CN102559520A - 一种利用微生物催化制备(s)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用微生物催化制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，属于生物催化技术领域。本发明利用克鲁维假丝酵母（Kluyveromycessp.）CCTCCM2011385全细胞不对称还原4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮，合成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，首先筛选出对潜手性酮底物具有高立体选择性羰基还原酶活性的微生物，然后确定不对称还原反应的一系列条件，如：反应温度、pH、细胞浓度、底物浓度、反应时间以及添加剂（包括：各种辅溶剂、PEG、磷酸盐等）的添加进行优化，产物(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的对映体过量值和产率分别可以达到86.7%e.e.和92.1%。利用硅胶柱层析法对产物进行了初步的分离提取，分离后产物的纯度为99.2％，提取收率为56.7％。
Description
技术领域
一种利用微生物全细胞催化不对称还原制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，即利用微生物全细胞不对称还原4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮合成倍他司汀类药物的重要手性中间体(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
倍他司汀类药物是一类具有高效低毒副作用特性的第二代抗组胺药物，可用于治疗过敏性鼻炎等变态反应疾病，具有作用迅速，选择性高，副作用低，疗效显著等优点。由于最近几十年间过敏性疾病的发病率呈快速上升趋势，在过敏性疾病治疗领域发挥重要作用的倍他司汀类药物的需求量不断增加。同为第2代抗组胺药，特非那定、阿司咪唑，能诱发心脏毒性反应，其次是氯雷他定、西替利嗪，倍他司汀则由于其高效低毒的特性而备受瞩目。
(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇（(S)-CPMA）是合成倍他司汀类药物的重要手性中间体，关于其合成方法的报道主要有：2003年，Chen C等人使用手性催化剂 trans-RuCl2[(R)-xylbinap][(R)-daipen]将 CPMK 不对称还原合成产物(S)-CPMA的e.e.值为60.6%；1996年，Corey EJ 等人使用儿茶酚硼烷（catecholborane）作为手性定位选择剂，BF3和BBr3作为还原剂，将(4-苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮[(4-phenyl)-(pyridin-2-yl)methaone] 进行不对称还原，产物(4-苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇 [(S)-(4-phenyl)-(pyridin-2-yl)methanol]的e.e.值和产率分别为30%和19%；2006年，Truppo MD等用酮还原酶（商品酶）对CPMK进行酶法不对称还原，产物(S)-CPMA光学纯度仅有60%。
由以上数据可以看出，化学还原制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇效果不佳，产率和e.e.值较低，并且操作过程复杂，一些手性催化剂会在反应过程中引入重金属元素，不利于在制药行业的应用。仅有的一篇生物法的报道，采用酮还原酶（商品酶）还原制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇反应的产率和e.e.也不理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微生物全细胞不对称还原制备(S)-(4-氯苯基) -(吡啶-2-基)-甲醇的方法。利用筛选获得的具有高对映体选择性的微生物菌株克鲁维假丝酵母（Kluyveromycessp.）CCTCC M 2011385进行不对称还原4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮的研究，为制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇提供了一条可行的途径。
本发明的技术方案：以含有立体选择性羰基还原酶活性的微生物全细胞为催化剂，在单一水相或双水相反应体系中对潜手性4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮进行不对称还原，制备具有高光学纯度的(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，步骤如下：
（1）微生物来源：从无锡长广溪湿地公园土壤样品中进行筛选，获得一株具有高立体选择性羰基还原酶活性的微生物菌株：克鲁维假丝酵母（Kluyveromyces sp.）JNU-KR1，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M 2011385。
（2）湿菌体的培养：培养基组成以g/L计为：葡萄糖5－50，酵母膏3－30，磷酸二氢钾 1－10，七水合硫酸镁 0.2－2，pH为4－9，发酵培养1－5天，发酵液过滤获得湿菌体；
（3）配置反应体系：以4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮为底物，用磷酸盐缓冲液配制成的单一水相反应体系，底物浓度为0.1-10 g/L，葡萄糖浓度10－100 g/L；或用不同分子量的PEG与不同无机盐溶液配制成的各种双水相反应体系，底物浓度为0.5－20 g/L，葡萄糖浓度10－100 g/L。
（4）酶转化反应：在反应体系中加入步骤（2）所述克鲁维假丝酵母（Kluyveromycessp.）CCTCC NO：M 2011385湿菌体50-250 g/L，于25-45 ℃进行酶反应，反应时间为3-72 h。
（5）转化液后处理：转化液用乙酸乙酯萃取转化液，将萃取获得的有机相蒸发回收溶剂，采用硅胶柱层析进一步分离纯化，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，获得无色油状液体产物(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇。
本发明方法所选用的反应体系为由0.1－0.5 mmol/L、pH6－8 磷酸盐缓冲液配制的单一水相体系，或由分子量为2000－20000的不同PEG 与各种无机盐（包括：KH2PO4、Na2HPO4、(NH4)2SO4 和Na2SO4等）配制的不同双水相反应体系。
本发明方法所选用的酶转化反应条件为：底物浓度为1－10 g/L，湿菌体浓度50－250 g/L，反应温度25－35 ℃，反应时间12－72 h。
本发明方法在PEG 4000 (20%, W/W) /Na2HPO4 (14%, W/W)双水相反应体系中，最终产物e.e.值和产率分别可以达到86.7%和92.1%。
萃取处理：用乙酸乙酯萃取转化液得到含有(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的有机相，用适量的无水硫酸镁干燥过夜使用0.22 μm孔径膜滤后进行液相色谱检测以测定反应的对映体过量值和产率。
转化反应产物经萃取、干燥和0.22 μm孔径膜滤后，采用液相色谱法测定产物产率及对映体过量值，具体条件如下：Daicel Chiralcel OB-H (5 μm，250 mm ×4.6 mm)液相色谱柱，流动相为正己烷：异丙醇(90: 10，V/V)，流速1 mL /min，柱温38 ℃，紫外检测波长254 nm，进样量10 μL，保留时间20 min。
产物光学纯度通过对映体过量值来评价。
e.e. = × 100 %
CS：液相色谱分析S-构型产物摩尔浓度；CR：液相色谱分析R-构型产物摩尔浓度；C底物：底物浓度。
本发明的有益效果：
本发明筛选获得了具有高立体选择性羰基还原酶活性的微生物菌株克鲁维假丝酵母（Kluyveromycessp.）CCTCC NO：M 2011385，在PEG 4000 (20%, W/W) /Na2HPO4 (14%, W/W)双水相反应体系中不对称还原6 g/L 的4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮底物，生成产物(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的e.e.值达到86.7%，产率达到92.1%。
本发明采用微生物全细胞不对称还原4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮相对于其它化学法具有以下优点：①生成的(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇对映体过量值高，6 g/L底物条件下，产率为92.1% ，e.e.达到86.7%；②副反应少，只需一步还原即可完成；③反应条件温和，对环境友好。
本发明用生物催化法对倍他司汀类药物的重要手性中间体(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇进行合成，通过细胞内羰基还原酶作用，可得到高光学纯度的(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，该反应具有对映选择性高，副反应少，合成路线短，反应条件温和产品安全等诸多优点，本发明为不对称制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇提供了一种可行的途径。
生物材料样品保藏：上述克鲁维假丝酵母（Kluyveromycessp.）JNU-KR1菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2011385，保藏日期2011年11月11日。
附图说明
图1分离纯化后的产物(S)-CPMA的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1 具有不对称还原4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮活性的微生物菌株的筛选
实验菌种来自江苏无锡长广溪湿地公园的4份土壤样品，通过使用富集培养基和筛选平板培养基可以分离得到若干对底物具有一定耐受性的微生物。实验使用底物(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮和其它试剂均为市售分析纯、化学纯或生化试剂。
实验使用的主要培养基包括：
富集培养基(I)：葡萄糖 50，酵母膏 20，磷酸二氢钾 4，七水合硫酸镁 1.5，调pH 6.0；将底物配成500 g/L的四氢呋喃溶液，每1 L培养基加入1 mL底物溶液。
筛选平板培养基(MSM)(Ⅱ)：硫酸铵0.2，磷酸二氢钾0.2，氯化钠 0.1，七水合硫酸镁 0.02，琼脂条 20。平板凝固后将1 ml的1 g/L无水乙醇溶解的底物溶液涂布于直径9 cm平板表面。
丰富平板培养基(Ⅲ)：葡萄糖25，酵母膏10，磷酸二氢钾4，七水合硫酸镁 1.5，琼脂条 20，调pH 6.0。平板凝固后将1 ml的0.5 g/L无水乙醇溶解的底物溶液涂布于直接9 cm的平板表面。
发酵培养基(Ⅳ)：葡萄糖50，酵母膏20，磷酸二氢钾4，七水合硫酸镁1.5，调pH 6.0。
筛选微生物菌株的具体步骤为：
将10 g土壤样品加入放有灭菌玻璃珠的50 mL无菌生理盐水，摇匀打散20 min，静置后取上清接种于培养基（I），培养12 h后，将发酵液梯度稀释并选取适当浓度涂布于平板培养基（Ⅱ）。3-5天后平板表面长出极小菌落，将其转接于平板培养基（Ⅲ），24 h后可生长成直径约2-3 mm菌落。 使用50 mL离心管加入15 mL培养基（Ⅳ），将平板培养基（Ⅲ）上全部菌落接种并在30 ℃，转速180 r/m条件下发酵培养48 h。之后在2420 g离心6 min收集菌体，将细胞用生理盐水洗涤两次后可进行生物转化反应。具体方法为：将细胞悬浮于含有5% 葡萄糖 和3.5 g/L CPMK的 0.2 M PBS (pH 6.5)溶液，在30℃，200 rpm条件下反应24 h。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液并进行硅胶板薄层层析（TLC）检测，分散剂为正己烷/ 异丙醇（9/1, V/V）。通过TLC检测挑选出具有转化CPMK能力的菌株，然后对这些菌株的转化能力进行高效液相色谱（HPLC）检测，并计算反应的e.e.值和产率以确定适合的菌株，结果如表1。
表1. 具有不对称还原(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮活性的菌株的筛选
| 菌株编号 | Yield (%) | e.e. (%) |
| 1 | 23.1 | 78.8 |
| 2 | 5.00 | 74.5 |
| 3 | 10.3 | 73.9 |
| 4 | 59.0 | 72.3 |
| 5 | 77.8 | 71.1 |
| 6 | 57.12 | 71.0 |
| 7 | 24.2 | 68.2 |
| 8 | 63.3 | 67.7 |
| 9 | 33.2 | 64.4 |
| 10 | 19.1 | 63.3 |
| 11 | 3.04 | -42.1 |
| 12 | 7.00 | -48.5 |
| 13 | 4.90 | -51.0 |
| 14 | 2.56 | -51.7 |
| 15 | 1.87 | -62.5 |
实施例2水相反应体系中pH对CPMK不对称还原反应的影响
将1 g湿细胞分别悬浮于含有5% (W/V) 葡萄糖和2 g/L CPMK的不同缓冲溶液中（包括：0.2 M 醋酸纳缓冲液（pH 4.5-5），磷酸钾缓冲液 (pH 6.0-7.5)，Tris-HCl缓冲液（pH 8.0-8.5）），并定容至10 mL，在30℃反应36 h后，进行HPLC检测并计算反应e.e.值和产率，结果如表2所示。
表2水相反应体系中pH对CPMK不对称还原反应的影响
| pH | Yield (%) | e.e.(%) |
| 4.5 | 12.5 | 78.9 |
| 5.0 | 12.5 | 72.6 |
| 5.5 | 17.0 | 71.1 |
| 6.0 | 68.1 | 70.9 |
| 6.5 | 76.9 | 70.9 |
| 7.0 | 81.3 | 74.6 |
| 7.5 | 79.7 | 71.4 |
| 8.0 | 76.7 | 66.1 |
| 8.5 | 47.2 | 66.4 |
从表2中可以看出，反应体系的pH值对细胞内羰基还原酶的活性有显著的影响，细胞在pH 6.0–8.0范围内保持了较高的活性。在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中进行转化反应，产物可达到最高的产率和e.e.值，分别为81.3%和74.6% e.e.。
实施例3转化反应温度对CPMK不对称还原反应的影响
将1 g湿细胞悬浮于含有5% (W/ V) 葡萄糖，2 g/L CPMK的 0.2 M PBS (pH 7.0)并定容至10 mL，分别在20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃，45 ℃下反应36 h后进行HPLC检测并计算反应e.e.值和产率，结果如表3所示。
表3 水相反应体系中温度对CPMK不对称还原反应的影响
| 温度(℃) | Yield (%) | e.e.(%) |
| 25 | 75.4 | 78.2 |
| 30 | 79.2 | 78.2 |
| 35 | 3.79 | -13.2 |
| 40 | 2.34 | -22.4 |
| 45 | 0.923 | -22.1 |
由表3可以看出在25 ℃ 到 30 ℃温度范围内，e.e值 (78.2%-78.3%) 和产率 (75.4%-79.2%) 都较为稳定，而当温度上升至35 ℃时，e.e值.和产率急速下降，分别降低至-13.2%和3.79%，这说明反应温度以30 ℃左右为宜。
实施例4菌体浓度对CPMK不对称还原反应的影响
分别将0.5 g，1 g，1.5 g，2 g，2.5 g的湿细胞悬浮于含有5% (W/ V) 葡萄糖，2 g/L CPMK的 0.2 M PBS (pH 7.0)并定容至10 mL，此时反应体系菌体浓度分别为50 g/ L，100 g/ L，150 g/ L，200 g/ L，250 g/ L，在30℃下反应36 h后，进行HPLC检测并计算反应e.e.值和产率，结果如表4所示。
表4 菌体浓度对不对称还原CPMK反应的影响
| 菌体浓度(g/L) | Yield (%) | e.e.(%) |
| 50 | 24.3 | 83.19 |
| 100 | 80.6 | 80.7 |
| 150 | 61.6 | 80.0 |
| 200 | 27.7 | 66.0 |
| 250 | 27.5 | 55.5 |
由表4可以看出，当菌体浓度由50 g/L增加至100 g/L时反应产率迅速上升，由24.3%上升至80.6%，此时e.e.值略有降低（由83.2%下降至80.7%）；然而当菌体浓度由100 g/L增加至250 g/L时，产物的产率和e.e.值却均出现明显的下降，分别降低至27.5%和55.5%。以上结果表明还原反应体系中最佳菌体浓度以100 g/ L为宜。
实施例5反应体系中添加剂对CPMK不对称还原反应的影响
在反应体系中加入以下试剂：包括异辛烷，壬烷，十二烷，叔丁醇，甘油，异丙醇，乙醇，石油醚，油酸，（添加剂/反应液体积=1/ 5, V/V）等有机溶剂，以及PEG 4000，PEG 6000（添加量=30% , W/W）。将1 g 湿细胞悬浮于含有5 % (W/V) 葡萄糖，2 g/L CPMK的以上反应体系中并定容至10 mL，在30 ℃下反应48 h后，进行HPLC检测并计算反应的e.e.值和产率，结果如表5所示。
表 5反应体系中不同添加剂对不对称还原CPMK反应的影响
| log P | e.e. | Yield | |
| 对照 | 78.3 | 79.2 | |
| 环己烷 | 3.2 | -5.4 | 0.35 |
| 异辛烷 | 4.5 | 5.1 | 3.25 |
| 庚烷 | 4.0 | -13.1 | 1.50 |
| 壬烷 | 5.1 | 7.2 | 5.10 |
| 十二烷 | 6.6 | 19.8 | 8.05 |
| 叔丁醇 | 0.8 | 36.2 | 5.68 |
| 丙三醇 | ＞5.0 | 60.8 | 69.2 |
| 异丙醇 | 0.28 | 13.7 | 3.26 |
| 乙醇 | 0.85 | 16.9 | 1.41 |
| 油酸 | ＞6.0 | 10.14 | 16.12 |
| PEG4000/ K2HPO4 | 79.5 | 67.2 | |
| PEG6000/ K2HPO4 | 70.6 | 48.3 |
由表5可以看出除了添加甘油和分子量分别为4000和6000的PEG实验组与对照相比产率接近，其他溶剂的添加都对转化反应产生了负面作用，反应的产率和e.e值均出现了大幅度的下降。通过对添加甘油和PEG的实验组进行重复实验发现，在添加甘油的反应中，产物的产率和e.e.值均低于水相对照组，而添加PEG实验组的产物e.e.值比单一水相高，以上结果说明PEG是适宜的添加剂。
实施例6不对称还原CPMK反应的双水相反应体系的筛选
双水相反应体系由分子量从2000至20000的PEG同Na2SO4，(NH4)2SO4， Na2HPO4， NaH2PO4， MgSO4 无机盐组成，在所形成的不同双水相溶液中分别加入2 g 湿细胞，5%葡萄糖和2 g/L CPMK并定容至20 mL，在30 ℃，200 r/m 条件下反应48 h后进行HPLC检测，结果如表2所示。
表 6 不对称还原CPMK反应的双水相反应体系的筛选
由表6可以看出，在PEG4000 (20%, W/W)/Na2HPO4 (16%，W/W)组成的双水相反应体系中的转化反应具有最高的产物e.e.值和产率，分别为87.3%和93.6%。分别采用乙酸乙酯萃取上相（PEG溶液）和下相（Na2HPO4溶液）并计算分配系数，可以发现产物分配系数K在不同的双水相体系中相差不大，其数值在5.93到6.85之间。
实施例7 PEG 4000加量对不对称还原CPMK反应体系的影响
将2 g 湿细胞，5 % (W/V) 葡萄糖和5 g/L of CPMK 悬浮于不同的PEG 4000/Na2HPO4双水相溶液中，其中Na2HPO4含量为12%（W/V），PEG 4000含量分别为14%，16%，18%，20%，22%（W/V）并定容至20 mL,。在30℃反应48 h后，进行HPLC检测并计算反应产物的e.e.值和产率，结果如表7所示。
表7 PEG 4000质量分数对不对称还原CPMK反应的影响
| PEG 4000含量(%, W/W) | Yield (%) | e.e.(%) |
| 14 | 92.5 | 87.2 |
| 16 | 91.2 | 86.7 |
| 18 | 92.3 | 87.8 |
| 20 | 93.2 | 87.3 |
| 22 | 93.4 | 86.4 |
如表7，确定双水相体系中Na2HPO4质量分数为12%（W/V），当PEG 4000的质量分数由14%增加至22%时，反应的e.e.值和产率无明显变化，其数值分别在92%和86%左右。由于产物主要富集于PEG 4000溶液中，最终选用双水相体系中PEG 4000的质量分数以20%为宜。
实施例8 Na2HPO4含量对不对称还原CPMK反应体系的影响
将2 g 湿细胞，5 % (W/V) 葡萄糖和5 g/L of CPMK 悬浮于不同的PEG 4000/Na2HPO4双水相溶液中，其中PEG 4000含量为20%（W/V），Na2HPO4含量分别为10%，12%，14%，16%，18%（W/V）并定容至20 mL。在30℃反应48 h后，进行HPLC检测并计算反应产物的e.e.值和产率，结果如表8所示。
表8 Na2HPO4质量分数对不对称还原CPMK反应的影响
| Na2HPO4含量(%, W/W) | Yield (%) | e.e.(%) |
| 10 | 90.4 | 85.3 |
| 12 | 90.8 | 86.4 |
| 14 | 91.0 | 86.7 |
| 16 | 88.5 | 85.7 |
| 18 | 89.2 | 85.2 |
当Na2HPO4 质量分数由10%增加至14%时，反应的产率和e.e.值均略有增加；然而当Na2HPO4 质量分数大于14%时，产率和e.e.都开始下降。以上结果表明，双水相反应体系的Na2HPO4 质量分数以14%为宜。
实施例9底物浓度对双水相反应体系中不对称还原CPMK反应的影响
将2 g湿细胞悬浮于含有5% (W/V) 葡萄糖的PEG 4000 (20%，W/W )/Na2HPO4 (14%，W/W)双水相反应体系，分别加入40 mg，80 mg，120 mg，160 mg，200 mg底物并定容至20 mL，此时反应体系中底物浓度分别为2 g/ L，4 g/ L，6 g/ L，8 g/ L，10 g/ L。在30 ℃条件下反应48 h后，进行HPLC检测并计算反应产物的e.e.值和产率，结果如表9所示。
表9底物浓度对双水相反应体系中不对称还原CPMK反应的影响
| 底物浓度(g/L) | Yield (%) | e.e.(%) |
| 2 | 93.2 | 87.7 |
| 4 | 94.3 | 87.2 |
| 6 | 90.2 | 86.5 |
| 8 | 67.6 | 80.8 |
| 10 | 23.5 | 79.2 |
从表9可以看出当底物浓度高于6 g/L时，反应产率迅速下降；当底物浓度为10 g/L，反应的产率只有23.5%。与此同时随着底物浓度的增加反应的e.e.值也从86.5%下降至79.2%。因此，对于PEG 4000 (20%，W/W )/Na2HPO4 (14%，W/W)组成的双水相反应体系，6 g/L为较适宜的底物浓度。
实施例10 CPMK不对称还原反应最适底物浓度的确定
将2 g湿细胞分别悬浮于含有6 g/L CPMK，5% (W/V) 葡萄糖的 0.2 M PBS (pH 7.0)和PEG 4000 (20%，W/W )/Na2HPO4 (14%，W/W)并定容至20 mL，在30 ℃反应，分别在反应进行1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h，72 h时取样并进行HPLC检测，计算反应产物的e.e.值和产率，结果如表10所示。
表10双水相及水相反应体系中不对称还原CPMK的反应时间进程比较
从表10可以看出，在双水相体系中进行的不对称还原反应的速度远大于水相，水相反应12 h时的产率仅有13.6%，且在之后的时间内基本没有增加；而双水相体系反应在前24 h内产率几乎呈线性增加，当反应进行至48 h产率达到最大值92.1%。这说明了双水相体系能够有效地缓解底物抑制作用，同时与水相反应 (77.4% e.e.)相比，双水相反应体系产物的e.e.值可以达到86.7%，此时产物在两相的分配系数K=6.57，反应时间为48 h较为适宜。
实施例11产物(S)-CPMA的分离纯化及鉴定
在100 mL含有3%葡萄糖双水相反应体系中加入1 g CPMK及10 g湿细胞并在30℃、200 r/m条件下反应48 h，收集反应液，用等体积乙酸乙酯萃取3次后通过减压蒸馏除去溶剂乙酸乙酯，采用硅胶柱层析进行分离纯化，使用乙酸乙酯/石油醚(1/6)作为洗脱剂可以将底物洗脱分离，经手性HPLC分析，通过硅胶柱分离纯化可以得到86.7% e.e.的(S)-CPMA约566 mg，纯度99.2%。
Claims (5)
1.一株具有高立体选择性羰基还原酶活性的微生物菌株，其分类命名为克鲁维假丝酵母（Kluyveromyces sp.）JNU-KR1，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M 2011385。
2.用微生物CCTCC NO：M 2011385不对称氧化还原制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇简写(S)-CPMA，其特征是以CCTCC NO：M 2011385全细胞为催化剂，在单一水相或双水相反应体系中对潜手性4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮CPMK进行不对称还原，制备具有高光学纯度的(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，步骤如下：
（1）湿菌体的培养：培养基组成以g/L计为：葡萄糖5－50，酵母膏3－30，磷酸二氢钾 1－10，七水合硫酸镁 0.2－2，pH4－9，发酵培养1－5天，发酵液过滤获得湿菌体；
（2）配置反应体系：以4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮为底物，用磷酸盐缓冲液配制成的单一水相反应体系，底物浓度为0.1-10 g/L，葡萄糖浓度10－100 g/L；或用不同分子量的PEG与不同无机盐溶液配制成的各种双水相反应体系，底物浓度为0.5－20 g/L，葡萄糖浓度10－100 g/L；
（3）酶转化反应：在反应体系中加入CCTCC NO：M 2011385湿菌体50-250 g/L，于25-45 ℃进行酶反应，反应时间为3-72 h；
（4）转化液后处理：用乙酸乙酯萃取转化液，将萃取获得的有机相蒸发回收溶剂，采用硅胶柱层析进一步分离纯化，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，获得无色油状液体产物(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于反应体系为由0.1－0.5 mmol/L、pH6－8 磷酸盐缓冲液配制的单一水相体系，或由分子量为2000－20000的不同PEG 与KH2PO4、Na2HPO4、(NH4)2SO4 或Na2SO4各种无机盐配制的不同双水相反应体系。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于酶转化反应条件为：底物浓度为1－10 g/L，湿菌体浓度50－250 g/L，反应温度25-35 ℃，反应时间12－72 h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在质量浓度20% PEG 4000 /质量浓度14% Na2HPO4双水相反应体系中，最终产物e.e.值达到85%，产率达到92%。
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