h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与纯化后的目的基因DNA片段置于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。

将转化平板上的转化体用牙签挑入96孔深孔板中，于37℃，220rpm摇床中培养过夜。从一级板的孔洞中吸取50μL菌液接入二级板的相应孔洞中，于37℃，220rpm摇床中培养2～3h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃培养20h。然后于4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基，每个孔洞中加入200μL溶菌酶液(750mg溶菌酶和10mg DNA酶溶解于1L去离子水中)，振荡混匀，再于37℃摇床上处理1.5h。随后4℃、3500×g离心10min，取50μL细胞破碎离心上清液转移到每个孔加了150μL反应液的96孔酶标板中，150μL反应液配方为：100mMPBS，pH 7.0，4mM 4-羰基癸酸甲酯以及0.2mM NADPH，30℃、震荡混匀，在酶标仪上读取340nm处吸光度值的减少。在96孔板中对表达的羰基还原酶蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。

通过筛选，发现将羰基还原酶SmCR的第123位精氨酸替换为半胱氨酸(R123C)，第89位异亮氨酸替换为亮氨酸(I89L)，第61位缬氨酸替换为丙氨酸(V61A)，第209位亮氨酸替换为脯氨酸(L209P)，119位赖氨酸替换为精氨酸(K119R)获得的优选突变体对4-羰基癸酸甲酯的活性显著提高。

实施例2半理性设计构建羰基还原酶SmCR突变体

在实施例1所述突变体的基础上，对易错PCR技术筛选得到的最佳突变体进行同源建模，并将其与底物分子进行分子对接，进而通过对底物口袋附近的氨基酸进行定点饱和突变和组合突变，进一步提高酶的活性。通过Uniprot、NCBI BLAST以及空间结构模建，如序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列的羰基还原酶SmCR的空间立体结构中，在底物4-羰基癸酸甲酯的结合位点周围的氨基酸残基包括：90位苏氨酸、91位天冬氨酸、136位异亮氨酸、137位甘氨酸、139位缬氨酸、142位苏氨酸、15位亮氨酸以及61位缬氨酸等。采用定点饱和突变技术，对这些位点的氨基酸残基进行饱和突变。

使用的引物如表1所示：

表1引物表

以pET28a-SmCR为模板，使用PrimeStar HS premix进行PCR扩增。PCR体系为：2×PrimeStar HS premix 10μL，上下游引物各1μL，pET28a-SmCR质粒40ng，DMSO 1μL，加灭菌蒸馏水补足至20μL。PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸6.3min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，再加1μL的限制性内切酶Dpn I到20μL的PCR产物中，并在37℃条件下保温2h，使模板充分消化降解，将消化产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对培养的细胞进行破壁，以NADPH为辅酶，在96孔板中对表达的蛋白进行高通量活力筛选。取50μL细胞破碎离心上清液转移到每个孔加了150μL反应液的96孔酶标板中，150μL反应液配方为：100mM PBS，pH 7.0，4mM 4-羰基癸酸甲酯以及0.2mM NADPH，30℃、震荡混匀，在酶标仪上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录5分钟内吸光度的变化值，计算相应的酶活力。对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。

所述羰基还原酶突变体的分光光度计活力测定方法：将含2mmol/L 4-羰基癸酸甲酯和0.1mmol/L NADPH的1mL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量的SmCR突变体酶液，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值，计算酶活力。

通过实施例1和2所述的酶标仪高通量筛选，发现将羰基还原酶SmCR的第159位异亮氨酸替换为亮氨酸(I159L)、第142位苏氨酸替换为异亮氨酸(T142I)、第61位缬氨酸替换为赖氨酸(V61K)、第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸(F183Y)、184位异亮氨酸替换为缬氨酸(I184V)获得的系列羰基还原酶突变体对4-羰基癸酸甲酯的活性提高。在此基础上，对一些突变点进行组合，得到了对4-羰基癸酸甲酯活性显著提高的突变体，这些突变体的序列以及这些突变体对4-羰基癸酸甲酯的活性列于表2中。在表2的列表中，序列标号分别指表2后面相对应的一系列序列；突变体活性提高倍数中，一个加号“+”表示突变体蛋白比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了0.1-20倍；两个加号“++”表示突变体蛋白比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了20-50倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了50-100倍。

表2羰基还原酶突变体序列和相应的活性改进列表

所述(R)-4-羰基还原酶突变体氨基酸具有如下序列中的一种：

(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第159位异亮氨酸替换为亮氨酸；

(13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为苏氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸。

(14)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为苏氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸，184位异亮氨酸替换为缬氨酸。

(15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为丙氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸，184位异亮氨酸替换为缬氨酸。

(16)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位精氨酸替换为半胱氨酸，第209位亮氨酸替换为脯氨酸，第61位缬氨酸替换为赖氨酸，第183位苯丙氨酸替换为酪氨酸，184位异亮氨酸替换为缬氨酸。

实施例3重组羰基还原酶SmCR_M12的表达及活力测定

将实施例2获得的羰基还原酶SmCR突变体M12对应的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmCR_M12接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃继续振荡培养，诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞，活力为160U/g。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钾缓冲液(100mM,pH8.0)中，冰水浴中进行超声破碎：功率400W，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液，活力为6.0U/mL。另外，将收获的粗酶液冷冻干燥，获得冻干酶粉活力为0.4U/mg。

实施例4-10重组羰基还原酶SmCR_M12催化潜手性底物的不对称还原

反应在2mL离心管中进行，1mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7.0)中加入10mM的系列潜手性底物(其结构如表3所示)，20mM的葡萄糖，0.5mM的NADP⁺，0.5U的如实施例3获得的重组SmCR_M12粗酶液以及2U的葡萄糖脱氢酶。在恒温振荡器上，1000rpm，30℃下进行反应，反应12小时，加入100μl 1M硫酸溶液终止反应，80℃加热1h，还原反应产物羟基酸(酯)会化学环化生成相应的烷基内酯。用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液中加入无水硫酸钠干燥过夜，测定底物转化率和产物的ee值，结果见表3。

表3 SmCRM12催化系列潜手性底物不对称还原反应的结果

实施例4-10中不同潜手性底物酶法还原、化学法环化所得的终产物烷基内酯的ee值分析条件如表4所示。

表4 SmCR_M12催化不同潜手性底物所得的终产物ee值的分析条件

实施例11重组羰基还原酶SmCR_M12催化合成(R)-γ-辛内酯

在100mL夹套反应器中，在含50mmol/L底物4-羰基辛酸和75mmol/L葡萄糖的50mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 7.0)中，加入100U/L如实施例3所述羰基还原酶突变体SmCR_M12的冻干酶粉，同时加入400U/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。在磁力搅拌下于30℃恒温反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应4小时后，底物转化率达到98％，加入1mol/L硫酸溶液终止反应并将反应液的pH调节为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，剩余物溶解在二氯甲烷(5mL g^-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mL g^-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤除去三氟乙酸后分离有机层，并用无水Na₂SO₄干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物(R)-γ-辛内酯，得285mg产物。用气相色谱法测定得：产物纯度为99％，ee值为96％(R)。

实施例12重组羰基还原酶SmCR_M12催化合成(R)-γ-壬内酯

在100mL夹套反应器中，在含50mmol/L底物4-羰基壬酸和75mmol/L葡萄糖的50mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 7.0)中，加入50U/L如实施例3所述羰基还原酶突变体SmCR_M12的冻干酶粉，同时加入200U/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。在磁力搅拌下于30℃恒温反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应12小时后，底物转化率达到99％，加入1mol/L硫酸溶液终止反应并将反应液的pH调节为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，剩余物溶解在二氯甲烷(5mL g^-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mL g^-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤除去三氟乙酸后分离有机层，并用无水Na₂SO₄干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物(R)-γ-壬内酯，得347mg产物。用气相色谱法测定得：产物纯度为99％，ee值为99％(R)。

实施例13重组羰基还原酶SmCR_M12催化合成(R)-γ-癸内酯

在100mL夹套反应器中，在含50mmol/L底物4-羰基癸酸和50mmol/L葡萄糖的50mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 7.0)中，加入500U/L如实施例3所述羰基还原酶突变体SmCR_M12的冻干酶粉，同时加入1000U/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.1mM的NADPH用于辅酶的循环再生。在磁力搅拌下于30℃恒温反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应4小时后，底物转化率为97％，加入1mol/L硫酸溶液终止反应并将反应液的pH调节为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，剩余物溶解在二氯甲烷(5mL g^-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mL g^-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤除去三氟乙酸后分离有机层，并用无水Na₂SO₄干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物(R)-γ-癸内酯，得312mg产物。用气相色谱法测定得：产物纯度为99％，ee值为99％。

实施例14重组羰基还原酶SmCR_M12催化合成(R)-γ-癸内酯

在100mL夹套反应器中，在含50mmol/L底物4-羰基癸酸和75mmol/L葡萄糖的50mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 7.0)中，加入100U/L如实施例3所述羰基还原酶突变体SmCR_M12的冻干酶粉，同时加入400U/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mM的NADP+用于辅酶的循环再生。在磁力搅拌下于30℃恒温反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应2小时后，底物转化率达到99％，加入1mol/L硫酸溶液终止反应并将反应液的pH调节为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，剩余物溶解在二氯甲烷(5mL g-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mL g^-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤除去三氟乙酸后分离有机层，并用无水Na₂SO₄干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物(R)-γ-癸内酯，得345mg产物。用气相色谱法测定得：产物纯度为99％，ee值为99％。

实施例15重组羰基还原酶SmCR_M12催化合成(R)-γ-癸内酯

在100mL夹套反应器中，在含1000mmol/L底物4-羰基癸酸甲酯和1500mmol/L葡萄糖的50mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH7.0)中，加入12kU/L如实施例3所述羰基还原酶突变体SmCR_M12的静息细胞，同时加入20kU/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mmol/L的NADP⁺用于辅酶的循环再生。在磁力搅拌下于30℃恒温反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应3小时后，底物转化率达到98％，加入1mol/L硫酸溶液终止反应并将反应液的pH调节为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，剩余物溶解在二氯甲烷(5mL g^-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mL g^-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤除去三氟乙酸后分离有机层，并用无水Na₂SO₄干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物(R)-γ-癸内酯，得7.34g产物。用气相色谱法测定得：产物纯度为99％，ee值为97％。

实施例16重组羰基还原酶SmCR_M12催化合成(R)-δ-癸内酯

在100mL夹套反应器中，在含50mmol/L底物5-羰基癸酸和75mmol/L葡萄糖的50mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 7.0)中，加入100U/L如实施例3所述羰基还原酶突变体SmCR_M12的冻干酶粉，同时加入400U/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。在磁力搅拌下于30℃恒温反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应3小时后，底物转化率达到99％，加入1mol/L硫酸溶液终止反应并将反应液的pH调节为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，剩余物溶解在二氯甲烷(5mL g^-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mL g^-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤除去三氟乙酸后分离有机层，并用无水Na₂SO₄干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物(R)-δ-癸内酯，得349mg产物。用气相色谱法测定得：产物纯度为99％，ee值为95％。

实施例17重组羰基还原酶SmCR_M12催化合成(R)-γ-十一内酯

在100mL夹套反应器中，在含50mmol/L底物4-羰基十一烷酸和75mmol/L葡萄糖的50mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 7.0)中，加入50U/L如实施例3所述羰基还原酶突变体SmCR_M12的冻干酶粉，同时加入200U/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。在磁力搅拌下于30℃恒温反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应8小时后，底物转化率达到99％，加入1mol/L硫酸溶液终止反应并将反应液的pH调节为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，剩余物溶解在二氯甲烷(5mL g^-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mL g^-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤除去三氟乙酸后分离有机层，并用无水Na₂SO₄干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物(R)-γ-十一内酯，得396mg产物。用气相色谱法测定得：产物纯度为99％，ee值为99％。

实施例18重组羰基还原酶SmCR_M12催化合成(R)-γ-十二内酯

在100mL夹套反应器中，在含50mmol/L底物4-羰基十二烷酸和75mmol/L葡萄糖的50mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 7.0)中，加入25U/L如实施例3所述羰基还原酶突变体SmCR_M12的冻干酶粉，同时加入100U/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入0.2mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。在磁力搅拌下于30℃恒温反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应16小时后，底物转化率达到98％，加入1mol/L硫酸溶液终止反应并将反应液的pH调节为2。再用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯，剩余物溶解在二氯甲烷(5mL g^-1粗品)中，冰浴冷却至0℃后加入三氟乙酸(0.04mL g^-1粗品)并在室温下搅拌6小时，完成内酯化反应，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤除去三氟乙酸后分离有机层，并用无水Na₂SO₄干燥过夜，最后用硅胶层析柱纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:10)的流动相洗脱目标产物(R)-γ-十一内酯，得403mg产物。用气相色谱法测定得：产物纯度为99％，ee值为99％。

实施例11-18给出了制备不同γ/δ-内酯香料化合物的实施例，可以看出，利用本发明方法所得重组羰基还原酶突变体酶制剂可以高效地催化不同链长的羰基位于4-和5-位的脂肪族酸或酯的不对称还原，再结合化学法即使用三氟乙酸有效地使羟基酸/酯化合物环化形成相应的(R)-γ/δ-内酯香料化合物，此类化合物具有果香味，具有非常大的应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

在本发明的描述中，需要理解的是，本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。

序列表

<110> 苏州百福安酶技术有限公司、厦门欧米克生物科技有限公司

<120> 羰基还原酶突变体、编码基因、重组载体和表达转化体及其在制备(R)-烷基内酯中的应用

<141> 2019-01-14

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 735

<212> DNA

<213> Serratia marcescens

<400> 1

atgagcttcg aaggtaaaat cgttctggtc accggcgcga gccgcggtat tggccgagct 60

attgcagaaa cgtttgtggc acgcagcgcc aaagtgatcg gcaccgcgac cagcgagagc 120

ggcgctgaag cgatcagcag ctacctgggc gcaaacggca aagggtttat gttgaacgtt 180

gttgatgcgc aatctatcga cagcgtgctg gcatcgattc gcgccgaatt tggcgaaatc 240

gacattttag tgaataatgc cggcatcacg cgtgataacc tgctgatgcg tatgaaggat 300

gacgagtggg aggatatcct cgacaccaac ctgacttccg tattccgcct gtcaaaagcg 360

gtaatgcgcg ctatgatgaa aaagcggttt ggccgtatca tcaccatcgg ttccgttgtc 420

ggcaccatgg ggaacgcagg gcaggcgaat tacgcggcgg ctaaagccgg tctgattggt 480

tttagcaaat ctttggcacg tgaagttgct tcgcgtggca ttacggtcaa cgtcgtggca 540

cctggcttta ttgagacgga catgacacgg gcgttgacag atgatcaacg cgcaggcatt 600

ttgtcatcag ttccagccaa ccggctgggc gatgctaaag aaatcgccag cgctgttgca 660

tttttggcct ctgatgaggc cggctatatc accggtgaaa cgttacatgt caatggcggc 720

atgtacatga tttaa 735

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> Serratia marcescens

<400> 2

Met Ser Pro Gly Gly Leu Ile Val Leu Val Thr Gly Ala Ser Ala Gly

1 5 10 15

Ile Gly Ala Ala Ile Ala Gly Thr Pro Val Ala Ala Gly Ala Leu Val

20 25 30

Ile Gly Thr Ala Thr Ser Gly Ser Gly Ala Gly Ala Ile Ser Gly Thr

35 40 45

Leu Gly Ala Ala Gly Leu Gly Pro Met Leu Ala Val Val Ala Ala Gly

50 55 60

Ser Ile Ala Ser Val Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Pro Gly Gly Ile

65 70 75 80

Ala Ile Leu Val Ala Ala Ala Gly Ile Thr Ala Ala Ala Leu Leu Met

85 90 95

Ala Met Leu Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ile Leu Ala Thr Ala Leu Thr

100 105 110

Ser Val Pro Ala Leu Ser Leu Ala Val Met Ala Ala Met Met Leu Leu

115 120 125

Ala Pro Gly Ala Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Val Gly Thr Met Gly

130 135 140

Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly

145 150 155 160

Pro Ser Leu Ser Leu Ala Ala Gly Val Ala Ser Ala Gly Ile Thr Val

165 170 175

Ala Val Val Ala Pro Gly Pro Ile Gly Thr Ala Met Thr Ala Ala Leu

180 185 190

Thr Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ile Leu Ser Ser Val Pro Ala Ala Ala

195 200 205

Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ile Ala Ser Ala Val Ala Pro Leu Ala Ser

210 215 220

Ala Gly Ala Gly Thr Ile Thr Gly Gly Thr Leu His Val Ala Gly Gly

225 230 235 240

Met Thr Met Ile

Claims

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：所述羰基还原酶突变体是如下序列中的一种：

2.一种核酸，编码如权利要求1所述的羰基还原酶突变体。

3.一种重组表达载体，包含如权利要求2所述的核酸。

4.一种重组表达转化体，包含如权利要求3所述的重组表达载体。

5.权利要求1中所述的羰基还原酶突变体的制备方法，其步骤包括：培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离表达的羰基还原酶突变体。

6.根据权利要求5所述的羰基还原酶突变体的制备方法，其特征在于：制备方法为以下任意一种：

(1)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述羰基还原酶突变体的转化体细胞；

(2)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述羰基还原酶突变体的粗酶液；

(3)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述羰基还原酶突变体的粗酶液，将所述羰基还原酶突变体的粗酶液干燥得到粗酶粉。

7.权利要求1中所述的羰基还原酶突变体在制备(R)-烷基内酯的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：包括两个步骤：

(1)使用如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，催化潜手性羰基化合物不对称还原，获得相应的(R)-构型羟基产物；

(2)对获得(R)-构型羟基产物进行环化获得相应的(R)-烷基内酯。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的潜手性羰基化合物的通式为：

其中，

化合物1：n＝1，R1＝C4H9，R2＝H

化合物2：n＝1，R1＝C5H11，R2＝H

化合物3：n＝1，R1＝C6H13，R2＝H

化合物4：n＝1，R1＝C6H13，R2＝CH3

化合物5：n＝2，R1＝C5H11，R2＝H

化合物6：n＝1，R1＝C7H15，R2＝H

化合物7：n＝1，R1＝C8H17，R2＝H。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述潜手性羰基化合物的浓度为10-1000mmol/L，所述的羰基还原酶突变体的用量为0.5-50U/mmol潜手性羰基化合物。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述羰基还原酶突变体催化羰基化合物不对称还原的反应在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADPH/NADP⁺的存在下进行。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶的用量为2-200U/mmol潜手性羰基化合物，所述葡萄糖的用量为潜手性羰基化合物摩尔量的1.0-2.0倍，所述NADPH/NADP⁺的用量为0.1-0.5mmol/L。