CN109837317A

CN109837317A - 一种手性双芳基醇化合物的合成方法

Info

Publication number: CN109837317A
Application number: CN201711200541.9A
Authority: CN
Inventors: 孙周通; 刘保艳; 刘贝贝; 曲戈
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2037-11-27
Also published as: CN109837317B

Abstract

本发明公开了一种手性双芳基醇化合物的合成方法。本发明所提供的方法具体为采用来源于赭色掷孢酵母(Sporobolomyces Salmonicolor)的羰基还原酶SSCR的突变体和来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶TbSADH的突变体催化不对称还原(4‑氯苯基)吡啶‑2‑甲酮生成(S)‑(4‑氯苯基)吡啶‑2‑甲醇。实验证明，本发明所提供的方法具有产率高、ee值高，且可以减少辅酶的添加量，不需额外添加如葡萄糖醇脱氢酶等用以辅因子循环的酶，反应条件温和，操作简单等优点。

Description

一种手性双芳基醇化合物的合成方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种手性双芳基醇化合物的合成方法，具体涉及两种醇脱氢酶，包括一种来源于赭色掷孢酵母(Sporobolomyces Salmonicolor)的羰基还原酶SSCR和一种来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶TbSADH的突变体，以及利用相应突变体作为催化剂在不对称还原制备光学双芳基仲醇中的应用。

背景技术

手性双芳基仲醇是一类重要的手性化合物，很多药物的分子结构中都存在双芳基仲醇的砌块结构，其中，(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇是一种抗组胺药物合成手性前体，可用来合成抗组胺类药物卡比沙明(Barouh et al.,J.Med.Chem.,1971,14(9):834-836)和苯磺酸贝他斯汀(Takahashi et al.,Clin.Exp.Dermatol.,2004,29(5):526-532)。而且，由前手性双芳基酮经不对称还原反应合成手性双芳基醇的工艺具有原子经济性高的优点。

目前，化学法不对称还原合成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的方法主要有：以2-腈基吡啶为起始底物在4-氯苯溴化镁、浓硫酸和金属催化剂Pd(Phe₃P)₄等的作用下经三步合成，ee值可以达到98％，但是其中吡啶环上的N-基团需要进行保护和去保护(Corey&Helal,Tetrahedron Letters,1996,37(32):5675-5678)。近几年来使用较多的还有Noyori有机金属催化剂，如：Ru和Rh复合体等可通过直接加氢还原前手性酮底物(4-氯苯基)(2-吡啶基)甲酮为手性醇，ee值达到97-99％(Tao et al.,J.Org.Chem.,2012,77(1):612-616；Yanget al.,Org.Lett.,2015,17(17):4144-4147)。

虽然这些化学合成法可以获得高ee值的产物，但是整个过程需要用到诸如浓硫酸、H₂(8-10bar)、高压和有机金属试剂等，不仅会对环境造成伤害，而且劳动保护要求较高。

生物法不对称还原合成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的方法主要有：利用藻酸钙固定化面包酵母通过不对称还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮合成相应的产物，或者通过选择性水解(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇醋酸酯获得手性产物(Takemoto&Achiwa,Chem.Pharm.Bull.,1994,42(4):802-805；Takemoto et al.,Phytochemistry,1996,42(2):423-426)，但是(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇产物的ee值只有28％。同时该作者也报道了利用固定化植物细胞催化前手性酮(4-氯苯基0吡啶-2-甲酮合成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的研究，ee值最高达到48％(Takemoto et al.,Phytochemistry,1996,42(2):423-426；Takemoto et al.,Chem.Pharm.Bull.,1998,46(3):419-422)。但这些全细胞转化方法效率较低，而且都没有相关酶的氨基酸序列的报道。2007年Truppo等报道了采用商业化的羰基还原酶(ketoreductase,KRED)不对称还原前手性酮合成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的研究，但是ee值只有60％，酶蛋白序列未知，物种来源也未见报道(Truppo et al.,Org.Lett.,2007,9(2):335-338)。Li等2009年报道了利用赭色掷孢酵母(Sporobolomycessalmonicolor)来源的羰基还原酶SSCR进行不同类型的二芳基类酮底物不对称还原反应的研究，但是尚未测试对(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮的活性(Li et al.,Adv.Synth.Catal.,2009,351(4):583-588)。倪晔等2012年通过传统富集培养筛选到一株克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.CCTCCM2011385)，该酵母可催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇(86.7％ee)(CN102559520A)。然而野生菌中活性酶的含量低，最高仅能催化2g/L底物，产物浓度也较低，且分离成本高，因而不能满足实际应用。李哲等于2013年研究了一种来源于毕赤酵母GS115的羰基还原酶PasCR，该酶可不对称还原催化双芳基甲酮类化合物，转化率最高只有50％(李哲等，生物工程学报，2013,29：68-77)。周婕妤等2016年对来源于克鲁维酵母的醇脱氢酶(命名为KpADH)进行了分离纯化，并通过蛋白质工程改造筛选得到KpADH突变体M131F、S196Y和S237A，野生型醇脱氢酶KpADH和三个突变体均可催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(R)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，转化率最高可达99％，(R)-产物ee值为74.7％-96.1％(Zhou et al.,Catal.Sci.Technol.,2016,6(16):6320-6327)。

由以上数据可知，采用生物不对称还原法制备手性(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇不仅产率低，并且立体选择性达不到工业化要求，需要进一步开发高效醇脱氢酶。

发明内容

本发明提供了一种利用醇脱氢酶不对称还原催化制备(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的方法。其中，所述醇脱氢酶为赭色掷孢酵母(Sporobolomyces Salmonicolor)的羰基还原酶SSCR或者为来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶TbSADH。通过对野生型羰基还原酶SSCR及醇脱氢酶TbSADH进行关键位点突变，来获得高产率、高ee值的突变体。

第一，本发明提供了醇脱氢酶或其相关生物材料在合成手性双芳基醇化合物中的应用。

所述醇脱氢酶选自如下任一：羰基还原酶SSCR、所述羰基还原酶SSCR的突变体、醇脱氢酶TbSADH或所述醇脱氢酶TbSADH的突变体；

所述羰基还原酶SSCR的氨基酸序列为SEQ ID No.2；

所述羰基还原酶SSCR的突变体为将位于所述羰基还原酶SSCR的催化中心口袋中的氨基酸残基进行突变后得到；

所述醇脱氢酶TbSADH氨基酸序列为SEQ ID No.4；

所述醇脱氢酶TbSADH的突变体为将位于所述醇脱氢酶TbSADH的催化中心口袋中的氨基酸残基和/或能够改变辅因子偏好性的氨基酸残基进行突变后得到。

进一步地，所述羰基还原酶SSCR的突变体为如下任一：(a1)与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相比，在或仅在SEQ ID No.2的第242位和/或第245位存在突变；(a2)在(a1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。所述第242位和第245位氨基酸残基位于SSCR催化中心口袋，与双芳基酮对位取代基的距离非常近，为影响底物转化率及(S)型产物ee值的关键位点，通过改造第242位和第245位氨基酸残基可提高底物的转化率及(S)型产物的ee值；

进一步地，所述醇脱氢酶TbSADH的突变体为如下任一：(b1)与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相比，在或仅在SEQ ID No.4的第39位、第85位、第86位、第110位、第198位、第294位和/或第295位存在突变。(b2)在(b1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。所述第39位、第110位氨基酸残基位于TbSADH催化中心的大口袋；第85位、第86位、第294位及第295位氨基酸残基位于TbSADH催化中心的小口袋。这些氨基酸残基均是影响TbSADH对于底物对映体选择性的关键位点；而第198位氨基酸残基是改变辅因子偏好性的关键位点，通过改造第198位氨基酸残基可使TbSADH辅因子偏好性发生翻转，具有较大的应用价值，尤其是与其它工业酶偶联的串联反应。

所述相关生物材料为能够表达所述醇脱氢酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

进一步地，所述手性双芳基醇化合物为(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇。

第二，本发明提供了一种(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的合成方法。

本发明所提供的(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的合成方法，具体可包括如下步骤：以醇脱氢酶作为生物酶催化底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇；所述底物为(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮。

所述羰基还原酶SSCR的氨基酸序列为SEQ ID No.2；

所述醇脱氢酶TbSADH氨基酸序列为SEQ ID No.4；

在所述方法中，所述醇脱氢酶可以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用。

进一步，所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶具体可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述醇脱氢酶，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶。所述全细胞可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述醇脱氢酶，得到的重组细胞即为所述全细胞。

再进一步，所述重组细胞具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：向所述宿主细胞导入能够表达所述醇脱氢酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述醇脱氢酶的所述重组细胞。

更进一步，所述“能够表达所述醇脱氢酶的核酸分子”是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。其中，所述重组载体可为携带有所述醇脱氢酶的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-28a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将所述醇脱氢酶的编码基因替换pET22b(+)的NdeI和HindIII之间的小片段后得到的重组质粒。

进一步地，所述宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞。

更进一步地，所述原核细胞具体可为细菌；所述低等真核细胞具体可为酵母细胞。

在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞具体为大肠杆菌，更加具体的为E.coliBL21(DE3)。相应的，所述诱导培养为向培养体系中加IPTG至终浓度0.05～1.0mmol/L(如0.1mmol/L)，20～30℃(如20℃)诱导培养10～20小时(如18小时)。

在所述方法中，在以所述醇脱氢酶作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应中，反应体系中除了含有所述底物和所述醇脱氢酶外，还可含有异丙醇和所述醇脱氢酶的辅酶。

进一步的，所述醇脱氢酶的辅酶具体可为NADP⁺或NAD⁺。

在所述方法中，以所述醇脱氢酶作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应是在浓度为0.001～0.1mol/L(如0.1mol/L)，pH 6～8(如pH7)的磷酸盐缓冲液中进行的。

在所述方法中，在以所述醇脱氢酶作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应中，反应温度可为20～35℃，具体如30℃；

在所述方法中，在以所述醇脱氢酶作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应中，反应时间为反应完全为准，一般为1～24小时，具体如24小时。

在所述方法中，所述底物在所述反应体系中浓度为1～10mmol/L(如10mmol/L)；所述醇脱氢酶在所述反应体系中浓度为1～10g/L(如10g/L)；所述异丙醇在所述反应体系中的体积百分含量为10％～30％(如10％)；所述NADP⁺或所述NAD⁺在所述反应体系中的浓度为0.1～1.0mmol/L(如1.0mmol/L)。

在所述方法中，反应结束后还包括按本领域常规方法从反应液中萃取(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的步骤。

前文(a1)所示的所述羰基还原酶SSCR的突变体为与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相比，存在或仅存在如下任一个或多个突变：Q245P、Q245H、Q245L、M242L。前文(b1)所示的所述醇脱氢酶TbSADH的突变体为与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相比，存在或仅存在如下任一个或多个突变：S39T、A85G、I86A、W110A、G198D、L294A、C295A、A85、△I86。

更加具体的，前文(a1)所示的所述羰基还原酶SSCR的突变体为与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相比，存在或仅存在如下任一所示突变：Q245P、Q245H、Q245L、M242L/Q245P、M242L/Q245H、M242L/Q245L和M242L。前文(b1)所示的所述醇脱氢酶TbSADH的突变体为与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相比，存在或仅存在如下任一所示突变：A85G/I86A、A85G/I86A/W110A、S39T/A85G/I86A、A85G/I86A/G198D、A85G/I86A/W110A/G198D、A85G/I86A/L294A、A85G/I86A/C295A、△A85、△I86、△A85/△I86、△I86/W110A、△I86/L294A、△I86/C295A。

前文所述能够表达所述醇脱氢酶的核酸分子为所述醇脱氢酶的编码基因，具体可为如下任一：

(A)当所述醇脱氢酶为所述羰基还原酶SSCR时，所述醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.1或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

(B)当所述醇脱氢酶为所述羰基还原酶SSCR的突变体时，所述醇脱氢酶的编码基因的序列为如下(c1)-(c3)中任一：(c1)与SEQ ID No.1相比，存在或仅存在如下任一所示的突变：A734C、G735T、A734T、A724C/A734C、A724C/G735T、A724C/A734T和A724C；(c2)在(c1)所限定序列的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；(c3)与(c1)或(c2)所限定的序列相比保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

(C)当所述醇脱氢酶为所述醇脱氢酶TbSADH时，所述醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQ ID No.3或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

(D)当所述醇脱氢酶为所述醇脱氢酶TbSADH的突变体时，所述醇脱氢酶的编码基因的序列为如下(d1)-(d3)中任一：(d1)与SEQ ID No.3相比，存在或仅存在如下任一所示的突变：C254G/A256G/T257C/T258A、C254G/A256G/T257C/T258A/T328G/G329C/G330C、T115A/G117C/C254G/A256G/T257C/T258A、C254G/A256G/T257C/T258A/G593A/C594T、C254G/A256G/T257C/T258A/T328G/G329C/G330C/G593A/C594T、C254G/A256G/T257C/T258A/C880G/T881C/A882G、C254G/A256G/T257C/T258A/T883G/G884C/C885A、△G253/△C254/△T255、△A256/△T257/△T258、△G253/△C254/△T255/△A256/△T257/△T258、△A256/△T257/△T258/T328G/G329C/G330C、△A256/△T257/△T258/C880G/T881C/A882G、△A256/△T257/△T258/T883G/G884C/C885A；(d2)在(d1)所限定序列的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；(d3)与(d1)或(d2)所限定的序列相比保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列。

在本发明中，对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸，位置(即在SEQ IDNo.2或SEQ ID No.4中的位置)，取代氨基酸。相应地，在SEQ ID No.2的第245位用脯氨酸取代原有的谷氨酰胺命名为“Q245P”。对于碱基取代，使用下述命名法：原始碱基，位置(即在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中的位置)，取代碱基。相应的，在SEQ ID No.1的第734位用C取代原有的A命名为“A734C”。对于氨基酸删除，使用下述命名法：△，原始氨基酸，位置(即在SEQ ID No.4中的位置)。相应的，在SEQ ID No.4的第85位删除氨基酸A命名为“△A85”。对于碱基删除，使用下述命名法：△，原始碱基，位置(即在SEQ ID No.3中的位置)。相应的，在SEQ ID No.3的第253位删除碱基G命名为“△G253”。包含多重改变的变体由斜杠符号(“/”)分隔或用兼并密码子代替。

本发明还请求保护醇脱氢酶突变体或相关生物材料。

其中，所述醇脱氢酶突变体为前文所述的羰基还原酶SSCR的突变体或所述的醇脱氢酶TbSADH的突变体。所述相关生物材料为能够表达所述醇脱氢酶突变体的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

本发明采用来源于赭色掷孢酵母(Sporobolomyces Salmonicolor)的羰基还原酶SSCR或其突变体，或者来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶TbSADH或其突变体高效不对称还原催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，该方法具有产率高、ee值高、辅酶使用量少、不需额外添加如葡萄糖醇脱氢酶等用以辅因子循环的酶、反应条件温和、操作简单等优点。

附图说明

图1为羰基还原酶SSCR或醇脱氢酶TbSADH突变体催化还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇示意图。

图2为羰基还原酶SSCR或醇脱氢酶TbSADH突变体催化还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇反应的HPLC检测结果图谱。A：(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮标准品液相色谱结果；B：混旋(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇标准品液相色谱结果；C：阴性对照组反应液液相色谱结果；D：实验组(突变体催化)反应液液相色谱结果。图中的阴性对照是空载体质粒pET22b(+)催化的反应；突变体是SSCR或TbSADH最优蛋白突变体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、羰基还原酶SSCR及醇脱氢酶TbSADH基因或其突变体的工程菌的制备

一、羰基还原酶SSCR及醇脱氢酶TbSADH基因野生型基因工程菌株的制备

将来源于赭色掷孢酵母(Sporobolomyces Salmonicolor)的羰基还原酶SSCR基因和高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)醇脱氢酶TbSADH以大肠杆菌为宿主细胞进行密码子优化，优化后由Twist Bioscience(美国)或金斯瑞(南京)全基因合成，优化后序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3。

将两个目的基因分别通过NdeⅠ和HindⅢ酶切位点连入pET22b(+)质粒，得到重组载体。将重组载体pET22b-SSCR或pET22b-TbSADH电转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体平板中倒置培养12-16h，挑选阳性转化子进行菌落PCR及DNA测序验证，验证正确的转化子即为羰基还原酶SSCR及醇脱氢酶TbSADH基因野生型基因工程菌株。

二、羰基还原酶SSCR及醇脱氢酶TbSADH基因野生型基因突变体工程菌株的制备

表1突变体及所用引物序列

注：下划线代表突变位点。

(1)PCR体系及程序：

①第一轮PCR

PCR体系(50μL)，如表2所示。

表2第一轮PCR体系

注：针对各突变体所用引物具体序列如表1中所示。

PCR程序如表3所示。

表3第一轮PCR程序

②第二轮PCR

PCR体系(50μL)，如表4所示。

表4第二轮PCR体系

PCR程序如表5所示。

表5第二轮PCR程序

(2)PCR结束后，向各反应体系中加入DpnI酶2μL，37℃消化2小时，并取1μL电转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，放入37℃培养箱倒置培养12-16小时，待转化子长出，挑取转化子进行测序验证，测序验证正确的转化子即为羰基还原酶SSCR或醇脱氢酶TbSADH基因突变体工程菌株。

重组突变质粒上携带的SSCR突变基因可编码如下几种SSCR蛋白突变体：与SEQ IDNo.2所示的野生型SSCR蛋白的氨基酸序列相比，仅存在如下任一所示突变：Q245P、Q245H、Q245L、M242L/Q245P、M242L/Q245H、M242L/Q245L和M242L。对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸，位置(即在SEQ ID No.2中的位置)，取代氨基酸。相应地，在SEQ ID No.2的第245位用脯氨酸取代原有的谷氨酰胺命名为“Q245P”。包含多重改变的变体由斜杠符号(“/”)分隔。

重组突变质粒上携带的TbSADH突变基因可编码如下几种TbSADH蛋白突变体：为与SEQ ID No.4所示的野生型TbSADH蛋白的氨基酸序列相比，存在或仅存在如下任一所示突变：A85G/I86A、A85G/I86A/W110A、S39T/A85G/I86A、△A85、△I86、△A85/△I86、A85G/I86A/G198D、A85G/I86A/W110A/G198D、△I86/W110A、△I86/L294A、△I86/C295A、A85G/I86A/L294A、A85G/I86A/C295A。对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸，位置(即在SEQ ID No.4中的位置)，取代氨基酸。相应地，在SEQ ID No.4的第85位用甘氨酸取代原有的丙氨酸命名为“A85G”。对于氨基酸删除，使用下述命名法：△，原始氨基酸，位置(即在SEQID No.4中的位置)。相应的，在SEQ ID No.4的第85位删除氨基酸A命名为“△A85”。包含多重改变的变体由斜杠符号(“/”)分隔或用兼并密码子代替。

实施例2、羰基还原酶SSCR及醇脱氢酶TbSADH基因或其突变体的表达及粗酶粉的制备

挑取重组菌E.coli BL21(羰基还原酶SSCR或醇脱氢酶TbSADH基因或其突变体的重组质粒)转化子至含有50μg/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡过夜12-16小时，按照1％(体积百分含量)接种量分别接种到含50μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.7时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，20℃、220rpm诱导表达18h后，4℃、4000rpm离心10min收集菌体。将收集好的菌体用磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0)重悬待用。冰浴条件下超声破碎细胞。将超声破碎后的样品于4℃、12000rpm、离心10min后，取上清即为粗酶液。用真空干燥仪冷冻干燥后获得粗酶粉。

实施例3、羰基还原酶SSCR/醇脱氢酶TbSADH及其突变体催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇

羰基还原酶SSCR/醇脱氢酶TbSADH催化还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇示意图如图1所示。

测定羰基还原酶SSCR或醇脱氢酶TbSADH不对称还原前手性双芳基酮(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮的催化效果，其中底物浓度为10mmol/L，重组羰基还原酶SSCR或醇脱氢酶TbSADH的用量为10g/L(粗酶粉)，异丙醇用量为总体积10％，NAD(P)⁺用量为1mmol/L，磷酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L，pH 7.0。不对称还原反应的温度为30℃，反应24小时。

转化率及立体选择性分析方法如下：取500μL反应液，加入500μL乙酸乙酯，震荡1～2min，12000rpm离心2～5min，取上清到离心管中，加入无水硫酸钠，4℃过夜干燥，之后取上清到离心管中，待有机相自然挥发完全，加入500μL色谱级异丙醇，进行液相分析转化率和ee值，具体条件如：Chiralpak AD-H(5μm，250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烷：异丙醇(92:8，V/V)，流速0.7ml/min，柱温30℃，紫外检测波长220nm，进样量1μL。羰基还原酶SSCR或醇脱氢酶TbSADH突变体催化还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇反应的HPLC检测结果图谱参考图2。保留时间(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇为17.132min，(R)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇为21.833min。产物光学纯度通过对映体过量值(ee)来评价：ee＝(A_S-A_R)/(A_S+A_R)×100％；A_S：液相色谱分析获得的(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的峰面积值；A_R：液相色谱分析获得的(R)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的峰面积值。

检测结果如表6和表7所示。

表6羰基还原酶SSCR及其突变体不对称还原催化(4-氯苯基)(2-吡啶基)甲酮的转化率及立体选择性分析

SSCR及突变体	转化率(％)	ee(％)	构型
				WT	99.5	75.7	(S)
Q245P	99.8	98	(S)
				Q245H	99.5	78.5	(S)
Q245L	99.7	49	(S)
				M242L/Q245H	31.4	94	(S)
M242L/Q245L	7.8	66	(S)

注：表中WT代表野生型SSCR。

由表6可知，羰基还原酶SSCR其突变体不对称还原催化(4-氯苯基)(2-吡啶基)甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，转化率为7.8～99.8％，立体性选择性49％～98％。

表7醇脱氢酶TbSADH及其突变体不对称还原催化(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮的转化率及立体选择性分析

注：表中WT代表野生型TbSADH，“-”代表转化率过低ee值没有列出。

由表7可知，醇脱氢酶TbSADH突变体可以催化不对称还原(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇，转化率为0.7～99％，立体性选择性≥96％。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种手性双芳基醇化合物的合成方法

<130> GNCLN171970

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atggcgaaga tcgacaacgc ggtgctgccg gaaggtagcc tggtgctggt taccggtgcg 60

aacggtttcg tggcgagcca cgtggttgag cagctgctgg aacacggtta caaggttcgt 120

ggcaccgcgc gtagcgcgag caaactggcg aacctgcaaa agcgttggga cgcgaaatac 180

ccgggtcgtt ttgagaccgc ggtggttgaa gacatgctga agcagggcgc gtatgatgaa 240

gtgatcaagg gtgcggcggg cgttgcgcac attgcgagcg tggttagctt cagcaacaag 300

tatgatgagg tggttacccc ggcgatcggt ggcaccctga acgcgctgcg tgctgcggcg 360

gcgaccccga gcgtgaaacg ttttgttctg accagcagca ccgtgagcgc gctgatcccg 420

aagccgaacg ttgagggtat ttacctggat gagaagagct ggaacctgga gagcattgac 480

aaggcgaaaa ccctgccgga aagcgatccg caaaagagcc tgtgggtgta tgcggcgagc 540

aaaaccgagg cggaactggc ggcgtggaag ttcatggacg agaacaaacc gcactttacc 600

ctgaacgcgg ttctgccgaa ctacaccatc ggcaccattt tcgatccgga aacccagagc 660

ggtagcacca gcggctggat gatgagcctg tttaacggcg aggtgtctcc ggcgctggcg 720

ctgatgccgc cgcagtacta tgtgagcgcg gttgacatcg gtctgctgca cctgggttgc 780

ctggtgctgc cgcaaattga gcgtcgtcgt gtttacggca ccgcgggcac cttcgattgg 840

aacaccgttc tggcgacctt tcgtaagctg tatccgagca aaaccttccc ggcggacttt 900

ccggatcagg gtcaagacct gagcaagttc gataccgcgc cgagcctgga aattctgaaa 960

agcctgggtc gtccgggttg gcgtagcatc gaggaaagca ttaaagacct ggttggcagc 1020

gagaccgcgc actaa 1035

<210> 2

<211> 344

<212> PRT

<213> 赭色掷孢酵母（Sporobolomyces salmonicolor）

<400> 2

Met Ala Lys Ile Asp Asn Ala Val Leu Pro Glu Gly Ser Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Thr Gly Ala Asn Gly Phe Val Ala Ser His Val Val Glu Gln Leu

20 25 30

Leu Glu His Gly Tyr Lys Val Arg Gly Thr Ala Arg Ser Ala Ser Lys

35 40 45

Leu Ala Asn Leu Gln Lys Arg Trp Asp Ala Lys Tyr Pro Gly Arg Phe

50 55 60

Glu Thr Ala Val Val Glu Asp Met Leu Lys Gln Gly Ala Tyr Asp Glu

65 70 75 80

Val Ile Lys Gly Ala Ala Gly Val Ala His Ile Ala Ser Val Val Ser

85 90 95

Phe Ser Asn Lys Tyr Asp Glu Val Val Thr Pro Ala Ile Gly Gly Thr

100 105 110

Leu Asn Ala Leu Arg Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ser Val Lys Arg Phe

115 120 125

Val Leu Thr Ser Ser Thr Val Ser Ala Leu Ile Pro Lys Pro Asn Val

130 135 140

Glu Gly Ile Tyr Leu Asp Glu Lys Ser Trp Asn Leu Glu Ser Ile Asp

145 150 155 160

Lys Ala Lys Thr Leu Pro Glu Ser Asp Pro Gln Lys Ser Leu Trp Val

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Lys Thr Glu Ala Glu Leu Ala Ala Trp Lys Phe Met

180 185 190

Asp Glu Asn Lys Pro His Phe Thr Leu Asn Ala Val Leu Pro Asn Tyr

195 200 205

Thr Ile Gly Thr Ile Phe Asp Pro Glu Thr Gln Ser Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Trp Met Met Ser Leu Phe Asn Gly Glu Val Ser Pro Ala Leu Ala

225 230 235 240

Leu Met Pro Pro Gln Tyr Tyr Val Ser Ala Val Asp Ile Gly Leu Leu

245 250 255

His Leu Gly Cys Leu Val Leu Pro Gln Ile Glu Arg Arg Arg Val Tyr

260 265 270

Gly Thr Ala Gly Thr Phe Asp Trp Asn Thr Val Leu Ala Thr Phe Arg

275 280 285

Lys Leu Tyr Pro Ser Lys Thr Phe Pro Ala Asp Phe Pro Asp Gln Gly

290 295 300

Gln Asp Leu Ser Lys Phe Asp Thr Ala Pro Ser Leu Glu Ile Leu Lys

305 310 315 320

Ser Leu Gly Arg Pro Gly Trp Arg Ser Ile Glu Glu Ser Ile Lys Asp

325 330 335

Leu Val Gly Ser Glu Thr Ala His

340

<210> 3

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgaaaggtt ttgcaatgct cagtatcggt aaagttggct ggattgagaa ggaaaagcct 60

gctcctggcc catttgatgc tattgtaaga cctctagctg tggccccttg cacttcggac 120

attcataccg tttttgaagg cgccattggc gaaagacata acatgatact cggtcacgaa 180

gctgtaggtg aagtagttga agtaggtagt gaggtaaaag attttaaacc tggtgatcgc 240

gttgttgtgc cagctattac ccctgattgg cggacctctg aagtacaaag aggatatcac 300

cagcactccg gtggaatgct ggcaggctgg aaattttcga atgtaaaaga tggtgttttt 360

ggtgaatttt ttcatgtgaa tgatgctgat atgaatttag cacatctgcc taaagaaatt 420

ccattggaag ctgcagttat gattcccgat atgatgacca ctggttttca cggagctgaa 480

ctggcagata tagaattagg tgcgacggta gcagttttgg gtattggccc agtaggtctt 540

atggcagtcg ctggtgccaa attgcgtgga gccggaagaa ttattgccgt aggcagtaga 600

ccagtttgtg tagatgctgc aaaatactat ggagctactg atattgtaaa ctataaagat 660

ggtcctatcg aaagtcagat tatgaatcta actgaaggca aaggtgtcga tgctgccatc 720

atcgctggag gaaatgctga cattatggct acagcagtta agattgttaa acctggtggc 780

accatcgcta atgtaaatta ttttggcgaa ggagaggttt tgcctgttcc tcgtcttgaa 840

tggggttgcg gcatggctca taaaactata aaaggcgggc tatgccccgg tggacgtcta 900

agaatggaaa gactgattga ccttgttttt tataagcgtg tcgatccttc taagctcgtc 960

actcacgttt tccggggatt tgacaatatt gaaaaagcct ttatgttgat gaaagacaaa 1020

ccaaaagacc taatcaaacc tgttgtaata ttagcataa 1059

<210> 4

<211> 352

<212> PRT

<213> 高温厌氧杆菌（Thermoanaerobacter brockii）

<400> 4

Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu

1 5 10 15

Lys Glu Lys Pro Ala Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu

20 25 30

Ala Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala

35 40 45

Ile Gly Glu Arg His Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu

50 55 60

Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg

65 70 75 80

Val Val Val Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Ser Glu Val Gln

85 90 95

Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe

100 105 110

Ser Asn Val Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Phe Phe His Val Asn Asp

115 120 125

Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Ala

130 135 140

Ala Val Met Ile Pro Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly

165 170 175

Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly

180 185 190

Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys

195 200 205

Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Glu

210 215 220

Ser Gln Ile Met Asn Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile

225 230 235 240

Ile Ala Gly Gly Asn Ala Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val

245 250 255

Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Glu

260 265 270

Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys

275 280 285

Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg

290 295 300

Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val

305 310 315 320

Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Phe Met Leu

325 330 335

Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala

340 345 350

Claims

1.醇脱氢酶或其相关生物材料在合成手性双芳基醇化合物中的应用；

所述羰基还原酶SSCR的氨基酸序列为SEQ ID No.2；

所述醇脱氢酶TbSADH氨基酸序列为SEQ ID No.4；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述手性双芳基醇化合物为(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇；

和/或

所述羰基还原酶SSCR的突变体为如下任一：(a1)与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相比，在或仅在SEQ ID No.2的第242位和/或第245位存在突变；(a2)在(a1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述醇脱氢酶TbSADH的突变体为如下任一：(b1)与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相比，在或仅在SEQ ID No.4的第39位、第85位、第86位、第110位、第198位、第294位和/或第295位存在突变；(b2)在(b1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

3.一种(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的合成方法，包括如下步骤：以醇脱氢酶作为生物酶催化底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇；所述底物为(4-氯苯基)吡啶-2-甲酮；

所述羰基还原酶SSCR的氨基酸序列为SEQ ID No.2；

所述醇脱氢酶TbSADH氨基酸序列为SEQ ID No.4；

所述醇脱氢酶TbSADH的突变体为将位于所述醇脱氢酶TbSADH的催化中心口袋中的氨基酸残基和/或能够改变辅因子偏好性的氨基酸残基进行突变后得到；

进一步地，所述羰基还原酶SSCR的突变体为如下任一：(a1)与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相比，在或仅在SEQ ID No.2的第242位和/或第245位存在突变；(a2)在(a1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

进一步地，所述醇脱氢酶TbSADH的突变体为如下任一：(b1)与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相比，在或仅在SEQ ID No.4的第39位、第85位、第86位、第110位、第198位、第294位和/或第295位存在突变；(b2)在(b1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述方法中，所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用的；

进一步，所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述醇脱氢酶，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶；所述全细胞按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述醇脱氢酶，得到的重组细胞即为所述全细胞；

再进一步，所述重组细胞是按照包括如下步骤的方法制备获得的：向所述宿主细胞到导入能够表达所述醇脱氢酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述醇脱氢酶的所述重组细胞；

更进一步，所述“能够表达所述醇脱氢酶的核酸分子”是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的；所述重组载体为携带有所述醇脱氢酶的编码基因的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒；

和/或

所述宿主细胞为原核细胞或低等真核细胞；

具体的，所述原核细胞为细菌；所述低等真核细胞为酵母细胞；

更加具体的，所述细菌为大肠杆菌。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：在以所述醇脱氢酶作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应中，反应体系中除了含有所述底物和所述醇脱氢酶外，还含有异丙醇和所述醇脱氢酶的辅酶；

具体的，所述醇脱氢酶的辅酶为NADP⁺或NAD⁺；

和/或

以所述醇脱氢酶作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应是在浓度为0.001～0.1mol/L，pH 6～8的磷酸盐缓冲液中进行的；

和/或

在以所述醇脱氢酶作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应中，反应温度为20～35℃；

和/或

在以所述醇脱氢酶作为生物酶催化所述底物生成(S)-(4-氯苯基)吡啶-2-甲醇的反应中，反应时间为反应完全为准。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述底物在所述反应体系中浓度为1～10mmol/L；所述醇脱氢酶在所述反应体系中浓度为1～10g/L；所述异丙醇在所述反应体系中的体积百分含量为10％～30％；所述NADP⁺或所述NAD⁺在所述反应体系中的浓度为0.1～1.0mmol/L。

7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：(a1)所示的所述羰基还原酶SSCR的突变体为与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相比，存在或仅存在如下任一个或多个突变：Q245P、Q245H、Q245L、M242L；

(b1)所示的所述醇脱氢酶TbSADH的突变体为与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相比，存在或仅存在如下任一个或多个突变：S39T、A85G、I86A、W110A、G198D、L294A、C295A、△A85、△I86。

8.根据权利要求7所述的应用或方法，其特征在于：(a1)所示的所述羰基还原酶SSCR的突变体为与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列相比，存在或仅存在如下任一所示突变：Q245P、Q245H、Q245L、M242L/Q245P、M242L/Q245H、M242L/Q245L和M242L；

(b1)所示的所述醇脱氢酶TbSADH的突变体为与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相比，存在或仅存在如下任一所示突变：A85G/I86A、A85G/I86A/W110A、S39T/A85G/I86A、A85G/I86A/G198D、A85G/I86A/W110A/G198D、A85G/I86A/L294A、A85G/I86A/C295A、△A85、△I86、△A85/△I86、△I86/W110A、△I86/L294A、△I86/C295A。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述能够表达所述醇脱氢酶的核酸分子为所述醇脱氢酶的编码基因，为如下任一：

(A)当所述醇脱氢酶为所述羰基还原酶SSCR时，所述醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQID No.1或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；

(B)当所述醇脱氢酶为所述羰基还原酶SSCR的突变体时，所述醇脱氢酶的编码基因的序列为如下(c1)-(c3)中任一：(c1)与SEQ ID No.1相比，存在或仅存在如下任一所示的突变：A734C、G735T、A734T、A724C/A734C、A724C/G735T、A724C/A734T和A724C；(c2)在(c1)所限定序列的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；(c3)与(c1)或(c2)所限定的序列相比保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；

(C)当所述醇脱氢酶为所述醇脱氢酶TbSADH时，所述醇脱氢酶的编码基因的序列为SEQID No.3或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；

10.醇脱氢酶突变体或相关生物材料；

所述醇脱氢酶突变体为权利要求1-9任一中所述羰基还原酶SSCR的突变体或所述醇脱氢酶TbSADH的突变体；

所述相关生物材料为能够表达所述醇脱氢酶突变体的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。