CN108048416A - 改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用，所述酮还原酶突变体具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的12至214位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1‑14个氨基酸；其中，所述突变体具有酮还原酶的活性。本发明中通过设计12至214位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了酮还原酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低酮还原酶的使用量。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
手性醇是一类非常重要的手性化合物，是合成手性药物和天然产物等的重要中间体。含手性因素的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异，当前手性药物的研究已成为国际新药研究的主要方向之一。
手性醇化合物在药物合成、农用化学品及其他精细化学品中有着重要应用，如3-氯-1-(4- 氟苯基)丙-1-醇及其衍生物是合成抗抑郁药物托莫西汀、尼索西汀的重要的中间体，具有重要的应用价值。
目前合成手性醇的方法有物理法和化学法。物理法利用两种对映体的结晶速度和结晶形态不同，来对映体进行分离，但适用性极低，且产率低；化学拆分法是制备手性醇的常用方法，但需要手性试剂，理论产率仅为50％，工艺复杂，要求条件高；Pop等(Pop,LauraAncua； Czompa,Andrea；Paizs,Csaba；Toa,Monica Ioana；Vass,Elemer；Matyus,Peter；Irimie, Florin-Dan-Synthesis,2011,#18,p.2921-2928)利用脂肪酶拆分法实现手性醇的制备，获得 99％ee，但产率仅为34-42％，工艺复杂，需多步骤制备手性醇，成本较高，具体步骤如下：
采用手性催化剂进行不对称氢化反应合成手性醇的应用较多，但高效的催化剂很少，且催化过程中较多的苛刻条件，有毒化学品的使用，使得手性醇的合成环境污染性较大，对人员安全存在隐患。Xu,Xianxiu等(Xu,Xianxiu；Fu,Renzhong；Chen,Jin；Chen,Shengwu；Bai, Xu-Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2007,vol.17,#1,p.101-104)利用手性(R) -CBS催化不对称合成(S)-3-氯-1-(4-氟苯基)丙-1-醇，这一方法具有反应速率快，选择性好，回收方便的优点，但是原料氯甲酸乙酯为毒性物质，存在安全隐患，同时步骤较繁琐，需先经某些反应保护氨基和羧基后进行格氏反应，之后脱去保护基团得前驱体(R/S)-α，α’- 二苯基-2-吡咯烷甲醇，在与硼烷或其衍生物进行反应而得到。
酮还原酶是一种普遍存在于自然界中的氧化还原酶，具有将羰基物质不对称还原成相应手性醇的能力，需要辅酶NADH或NADPH的参与，与化学方法比较就有很高的立体和化学选择性，具有安全性和环境相容性，是绿色环保的过程，一步催化到位，具有化学方法不可比拟的优势。但是野生型酮还原酶对于非天然底物，它们的反应活性差异较大，对于特定的非天然底物不反应或者反应极差。同时在稳定性及选择性上差异较大，因此限制了酮还原酶在手性醇的合成及产业化生产的应用。
理性改造和定向进化是通对酶的三维分子结构和定向筛选的方法来对酶分子进行改造，从而去除酶的不良特性，获得高活力，高选择性及高稳定性的酶的方法。CN103320403 A公开了一种酮还原酶LEK突变体及在生物催化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述酮还原酶LEK突变体是将酮还原酶LEK氨基酸位点第209位的S突变G获得的突变体S209G，催化制备(R)-CHBE的转化率达到100％和e.e.值大于99％。CN 103898072 A公开了一种酮还原酶突变体及其应用，所述酮还原酶(来源于超嗜热菌Thermotogamaritima)突变体所示的氨基酸序列的第21位的色氨酸残基突变为谷氨酰胺或丝氨酸，同时将第86位的色氨酸残基突变成谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺或缬氨酸；其改变了野生型酮还原酶对酮酯类化合物(2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或2，4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯)催化的立体倾向性，由S 型催化转变为R型催化，对映体过量值提高到了99.4％。
尽管有几种酮还原酶经过突变得到了突变体，但其并不适用所有的非天然底物，对特定非天然底物催化特性往往具有活力不可预知，选择性不可预知，给特定非天然底物的生物催化生产带来困难，且稳定性和选择性还可以进一步提高，同时，用不同种属来源的酮还原酶催化特定非天然底物，其活力和选择性的不可预知性更大，且其突变体是否能够通过自身辅酶还原从而实现不断生产手性醇，是一个关键问题。一般而言，可以通过定向进化的手段对野生酶进行改造，提高酶的各种性质，从而可以应用在生产当中。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用，所述酮还原酶突变体，提高了其转化效率，稳定性，有利于其在制药领域中的应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种酮还原酶突变体，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：
(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下:
MTKVFVTGANGFVAQHVVHQLLEKNYTVVGSVRSTEKGDKLAKLLNNPKFSYEIIKDMVNSRDEFDKALQKHSDVEIVLHTASPVFPGGIKDVEKEMIQPAVNGTRNVLLSIKDNLPNVKRFVYTSSLAAVRTEGAGYSADEVVTEDSWNNIALKDATKDEGTAYEASKTYGEKEVWNFFEKTKNVNFDFAIINPVYVFGPQLFEEYVTDKLNFSSEIINSIIKGEKKEIEGYEIDVRDIARAHISAVENPATTRQRLIPAVAPYNQQTILDVLNENFPELKGKIDVGKPGSQNEFIKKYYKLDNSKTKKVLGFEFISQEQTIKDAAAQILSVKNGKK；
所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下:
ATGACGAAAGTCTTCGTCACTGGTGCTAACGGTTTCGTCGCTCAACACGTTGTTCATCAACTGCTGGAAAAGAACTACACTGTGGTGGGTTCTGTTCGTTCTACTGAGAAGGGCGATAAACTGGCTAAACTGCTGAACAACCCAAAATTCAGCTACGAGATTATCAAAGACATGGTGAACTCCCGTGACGAGTTCGACAAAGCGCTGCAGAAACACTCTGACGTCGAAATCGTGCTGCATACTGCTTCTCCAGTTTTTCCTGGTGGTATCAAGGACGTAGAAAAAGAGATGATCCAGCCGGCAGTTAACGGTACTCGTAACGTACTGCTGTCTATTAAGGACAACCTGCCGAATGTAAAACGTTTCGTGTACACCTCTAGCCTGGCTGCTGTACGTACTGAAGGTGCAGGTTATTCTGCAGATGAAGTTGTGACCGAAGATTCTTGGAACAACATCGCTCTGAAAGACGCAACCAAAGATGAGGGTACCGCGTATGAAGCAAGCAAAACCTACGGTGAAAAAGAAGTGTGGAACTTCTTCGAGAAAACGAAAAACGTGAACTTCGACTTCGCGATCATTAACCCGGTGTACGTATTCGGCCCGCAGCTGTTTGAAGAATACGTTACCGACAAACTGAACTTCTCCTCCGAAATCATCAACAGCATCATCAAAGGCGAAAAGAAAGAAATCGAAGGCTACGAAATCGACGTTCGCGATATTGCCCGCGCGCACATCAGCGCAGTTGAAAACCCGGCGACCACCCGTCAGCGCCTGATTCCGGCCGTAGCGCCGTATAATCAGCAGACGATTCTGGATGTTCTGAATGAAAACTTTCCGGAACTGAAAGGCAAAATTGATGTTGGCAAACCGGGCAGCCAGAATGAGTTTATCAAGAAATATTACAAACTGGATAACTCCAAAACCAAAAAGGTTCTGGGCTTTGAATTCATCTCCCAGGAACAGACCATCAAAGATGCGGCCGCCCAGATTCTGTCCGTTAAAAACGGCAAAAAGTAA.
(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的12至214位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
所述取代为取代1-13个氨基酸；
其中，所述突变体具有酮还原酶的活性。
本发明中，发明人通过设计12至214位氨基酸的多个不同位点的突变，从而对酮还原酶的性质进行考察，发现这些位点的突变会提高酮还原酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低酶的使用量。
在本发明的另一些实施例中，酮还原酶突变体的氨基酸序列与酮还原酶的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，且具有酮还原酶的活性。
在本发明的一些实施例中，酮还原酶突变体的氨基酸序列与酮还原酶的氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，且具有酮还原酶的活性。
在本发明的一些实施例中，酮还原酶突变体的氨基酸序列与酮还原酶的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，且具有酮还原酶的活性。
在本发明的一些实施例中，酮还原酶突变体的氨基酸序列与酮还原酶的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，且具有酮还原酶的活性。
本发明中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化中的任意一种或至少两种的组合。
所述取代例如可以是取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、 11个、12个、13个或14个。
本发明中，所述突变体具有以下催化活性：
其中，R1选自：H、OH、取代或未取代的C1-10的烷基、取代或未取代的C3-6的环烷基、取代或未取代的C6-12的芳基、取代或未取代的C3-6的杂环基；或，R1为苯环与所连接的杂环一起形成稠环体系；
R2选自：H、OH、取代或未取代的C1-10的烷基、取代或未取代的C3-6的环烷基、取代或未取代的C6-12的芳基、取代或未取代的C3-6的杂环基；或，R1为苯环与所连接的杂环一起形成稠环体系；
n为0-3的整数，X为N、S、O等杂原子，也可为C原子。
根据本发明，所述取代为第12位、第13位、第15位、第77位、第87位、第122位、第124位、第128位、第147位、第163位、第170位、第193位或第214位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。
根据本发明，所述突变体的突变位点为F12Y、V13I、Q15S、I77G、P87C、P87R、F122V、Y124L、Y124F、L128F、D147N、T163W、T170K、I193V或F214T中的任意一个或至少两个的组合。
本发明中，通过进一步实验验证，发明人发现这13个位点的突变，能够进一步提高单加氧酶的性质，其中，第87位、第124位、第128位、第147位、第163位、第193位或第214位的突变会明显提高酮还原酶的催化活性、转化率和参与活力，其他位点的突变，能够明显提高酮还原酶的可溶性表达和选择性。
根据本发明，所述取代为第87位、第124位、第128位、第147位、第163位、第193 位或第214位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代，所述突变体的突变位点为P87R、Y124F、L128F、D147N、T163W、I193V或F214T中的任意一个或至少两个的组合。
根据本发明，所述取代为第128位和第124位的两个氨基酸被取代，第124为和第163 位的两个氨基酸被取代，第87位和第163位的两个氨基酸被取代，第128位和第193位的两个氨基酸被取代，第124位、第163位和第214位的三个氨基酸被取代，第124位、第128 位和第214位的三个氨基酸被取代或第124位、第128位、第163位和第193位的四个氨基酸被取代中的任意一种。
根据本发明，所述突变体的突变位点为Y124F和L128F的组合，Y124F和T163W的组合，P87R和T163W的组合，L128F和I193V的组合、Y124F、T163W和F214T的组合， Y124F、L128F和F214T的组合或Y124F、L128F、T163W和I193V的组合中的任意一种。
本发明中，发明人通过进一步的考察，发现Y124F-L128F、Y124F-T163W、P87R-T163W、 L128F-I193V、Y124F-T163W-F214T、Y124F-L128F-F214T和Y124F-L128F-T163W-I193V这七个突变体的收率最高，转化率能达到86％以上，e.e.值能够达到99％以上，酶的用量也显著减少。
根据本发明，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-9所示。
所述SEQ ID NO.3(Y124F+L128F)所示的氨基酸序列如下：
MTKVFVTGANGFVAQHVVHQLLEKNYTVVGSVRSTEKGDKLAKLLNNPKFSYEIIKDMVNSRDEFDKALQKHSDVEIVLHTASPVFPGGIKDVEKEMIQPAVNGTRNVLLSIKDNLPNVKRFVFTSSFAAVRTEGAGYSADEVVTEDSWNNIALKDATKDEGTAYEASKTYGEKEVWNFFEKTKNVNFDFAIINPVYVFGPQLFEEYVTDKLNFSSEIINSIIKGEKKEIEGYEIDVRDIARAHISAVENPATTRQRLIPAVAPYNQQTILDVLNENFPELKGKIDVGKPGSQNEFIKKYYKLDNSKTKKVLGFEFISQEQTIKDAAAQILSVKNGKK；
所述SEQ ID NO.4(Y124F+T163W)所示的氨基酸序列如下：
MTKVFVTGANGFVAQHVVHQLLEKNYTVVGSVRSTEKGDKLAKLLNNPKFSYEIIKDMVNSRDEFDKALQKHSDVEIVLHTASPVFPGGIKDVEKEMIQPAVNGTRNVLLSIKDNLPNVKRFVFTSSLAAVRTEGAGYSADEVVTEDSWNNIALKDATKDEGWAYEASKTYGEKEVWNFFEKTKNVNFDFAIINPVYVFGPQLFEEYVTDKLNFSSEIINSIIKGEKKEIEGYEIDVRDIARAHISAVENPATTRQRLIPAVAPYNQQTILDVLNENFPELKGKIDVGKPGSQNEFIKKYYKLDNSKTKKVLGFEFISQEQTIKDAAAQILSVKNGKK；
所述SEQ ID NO.5(P87R+T163W)所示的氨基酸序列如下：
MTKVFVTGANGFVAQHVVHQLLEKNYTVVGSVRSTEKGDKLAKLLNNPKFSYEIIKDMVNSRDEFDKALQKHSDVEIVLHTASPVFRGGIKDVEKEMIQPAVNGTRNVLLSIKDNLPNVKRFVYTSSLAAVRTEGAGYSADEVVTEDSWNNIALKDATKDEGWAYEASKTYGEKEVWNFFEKTKNVNFDFAIINPVYVFGPQLFEEYVTDKLNFSSEIINSIIKGEKKEIEGYEIDVRDIARAHISAVENPATTRQRLIPAVAPYNQQTILDVLNENFPELKGKIDVGKPGSQNEFIKKYYKLDNSKTKKVLGFEFISQEQTIKDAAAQILSVKNGKK；
所述SEQ ID NO.6(L128F+I193V)所示的氨基酸序列如下：
MTKVFVTGANGFVAQHVVHQLLEKNYTVVGSVRSTEKGDKLAKLLNNPKFSYEIIKDMVNSRDEFDKALQKHSDVEIVLHTASPVFPGGIKDVEKEMIQPAVNGTRNVLLSIKDNLPNVKRFVYTSSFAAVRTEGAGYSADEVVTEDSWNNIALKDATKDEGTAYEASKTYGEKEVWNFFEKTKNVNFDFAIVNPVYVFGPQLFEEYVTDKLNFSSEIINSIIKGEKKEIEGYEIDVRDIARAHISAVENPATTRQRLIPAVAPYNQQTILDVLNENFPELKGKIDVGKPGSQNEFIKKYYKLDNSKTKKVLGFEFISQEQTIKDAAAQILSVKNGKK；
所述SEQ ID NO.7(Y124F+T163W+F214T)所示的氨基酸序列如下：
MTKVFVTGANGFVAQHVVHQLLEKNYTVVGSVRSTEKGDKLAKLLNNPKFSYEIIKDMVNSRDEFDKALQKHSDVEIVLHTASPVFPGGIKDVEKEMIQPAVNGTRNVLLSIKDNLPNVKRFVFTSSLAAVRTEGAGYSADEVVTEDSWNNIALKDATKDEGWAYEASKTYGEKEVWNFFEKTKNVNFDFAIINPVYVFGPQLFEEYVTDKLNTSSEIINSIIKGEKKEIEGYEIDVRDIARAHISAVENPATTRQRLIPAVAPYNQQTILDVLNENFPELKGKIDVGKPGSQNEFIKKYYKLDNSKTKKVLGFEFISQEQTIKDAAAQILSVKNGKK；
所述SEQ ID NO.8(Y124F+L128F+F214T)所示的氨基酸序列如下：
MTKVFVTGANGFVAQHVVHQLLEKNYTVVGSVRSTEKGDKLAKLLNNPKFSYEIIKDMVNSRDEFDKALQKHSDVEIVLHTASPVFPGGIKDVEKEMIQPAVNGTRNVLLSIKDNLPNVKRFVFTSSFAAVRTEGAGYSADEVVTEDSWNNIALKDATKDEGTAYEASKTYGEKEVWNFFEKTKNVNFDFAIINPVYVFGPQLFEEYVTDKLNTSSEIINSIIKGEKKEIEGYEIDVRDIARAHISAVENPATTRQRLIPAVAPYNQQTILDVLNENFPELKGKIDVGKPGSQNEFIKKYYKLDNSKTKKVLGFEFISQEQTIKDAAAQILSVKNGKK；
所述SEQ ID NO.9(Y124F+L128F+T163W+I193V)所示的氨基酸序列如下：
MTKVFVTGANGFVAQHVVHQLLEKNYTVVGSVRSTEKGDKLAKLLNNPKFSYEIIKDMVNSRDEFDKALQKHSDVEIVLHTASPVFPGGIKDVEKEMIQPAVNGTRNVLLSIKDNLPNVKRFVFTSSFAAVRTEGAGYSADEVVTEDSWNNIALKDATKDEGWAYEASKTYGEKEVWNFFEKTKNVNFDFAIVNPVYVFGPQLFEEYVTDKLNFSSEIINSIIKGEKKEIEGYEIDVRDIARAHISAVENPATTRQRLIPAVAPYNQQTILDVLNENFPELKGKIDVGKPGSQNEFIKKYYKLDNSKTKKVLGFEFISQEQTIKDAAAQILSVKNGKK.
第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的突变体的方法，包括：
(1)制备重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码根据第一方面所述突变体的核酸序列；
(2)在适合表达所述突变体的培养基中孵育所述宿主细胞；
(3)从所述培养基中回收步骤(2)中由所述宿主细胞表达的所述突变体的多肽。
第三方面，本发明提供编码如第一方面所述的酮还原酶突变体的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第三方面所述的核苷酸序列。
根据本发明，所述表达载体上还包括葡萄糖脱氢酶的基因。
第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第四方面所述的表达载体。
本发明中，通过将所述突变体与葡萄糖脱氢酶基因共表达在pRSFDuet-1载体上，从而导入宿主细胞，用于酮催化制备手性醇，可以实现辅酶还原，从而能够在不持续提供辅酶的情况下，合成手性醇，且获得了手性纯度较高的目标构型R型手性醇，ee>95％。
第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的突变体和/或如第五方面所述的宿主细胞在制备手性醇中的应用。
第七方面，本发明提供一种如第一方面所述的突变体和/或如第五方面所述的宿主细胞在制备手性药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明中通过设计12至214位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了酮还原酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低酮还原酶的使用量；
(2)本发明通过验证发现在原酮还原酶的基础上通过这13个位点的单独突变，即F12Y、 V13I、Q15S、I77G、P87C、P87R、F122V、Y124L、Y124F、L128F、D147N、T163W、T170K、I193V和F214T，能够提高酮还原酶的活性，通过将这13个位点的突变进行组合，得到的突变体Y124F-L128F突变体、Y124F-T163W突变体、P87R-T163W突变体、L128F-I193V突变体、Y124F-T163W-F214T突变体、Y124F-L128F-F214T突变体和Y124F-L128F-T163W-I193V 突变体这七个突变体的收率最高，能达到85％以上，e.e.值能够达到99％以上，酶的用量也显著减少；
(3)本发明中的突变体的底物转化率>99％使得底物利用率大大提高，有效节约成本；不仅如此，突变体的酶添加量大大减少，使得成本降低，使得后处理的乳化现象大大降低，同时能够与葡萄糖脱氢酶共表达，实现辅酶还原，转化率可达99％以上，e.e.可达99％以上，使得共表达载体可以应用于手性醇的大规模制备，可以实现大规模生产。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料
表达载体pRSFDuet-1 Novagen，产品编号71341-3。
实施例1单点突变(F12Y)的酮还原酶突变体
酮还原酶突变体基因的构建：
为了提高来源于鲁氏酵母Zygosaccharomyces rouxii的酮还原酶ZrKR(其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.2)的活性、稳定性、可溶表达，选择性，降低酶的使用量，对酮还原酶ZrKR在swissmodel上进行同源模拟，创建ZrKR蛋白三维结构的PDB文件，用PYMOL软件对蛋白三维结构进行分析，在活性位点附近、底物结合位点附近、辅因子结合位点附近、酶分子表面等部位设计氨基酸突变，从而实现对酶的改造。
对F12Y位点分别进行突变，具体步骤如下：
(1)引入突变：设计包含有F12Y位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.10)：tcttcgtcactggtgctaacggttatgtcgctcaacacg；
下游引物(SEQ ID NO.11)：cgtgttgagcgacataaccgttagcaccagtgacgaaga；
将引物和模板质粒混合后，配成PCR体系，用聚合酶进行PCR扩增，所述PCR扩增体系如下：
所述PCR反应的扩增条件如下：
(2)转化和筛选：Dpn I酶切延伸产物，转入大肠杆菌中，培养；
(3)诱导表达：25℃，0.02mM IPTG诱导16h；
(4)粗酶液制备：超声仪超声破碎，离心后获得粗酶液；
(5)活力验证：10ml反应瓶中，称原料100mg用400μl PEG-400溶解底物1；配制2mgNAD、2mg NADP、10mg GDH、302mg葡萄糖、2mL 0.1M PB7.0的混合液加入到底物1中，然后加入1g ZrKR诱导细胞及其突变体诱导细胞(制备成20％酶液)，反应体系于30℃反应 16～20h，具体反应式如下：
实施例2单点突变(V13Y)的酮还原酶突变体
对V13Y进行定点突变，具体步骤如下：
引入突变：设计包含有V13Y位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.12)：gtcactggtgctaacggtttctatgctcaacacgttgttcatcaa；
下游引物(SEQ ID NO.13)：ttgatgaacaacgtgttgagcatagaaaccgttagcaccagtgac；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例3单点突变(V13I)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有Y13I位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.14)：ctggtgctaacggtttcatcgctcaacacgttgtt；
下游引物(SEQ ID NO.15)：aacaacgtgttgagcgatgaaaccgttagcaccag；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例4单点突变(Q15S)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有Q15S位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.16)：ctggtgctaacggtttcgtcgcttcacacgttgttcatc；
下游引物(SEQ ID NO.17)：gatgaacaacgtgtgaagcgacgaaaccgttagcaccag；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例5单点突变(V59F)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有V59F位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.18)：cgagattatcaaagacatgttcaactcccgtgacgagttc；
下游引物(SEQ ID NO.19)：gaactcgtcacgggagttgaacatgtctttgataatctcg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例6单点突变(I77G)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有I77G位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.20)：gcagaaacactctgacgtcgaaggcgtgctgcatactg；
下游引物(SEQ ID NO.21)：cagtatgcagcacgccttcgacgtcagagtgtttctgc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例7单点突变(P87C)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有P87C位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.22)：gctgcatactgcttctccagttttttgtggtggtatcaag；
下游引物(SEQ ID NO.23)：cttgataccaccacaaaaaactggagaagcagtatgcagc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例8单点突变(P87R)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有P87R位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.24)：ctgcttctccagtttttcgtggtggtatcaaggac；
下游引物(SEQ ID NO.25)：gtccttgataccaccacgaaaaactggagaagcag；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例9单点突变(P87E)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有P87E位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.26)：tgctgcatactgcttctccagtttttgagggtggtatcaaggacg；
下游引物(SEQ ID NO.27)：cgtccttgataccaccctcaaaaactggagaagcagtatgcagca；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例10单点突变(F122V)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有F122V位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.28)：acaacctgccgaatgtaaaacgtgtcgtgtacacct；
下游引物(SEQ ID NO.29)：aggtgtacacgacacgttttacattcggcaggttgt；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例11单点突变(Y124L)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有Y124L位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.30)：ctgccgaatgtaaaacgtttcgtgttaacctctagcctgg；
下游引物(SEQ ID NO.31)：ccaggctagaggttaacacgaaacgttttacattcggcag；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例12单点突变(Y124F)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有Y124F位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.32)：tgtaaaacgtttcgtgttcacctctagcctggctg；
下游引物(SEQ ID NO.33)：cagccaggctagaggtgaacacgaaacgttttaca；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例13单点突变(L128F)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有L128F位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.34)：cgtgtacacctctagcttcgctgctgtacgtactg；
下游引物(SEQ ID NO.35)：cagtacgtacagcagcgaagctagaggtgtacacg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例14单点突变(D147N)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有D147N位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.36)：agatgaagttgtgaccgaaaattcttggaacaacatcgc；
下游引物(SEQ ID NO.37)：gcgatgttgttccaagaattttcggtcacaacttcatct；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例15单点突变(T163W)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有T163W位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.38)：aagacgcaaccaaagatgagggttgggcgtatgaagcaagc；
下游引物(SEQ ID NO.39)：gcttgcttcatacgcccaaccctcatctttggttgcgtctt；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例16单点突变(Y165F)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有Y165F位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.40)：aagatgagggtaccgcgtttgaagcaagcaaaac；
下游引物(SEQ ID NO.41)：gttttgcttgcttcaaacgcggtaccctcatctt；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例17单点突变(E166F)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有E166F位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.42)：caaagatgagggtaccgcgtatttcgcaagcaaaacctacggtg；
下游引物(SEQ ID NO.43)：caccgtaggttttgcttgcgaaatacgcggtaccctcatctttg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例18单点突变(A167G)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有A167G位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.44)：ggtaccgcgtatgaaggaagcaaaacctacggt；
下游引物(SEQ ID NO.45)：accgtaggttttgcttccttcatacgcggtacc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例19单点突变(T170K)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有T170K位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.46)：gggtaccgcgtatgaagcaagcaaaaagtacggtgaaaaaga；
下游引物(SEQ ID NO.47)：tctttttcaccgtactttttgcttgcttcatacgcggtaccc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例20单点突变(I193V)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有I193V位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.48)：cttcgacttcgcgatcgttaacccggtgtacgt；
下游引物(SEQ ID NO.49)：acgtacaccgggttaacgatcgcgaagtcgaag；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例21单点突变(F214T)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有F214T位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.50)：cgttaccgacaaactgaacacctcctccgaaatcatcaac；
下游引物(SEQ ID NO.51)：gttgatgatttcggaggaggtgttcagtttgtcggtaacg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例22单点突变(I218F)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有I218F位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.52)：aactgaacttctcctccgaattcatcaacagcatcatc；
下游引物(SEQ ID NO.53)：gatgatgctgttgatgaattcggaggagaagttcagtt；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例23单点突变(I218L)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有I218L位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.54)：aactgaacttctcctccgaactcatcaacagcatcatc；
下游引物(SEQ ID NO.55)：gatgatgctgttgatgagttcggaggagaagttcagtt；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例24单点突变(E234Y)的酮还原酶突变体
引入突变：设计包含有E234Y位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.56)：agaaagaaatcgaaggctactatatcgacgttcgcgatattgc；
下游引物(SEQ ID NO.57)：gcaatatcgcgaacgtcgatatagtagccttcgatttctttct；
其他方法和步骤同实施例1。
转化率检测
反应样品用2倍体积甲基叔丁基醚萃取，有机相送HPLC检测反应转化率及产品手性，结果如表1所示：
表1
从表1可以看出，部分单点突变体的转化效果较母本有所提高，但并未达到理想的效果，单点突变体中实施例1(F12Y)、实施例3(V13I)、实施例6(I77G)、实施例7(P87C)、实施例10(F122V)和实施例11(Y124L)的突变体的催化活性虽然有所下降，但是突变后的酶稳定性提高；单点突变中实施例4(Q15S)、实施例8(P87R)和实施例19(T170K) 的突变体的催化活性虽然有所下降，但是突变后的酶选择性明显提高；单点突变中实施例12 (Y124F)、实施例13(L128F)、实施例14(D147N)、实施例15(T163W)、实施例20(I193V) 和实施例21(F214T)的突变体的催化活性和选择性都得到了明显提高；一般而言，单点突变的突变体性能较母本很难有较大差异，突变点的组合可以获得更优的突变体。
实施例25多点突变的酮还原酶突变体
DNA shuffling是基因在分子水平上进行的有性重组。通过DNA shuffling的方法将突变位点进行随机重组，建立突变文库，然后进行筛选，制备得到多点突变的酮还原酶突变体，具体步骤如下：
(1)将含有突变P87R、Y124F、L128F、T163W、I193V和F214T的同源基因片段等比例混合，用核酸酶I消化成随机片段，切胶回收80bp～200bp的片段，由这些随机片段组成文库。配置N-PCR反应体系，不加引物，通过以下PCR扩增条件进行N-PCR，加入引物进行F-PCR扩增目的条带，获得含有随机组合突变的基因片段，构建至pET22b载体，所述N-PCR的反应体系如下：
所述N-PCR反应的扩增条件如下：
(2)转化和培养：将制备得到的产物，转入大肠杆菌中，培养；
(3)酶液制备：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μl酶解溶液(溶菌酶2mg/mL，多黏菌素0.5mg/mL，pH＝7.0)，37℃保温破碎3h；
(4)高通量筛选：250μl测活体系：底物终浓度2mM，NADPH终浓度0.3mM，破碎酶液加入量100μl，pH＝9.0，温度30℃，筛选得到的突变体进行摇瓶培养，再进行放大反应；
(5)诱导表达：25℃，0.02mM IPTG诱导过夜；
(6)活力验证：10ml反应瓶中，称原料100mg用400μl PEG-400溶解底物1；配制2mgNAD、2mg NADP、10mg GDH、302mg葡萄糖、2mL 0.1M PB7.0的混合液加入到底物1中，然后加入0.1g ZrKR诱导细胞及其突变体诱导细胞破碎制备成20％酶液，反应体系于30℃反应16-20h。
转化率检测
反应样品用2倍体积甲基叔丁基醚萃取，有机相送HPLC检测反应转化率及产品手性，结果如表2所示。
表2
从表2可以看出，本实施例选择的多点突变体Y124F+L128F、Y124F+T163W、 P87R+T163W、L128F+I193V、Y124F+T163W+F214T、Y124F+L128F+F214T和 Y124F+L128F+T163W+I193V这七个突变体相比于单点突变的转化率和选择性进一步的提高，转化率能达到86％以上，e.e.值能够达到99％以上，且使用的酶量减少。
实施例26多点突变体的酶量的验证
进一步验证制备得到的Y124F+L128F突变体和T163W+I193V+Y124F+L128F突变体的酶的使用量及转化率验证，具体步骤如下：
与实施例25相比，除了将Y124F+L128F突变体和T163W+I193V+Y124F+L128F突变体分成6组，分别使用5g、3g、1g、0.5g和0.2g的酶液(突变体细胞破碎后制备的20％酶液)，其他步骤和方法同实施例25，转化率结果如表3所示：
表3
从表3可以看出，L128F+Y124F突变体和T163W+I193V+Y124F+L128F突变体转化率大大提高，L128F+Y124F突变体使用1wt的酶即可实现96.21％的转化率， T163W+I193V+Y124F+L128F突变体使用0.5wt的酶即可实现97.86％的转化率。
实施例27多点突变基因与葡萄糖脱氢酶共表达
具体多点突变基因与葡萄糖脱氢酶共表达载体的构建方法，具体如下：
(1)将来源于Lysinibacillus sphaericus的葡萄糖脱氢酶(GDH)和表达载体pRSFDuet-1 进行BamHI和HindIII双酶切，将酶切后的GDH和表达载体采用T4连接酶进行连接反应，将连接产物转入DH5α菌株感受态细胞中，构建单克隆菌株；
(2)将构建成功的单克隆菌株接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌体提取质粒，获得含有GDH基因的重组载体；
(3)将T163W+I193V+Y124F+L128F突变体和步骤(2)得到的重组载体进行NdeI和XhoI双酶切，将酶切后的片段和质粒采用T4连接酶进行连接反应，将连接产物转入DH5α菌株感受态细胞中，构建单克隆菌株；
(4)将构建成功的单克隆菌株接种于含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌体提取质粒，鉴定，将鉴定正确的重组载体转入BL21(DE3)感受态细胞，构建表达菌株pRSFDuet-(GDH)-(SEQ ID NO.9)。
实施例28多点突变基因与葡萄糖脱氢酶共表达细胞的催化特性
具体共表达细胞的催化特性的方法，步骤如下：
(1)将实施例27构建的pRSFDuet-(GDH)-(SEQ ID NO.9)表达菌株接种于含有30μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，以活化菌株，将活化菌株接种于含有 30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600在0.6-0.7时，加入IPTG至终浓度0.02-1.0mM，在18-25℃下进行诱导表达10-20h后，离心收集菌体，菌体用缓冲液重悬后用超声破碎仪破碎细胞，4℃，12000rpm离心30min获得上清液即为含有诱导表达的葡萄糖脱氢酶和ZrKR突变体T5的粗酶液；
(2)10ml反应瓶中，称原料100mg用400ul PEG-400溶解底物1，配制2mg NAD、2mgNADP、10mg GDH、302mg葡萄糖、2mL 0.1M PB7.0的混合液加入到底物1中，然后加入1wt的步骤(1)制备成的20％粗酶液，于30℃反应16-20h；
(3)反应样品用2倍体积甲基叔丁基醚萃取，有机相送HPLC检测反应转化率，所得体系转化率>99％，e.e.>99％。
实施例29多点突变基因与葡萄糖脱氢酶共表达细胞的催化合成手性醇
具体共表达细胞的催化合成手性醇的方法，步骤如下：
(1)将实施例27构建的pRSFDuet-(GDH)-(SEQ ID NO.9)表达菌株接种于含有30μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，以活化菌株，将活化菌株接种于含有 30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600在0.6-0.7时，加入IPTG至终浓度0.02-1.0mM，在18-25℃下进行诱导表达10-20h后，离心收集菌体，菌体用缓冲液重悬后用超声破碎仪破碎细胞，4℃，12000rpm离心30min获得上清液即为含有诱导表达的葡萄糖脱氢酶和ZrKR突变体SEQ ID NO.9的粗酶液；
(2)将来源于Zygosaccharomyces rouxii的诱导细胞，其他酮还原酶细胞包括来源于 Sporobolomyces salmonicolor、Candida macedoniensis、Saccharomycescerevisiae、 hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus、Pichia stipites、Thermoanaerobium brockii、 Lactobacillus kefir、Streptomyces coelicolor、Devosiariboflavina、Thermoanaerobacter ethanolicus、Candida parapsilosis、Bacillus sp、Pseudomonas frederiksbergensis、Lactobacillus brevis、Thermus thermophilus、Mycobacterium fortuitum subsp、Rhodococcus erythropolis、 Thermusthermophilus.、Candida magnolia、Candida parapsilosis、Comamonas testosteroni、Bombyx mori、Thermus sp、Thermococcus hydrothermalis、HyperthermophilicArchaeon、 Kluyveromyces aestuarii、Neurospora crassa、Clostridium beijerinckii、Nocardia globerula、 Candida utilis.、Hansenula polymorpha.、Acinetobacterbaylyi、Leifsonia sp.、Candida maris strain、Horse liver、stearothermophilusstrain和Hyperthermophilic archaeon thermococcus guaymasensis，离心收集菌体，菌体用缓冲液重悬后用超声破碎仪破碎细胞，4℃，12000rpm 离心30min获得上清液即为粗酶液；
(3)10ml反应瓶中，称原料100mg用400ul PEG-400溶解底物1，配制2mg NAD、2mgNADP、10mg GDH、302mg葡萄糖、2mL 0.1M PB7.0的混合液加入到底物1中，然后加入 1wt的步骤(1)和步骤(2)制备成的20％粗酶液，于30℃反应16-20h；
(4)反应样品用2倍体积甲基叔丁基醚萃取，有机相送HPLC检测反应转化率，结果如表4所示：
表4
从表4可以看出，以上述体系筛选了100种酮还原酶，包含无突变的ZrKR酮还原酶和突变体pRSFDuet-(GDH)-(SEQ ID NO.9)，仅有7种酮还原酶对底物3有转化，表中列出了40种其他不同的酮还原酶，另58种均无转化，未列出。可见，改造的突变体 pRSFDuet-(GDH)-(SEQ ID NO.9)具有较好的催化活力，同时获得了手性纯度较高的目标构型 R型手性醇，ee>95％，因此改造的酮还原酶突变体具有非常好的催化特性和高的对映体选择性，具有很大的优势。
值得注意的是，本实施例中虽然只验证了T163W+I193V+Y124F+L128F突变体与葡萄糖脱氢酶进行共表达的效果，其他突变体包括Y124F+L128F、Y124F+T163W、P87R+T163W、L128F+I193V、Y124F+T163W+F214T和Y124F+L128F+F214T的突变体也能够与葡萄糖脱氢酶进行共表达，也具有催化合成手性醇的效果，在此不再赘述。
综上所述，本发明通过验证发现在原酮还原酶的基础上通过这13个位点的单独突变，即F12Y、V13I、Q15S、I77G、P87C、P87R、F122V、Y124L、Y124F、L128F、D147N、 T163W、T170K、I193V和F214T，能够提高酮还原酶的活性，通过将这13个位点的突变进行组合，得到的突变体Y124F+L128F突变体、Y124F+T163W突变体、P87R+T163W突变体、 L128F+I193V突变体、Y124F+T163W+F214T突变体、Y124F+L128F+F214T突变体和 Y124F+L128F+T163W+I193V突变体这七个突变体的收率最高，能达到85％以上，e.e.值能够达到99％以上，酶的用量也显著减少；不仅如此，所述突变体的底物转化>99％使得底物利用率大大提高，有效节约成本；所述突变体的酶添加量大大减少，使得成本降低，同时使得后处理的乳化现象大大降低，改造后的突变体可以用于手性醇的大规模制备，可以实现大规模生产。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司
<120> 改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用
<130> 2017
<141> 2017-12-25
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 1
Met Thr Lys Val Phe Val Thr Gly Ala Asn Gly Phe Val Ala Gln His
1 5 10 15
Val Val His Gln Leu Leu Glu Lys Asn Tyr Thr Val Val Gly Ser Val
20 25 30
Arg Ser Thr Glu Lys Gly Asp Lys Leu Ala Lys Leu Leu Asn Asn Pro
35 40 45
Lys Phe Ser Tyr Glu Ile Ile Lys Asp Met Val Asn Ser Arg Asp Glu
50 55 60
Phe Asp Lys Ala Leu Gln Lys His Ser Asp Val Glu Ile Val Leu His
65 70 75 80
Thr Ala Ser Pro Val Phe Pro Gly Gly Ile Lys Asp Val Glu Lys Glu
85 90 95
Met Ile Gln Pro Ala Val Asn Gly Thr Arg Asn Val Leu Leu Ser Ile
100 105 110
Lys Asp Asn Leu Pro Asn Val Lys Arg Phe Val Tyr Thr Ser Ser Leu
115 120 125
Ala Ala Val Arg Thr Glu Gly Ala Gly Tyr Ser Ala Asp Glu Val Val
130 135 140
Thr Glu Asp Ser Trp Asn Asn Ile Ala Leu Lys Asp Ala Thr Lys Asp
145 150 155 160
Glu Gly Thr Ala Tyr Glu Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Glu Lys Glu Val
165 170 175
Trp Asn Phe Phe Glu Lys Thr Lys Asn Val Asn Phe Asp Phe Ala Ile
180 185 190
Ile Asn Pro Val Tyr Val Phe Gly Pro Gln Leu Phe Glu Glu Tyr Val
195 200 205
Thr Asp Lys Leu Asn Phe Ser Ser Glu Ile Ile Asn Ser Ile Ile Lys
210 215 220
Gly Glu Lys Lys Glu Ile Glu Gly Tyr Glu Ile Asp Val Arg Asp Ile
225 230 235 240
Ala Arg Ala His Ile Ser Ala Val Glu Asn Pro Ala Thr Thr Arg Gln
245 250 255
Arg Leu Ile Pro Ala Val Ala Pro Tyr Asn Gln Gln Thr Ile Leu Asp
260 265 270
Val Leu Asn Glu Asn Phe Pro Glu Leu Lys Gly Lys Ile Asp Val Gly
275 280 285
Lys Pro Gly Ser Gln Asn Glu Phe Ile Lys Lys Tyr Tyr Lys Leu Asp
290 295 300
Asn Ser Lys Thr Lys Lys Val Leu Gly Phe Glu Phe Ile Ser Gln Glu
305 310 315 320
Gln Thr Ile Lys Asp Ala Ala Ala Gln Ile Leu Ser Val Lys Asn Gly
325 330 335
Lys Lys
<210> 2
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 2
atgacgaaag tcttcgtcac tggtgctaac ggtttcgtcg ctcaacacgt tgttcatcaa 60
ctgctggaaa agaactacac tgtggtgggt tctgttcgtt ctactgagaa gggcgataaa 120
ctggctaaac tgctgaacaa cccaaaattc agctacgaga ttatcaaaga catggtgaac 180
tcccgtgacg agttcgacaa agcgctgcag aaacactctg acgtcgaaat cgtgctgcat 240
actgcttctc cagtttttcc tggtggtatc aaggacgtag aaaaagagat gatccagccg 300
gcagttaacg gtactcgtaa cgtactgctg tctattaagg acaacctgcc gaatgtaaaa 360
cgtttcgtgt acacctctag cctggctgct gtacgtactg aaggtgcagg ttattctgca 420
gatgaagttg tgaccgaaga ttcttggaac aacatcgctc tgaaagacgc aaccaaagat 480
gagggtaccg cgtatgaagc aagcaaaacc tacggtgaaa aagaagtgtg gaacttcttc 540
gagaaaacga aaaacgtgaa cttcgacttc gcgatcatta acccggtgta cgtattcggc 600
ccgcagctgt ttgaagaata cgttaccgac aaactgaact tctcctccga aatcatcaac 660
agcatcatca aaggcgaaaa gaaagaaatc gaaggctacg aaatcgacgt tcgcgatatt 720
gcccgcgcgc acatcagcgc agttgaaaac ccggcgacca cccgtcagcg cctgattccg 780
gccgtagcgc cgtataatca gcagacgatt ctggatgttc tgaatgaaaa ctttccggaa 840
ctgaaaggca aaattgatgt tggcaaaccg ggcagccaga atgagtttat caagaaatat 900
tacaaactgg ataactccaa aaccaaaaag gttctgggct ttgaattcat ctcccaggaa 960
cagaccatca aagatgcggc cgcccagatt ctgtccgtta aaaacggcaa aaagtaa 1017
<210> 3
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 3
Met Thr Lys Val Phe Val Thr Gly Ala Asn Gly Phe Val Ala Gln His
1 5 10 15
Val Val His Gln Leu Leu Glu Lys Asn Tyr Thr Val Val Gly Ser Val
20 25 30
Arg Ser Thr Glu Lys Gly Asp Lys Leu Ala Lys Leu Leu Asn Asn Pro
35 40 45
Lys Phe Ser Tyr Glu Ile Ile Lys Asp Met Val Asn Ser Arg Asp Glu
50 55 60
Phe Asp Lys Ala Leu Gln Lys His Ser Asp Val Glu Ile Val Leu His
65 70 75 80
Thr Ala Ser Pro Val Phe Pro Gly Gly Ile Lys Asp Val Glu Lys Glu
85 90 95
Met Ile Gln Pro Ala Val Asn Gly Thr Arg Asn Val Leu Leu Ser Ile
100 105 110
Lys Asp Asn Leu Pro Asn Val Lys Arg Phe Val Phe Thr Ser Ser Phe
115 120 125
Ala Ala Val Arg Thr Glu Gly Ala Gly Tyr Ser Ala Asp Glu Val Val
130 135 140
Thr Glu Asp Ser Trp Asn Asn Ile Ala Leu Lys Asp Ala Thr Lys Asp
145 150 155 160
Glu Gly Thr Ala Tyr Glu Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Glu Lys Glu Val
165 170 175
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195 200 205
Thr Asp Lys Leu Asn Phe Ser Ser Glu Ile Ile Asn Ser Ile Ile Lys
210 215 220
Gly Glu Lys Lys Glu Ile Glu Gly Tyr Glu Ile Asp Val Arg Asp Ile
225 230 235 240
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245 250 255
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Val Leu Asn Glu Asn Phe Pro Glu Leu Lys Gly Lys Ile Asp Val Gly
275 280 285
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325 330 335
Lys Lys
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<211> 338
<212> PRT
<213> 人工合成序列()
<400> 4
Met Thr Lys Val Phe Val Thr Gly Ala Asn Gly Phe Val Ala Gln His
1 5 10 15
Val Val His Gln Leu Leu Glu Lys Asn Tyr Thr Val Val Gly Ser Val
20 25 30
Arg Ser Thr Glu Lys Gly Asp Lys Leu Ala Lys Leu Leu Asn Asn Pro
35 40 45
Lys Phe Ser Tyr Glu Ile Ile Lys Asp Met Val Asn Ser Arg Asp Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Ala Ser Pro Val Phe Pro Gly Gly Ile Lys Asp Val Glu Lys Glu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ala Val Arg Thr Glu Gly Ala Gly Tyr Ser Ala Asp Glu Val Val
130 135 140
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145 150 155 160
Glu Gly Trp Ala Tyr Glu Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Glu Lys Glu Val
165 170 175
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Ile Asn Pro Val Tyr Val Phe Gly Pro Gln Leu Phe Glu Glu Tyr Val
195 200 205
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Gly Glu Lys Lys Glu Ile Glu Gly Tyr Glu Ile Asp Val Arg Asp Ile
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Ala Arg Ala His Ile Ser Ala Val Glu Asn Pro Ala Thr Thr Arg Gln
245 250 255
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Val Leu Asn Glu Asn Phe Pro Glu Leu Lys Gly Lys Ile Asp Val Gly
275 280 285
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Lys Lys
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<212> PRT
<213> 人工合成序列()
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Lys Lys
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<213> 人工合成序列()
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Val Val His Gln Leu Leu Glu Lys Asn Tyr Thr Val Val Gly Ser Val
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Lys Lys
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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Lys Lys
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
<400> 50
cgttaccgac aaactgaaca cctcctccga aatcatcaac 40
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 51
gttgatgatt tcggaggagg tgttcagttt gtcggtaacg 40
<210> 52
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 52
aactgaactt ctcctccgaa ttcatcaaca gcatcatc 38
<210> 53
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 53
gatgatgctg ttgatgaatt cggaggagaa gttcagtt 38
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 54
aactgaactt ctcctccgaa ctcatcaaca gcatcatc 38
<210> 55
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 55
gatgatgctg ttgatgagtt cggaggagaa gttcagtt 38
<210> 56
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 56
agaaagaaat cgaaggctac tatatcgacg ttcgcgatat tgc 43
<210> 57
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 57
gcaatatcgc gaacgtcgat atagtagcct tcgatttctt tct 43
Claims (10)
1.一种改进的酮还原酶突变体，其特征在于，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：
(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；
(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的12至214位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
所述取代为取代1-13个氨基酸；
其中，所述突变体具有酮还原酶的活性。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述取代为第12位、第13位、第15位、第77位、第87位、第122位、第124位、第128位、第147位、第163位、第170位、第193位或第214位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；
优选地，所述突变体的突变位点为F12Y、V13I、Q15S、I77G、P87C、P87R、F122V、Y124L、Y124F、L128F、D147N、T163W、T170K、I193V或F214T中的任意一个或至少两个的组合。
3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述取代为第87位、第124位、第128位、第147位、第163位、第193位或第214位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；
优选地，所述突变体的突变位点为P87R、Y124F、L128F、D147N、T163W、I193V或F214T中的任意一个或至少两个的组合；
优选地，所述取代为第128位和第124位的两个氨基酸被取代，第124为和第163位的两个氨基酸被取代，第87位和第163位的两个氨基酸被取代，第128位和第193位的两个氨基酸被取代，第124位、第163位和第214位的三个氨基酸被取代，第124为、第128位和第214位的三个氨基酸被取代或第124位、第128位、第163位和第193位的四个氨基酸被取代中的任意一种；
优选地，所述突变体的突变位点为Y124F和L128F的组合，Y124F和T163W的组合，P87R和T163W的组合，L128F和I193V的组合、Y124F、T163W和F214T的组合，Y124F、L128F和F214T的组合或Y124F、L128F、T163W和I193V的组合中的任意一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-9所示。
5.一种制备如权利要求1-4中任一项所述的突变体的方法，其特征在于，包括：
(1)制备重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码根据权利要求1-4中任一项所述突变体的核酸序列；
(2)在适合表达所述突变体的培养基中孵育所述宿主细胞；
(3)从所述培养基中回收步骤(2)中由所述宿主细胞表达的所述突变体的多肽。
6.编码如权利要求1-4中任一项所述的酮还原酶突变体的核苷酸序列。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求6所述的核苷酸序列；
优选地，所述表达载体上还包括葡萄糖脱氢酶的基因。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体。
9.一种如权利要求1-4中任一项所述的突变体和/或如权利要求8所述的宿主细胞在制备手性醇中的应用。
10.一种如权利要求1-4中任一项所述的突变体和/或如权利要求8所述的宿主细胞在制备手性药物中的应用。
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