CN102154385B

CN102154385B - 一种以多乙烯多胺控制pH值，发酵制备1,3-丙二醇的方法

Info

Publication number: CN102154385B
Application number: CN 201110044504
Authority: CN
Inventors: 邵千飞; 汪德林; 张墩民; 任俊虎; 黄绪民
Original assignee: ANHUI LIXING CHEMICAL CO LTD
Current assignee: Anhui Lixing New Material Co ltd
Priority date: 2011-02-23
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2031-02-23
Also published as: CN102154385A

Abstract

本发明公开了一种以多乙烯多胺控制pH，发酵制备1,3-丙二醇的方法，将克雷伯杆菌接种到种子培养液中，在一定的条件下进行种子培养，将培养好的种子培养液接种到装有发酵液的发酵罐里，发酵液装载量为50-85%，在一定的条件下进行发酵培养，生成1、3-丙二醇，发酵过程中以流加多乙烯多胺水溶液来调节发酵液的pH值，生成的副产物有机盐用纳滤膜截留除去。本发明方法可显著提高1,3-丙二醇的生产强度、转化率和在最终发酵液中的浓度；同时，在脱盐步骤中，除盐工艺操作简单，提取时1,3-丙二醇的损失少，得率高，生产费用低；上述工艺，可以明显降低1,3-丙二醇的生产成本，易于工业化生产。

Description

一种以多乙烯多胺控制pH值,发酵制备1,3-丙二醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及到一种以多乙烯多胺控制pH发酵生产1，3-丙二醇的方法及其多乙烯多胺有机盐的分离方法。

背景技术

1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为合成聚对苯二甲酸丙二醇酯的重要单体，以及合成杂环、药物等的中间体，还可作为溶剂用于油墨、印染、涂料、药物、润滑剂、抗冻剂等。

目前，规模工业化生产1，3-丙二醇的方法为化学合成法，主要的生产厂家为Dupont和Shell两家跨国公司，分别以环氧乙烷或丙烯醛为原料生产1，3-丙二醇，用于合成PTT纤维。然而，化学合成的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资大，原料为不可再生资源，且使用的原料如环氧乙烷或丙烯醛等具有一定的危险性。另外，1，3-丙二醇还可以经淀粉、葡萄糖或甘油等生物发酵法得到，生物发酵法具有选择性高，操作条件温和等特点，使用的原料为淀粉、葡萄糖或甘油等可再生资源。近年来，随着石油、煤、天然气等石化资源的日趋紧缺以及地球环境的日益恶化，以生物质工程技术为核心的绿色合成技术和生态材料的发展日益受到人们的重视，因此，用生物发酵法合成1，3-丙二醇是大势所趋。

在用甘油发酵生产1，3-丙二醇的过程中，甘油作为唯一碳源和能源沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，能将甘油转化为1，3-丙二醇的微生物主要包括克雷伯杆菌属、柠檬菌属及梭状芽孢杆菌属等。在甘油转化为1，3-丙二醇的厌氧发酵途径中，甘油除一部分形成生物量外，其余沿着氧化和还原两条平行路径代谢。在氧化途径中，甘油在依赖于NAD的甘油脱氢酶(GDH)的作用下形成二羟基丙酮(DHA)，磷酸化后进入糖酵解途径，为微生物生长提供ATP和NADH。在还原途径中，甘油在以维生素B₁₂为辅酶的甘油脱水酶(GDHt)的作用下生成3-羟基丙醛(3-HPA)，然后在依赖于NADH的1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的作用下形成产物1，3-PDO。在1，3-PDO的形成过程中，GDH、GDHt和PDOR是关键酶，它们的活力与1，3-PDO的产率密切相关。另一部分被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸，而乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸。在发酵甘油生产1，3-丙二醇的过程中，乳酸和乙酸是两种最主要的酸性副产物，它们的形成不但消耗有效的碳源，使得甘油转化率降低，更由于它们在发酵液中的积累，使发酵液pH值降低，会对细胞的正常生理代谢形成毒害作用，因此在发酵过程中必需不断的流加碱液以维持发酵液的pH在一定范围内。

传统发酵用氢氧化钾或氢氧化钠控制pH(王剑锋，刘海军，修志龙等.1，3丙二醇间歇发酵培养基的优化[J].食品与发酵工业，2001，27(8)：5～8)，形成的有机钾盐或钠盐，但是一定浓度的有机钾盐或钠盐也会抑制了菌体生长和相关酶的活性，当发酵体系中1，3-丙二醇和有机盐到一定浓度时，会严重降低发酵速度和1，3-丙二醇的产出，使发酵不能正常进行，只能停止发酵，这样会使发酵周期长、生产强度低、甘油转化率低、并且发酵液中1，3-丙二醇浓度低，提取费用增大。

目前用于1，3-丙二醇发酵液脱盐的方法有电渗析法、和离子交换树脂交换法等几种，电渗析法可以用于小分子物质的脱盐，但是发酵液中1，3-丙二醇的回收率不高(一般为85％左右)，能源消耗大；采用离子交换树脂交换法脱盐，可以将钾、钠离子交换吸附到树脂上，但是会使有机酸残留在处理液中，在后续分离时会产生副反应，影响1，3-丙二醇的收率和色泽，同时树脂再生时会产生较大量的废水，治理时产生一定的费用。(唐宇，龚燕，王晓林等.1，3丙二醇发酵液电渗析脱盐的中试研究[J].化工进展，2004，23(1)：84～87，D.M.阿克森，A.W.阿尔索普，T.T.阿姆斯等生物生产1，3丙二醇的存化CN1816629A).

为了解决上述的问题，本发明在甘油发酵生产1，3-丙二醇过程中以多乙烯多胺来控制发酵液的pH值，形成分子量较大的多乙烯多胺乳酸盐或醋酸盐等，已减少副产物有机盐对发酵的抑制作用，使得甘油发酵速度快，生产强度高，最终发酵液中1，3-丙二醇浓度高；同时，由于生成的多乙烯多胺乳酸盐或醋酸盐等分子量较大，其分子尺寸也比相应的钠盐或钾盐相应增大，可以以纳滤膜过滤，使多乙烯多胺乳酸盐或醋酸盐等与发酵液其他小分子成份(如水、1，3-丙二醇和乙醇等)分离，使分离简单，大大降低了生产成本。

发明内容

本发明的目的有两个：其一，在以甘油为主要原料经发酵法生产1，3-丙二醇过程中，采用流加一种有机碱来中和发酵时产生的副产物乳酸或乙酸，控制发酵液的pH值，生成的有机碱乳酸盐或醋酸盐对甘油发酵生产1，3-丙二醇的过程影响较小，保持一定的发酵速率和生产强度；其二，与用氢氧化钠(钾)控制pH值时产生的乳酸钠(钾)、醋酸钠(钾)相比，这种生成的有机碱乳酸盐或醋酸盐具有较高的分子量，不能通过一定尺寸的纳滤膜，可以用纳滤膜将其从发酵液中分离，使1，3-丙二醇分离提取简单，降低生产成本。

为实现上述目的本发明采用如下技术方案：

一种以多乙烯多胺控制pH，甘油发酵制备1，3-丙二醇的方法，其特征在于：在1，3-丙二醇的生产中过程中通过流加多乙烯多胺水溶液来调节发酵液的pH值，并且在发酵结束后，用纳滤膜除去多乙烯多胺有机酸盐，其具体工艺过程如下：

(1)种子制备：取克雷伯杆菌接入种子培养基中，在温度30～40℃，搅拌速率80～110rpm条件下培养8～15h，转入二代培养基中，在pH为7.5～9.0，温度30～40℃的条件下，培养5～12h，制备二级种子，备用；

(2)发酵培养：将发酵液装入发酵罐内，装载量为50-85％，将步骤(1)制备的二级种子接入其中，接种量为2～20％，然后通入氮气或者空气，通气量为0.1～0.5vvm，在发酵液的初始pH值7.5～9.0，温度30～40℃，搅拌速率80～110rpm条件下进行发酵，制备1，3-丙二醇，发酵过程中通过流加多乙烯多胺水溶液来控制发酵液的pH值为6～8，待甘油降至一定浓度时补加甘油，待不产酸时停止发酵；

(3)多乙烯多胺有机酸盐脱除：

a、在发酵完成后，用常规过滤法将菌体与发酵液分离，得到透明的水溶液；

b、将上述透明的水溶液用一定孔径的纳滤膜过滤；

c、当收集的过滤液达到母液的80％左右时，开始向纳滤膜内缓缓添加蒸馏水，蒸馏水的添加量为母液的20％左右，得到高纯度1，3-丙二醇的水溶液，

其中，种子培养基：在1000ml蒸馏水中，加入酵母膏1.5-2.5g、MgSO4·7H₂O0.15-0.25g、柠檬酸0.40-0.44g、KH₂PO4 2.5-3.5g，NH₄Cl 1.5-2.5g、CaCl₂ 0.08-0.12g、甘油28-32g、无机离子溶液1.5-2.5ml进行混合作为种子培养基；

发酵培养基：在1000ml蒸馏水中，加入酵母膏0.5-1.5g、MgSO₄·7H₂O0.15-0.25g、柠檬酸0.40-0.44g、KH₂PO₄ 0.5-1.5g、NH₄Cl 5.3-5.5g、CaCl₂0.08-0.12g、甘油38-42g、无机离子溶液1.5-2.5ml、MnCl₂ 0.01-0.012g混合制得发酵培养基；

无机离子溶液为：在1000ml蒸馏水中，加入以下物质配制而成：ZnCl₂0.65-0.70g、MnCl₂ 10.10-10.20g、H₃BO₃ 0.05-0.07g、CuCl₂ 0.45-0.50g、FeCl₃ 5.2-5.6g、CoCl₂ 11-15g、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.23-0.27g、3mol/LH₂SO₄ 18-22ml。

所述的以多乙烯多胺控制pH，发酵制备1，3-丙二醇的方法，其特征在于，多乙烯多胺具有如下的结构式：

其中R¹、R²和R³可以分别为H、或CH₃，n＝1，2，3，4；所述的多乙烯多胺水溶液的浓度范围为20～95％。

所述的以多乙烯多胺控制pH，发酵制备1，3-丙二醇的方法，其特征在于：步骤(3)所述的一定孔径的纳滤膜为可截留分子量在150～500之间的纳滤膜。

所述的以多乙烯多胺控制pH，发酵制备1，3-丙二醇的方法，其特征在于：步骤(3)所述的纳滤膜的材料选自纤维素衍生物类、聚砜类、聚酰胺类、聚酰亚胺类、聚酯类、聚烯烃类、含氟聚合物中的一种。

本发明实施的效果：在以甘油为底物发酵制备1，3-丙二醇工艺中，发酵时以多乙烯多胺控制发酵液的pH值，降低了副产物对菌体细胞合成1，3-丙二醇影响，减少了副产物的抑制效应，同时消除了传统发酵高浓度阳离子抑制作用，显著提高了1，3-丙二醇的制备强度、转化率和在最终发酵液中的浓度，制备强度提高了5～50％，最终发酵液中1，3-丙二醇浓度提高了10-70％，甘油转化率提高了10-40％。同时，以多乙烯多胺控制发酵液的pH值时，所产生的多乙烯多胺乳酸盐、多乙烯多胺醋酸盐等的分子量较大，可以用纳滤膜截留而同发酵液其他成份(1，3-丙二醇、水、乙醇等)分离，除盐率达95～100％，保证了1，3-丙二醇的提取收率，通过这一步骤后，1，3-丙二醇的收率大于98％。

本发明的优点在于：发酵时以多乙烯多胺控制发酵液的pH值，降低了副产物有机盐对菌体细胞合成1，3-丙二醇影响和抑制效应，可显著提高1，3-丙二醇的制备强度、转化率和在最终发酵液中的浓度；同时，在脱盐步骤中，除盐工艺操作简单，提取时1，3-丙二醇的损失少，得率高，制备费用低；上述工艺，可以明显降低1，3-丙二醇的制备成本，易于工业化制备。

具体实施方式

菌种：克雷伯杆菌(klebsiella pneumoniae)

种子培养基：酵母膏2g/L，MgSO₄·7H₂0 0.2g/L，柠檬酸0.42g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NH₄Cl 2g/L，CaCl₂ 0.1g/L，甘油30g/L，无机离子2ml/L。

发酵培养基：酵母膏1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，柠檬酸0.42g/L，KH₂PO₄1g/L，NH₄Cl 5.4g/L，CaCl₂ 0.1g/L，甘油40g/L，无机离子2ml/L，MnCl₂0.01g/L。

无机离子：ZnCl₂ 0.68g/L，MnCl₂ 10.17g/L，H₃BO₃ 0.06g/L，CuCl₂ 0.47g/L，FeCl₃ 5.4g/L，CoCl₂ 13g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.25g/L，3mol/L H₂SO₄20ml。

种子制备：取1，3-丙二醇菌种接入种子培养基中，30～40℃，80～110rpm培养8～15h，转入二代培养基中，pH7.5～9.0，30～40℃培养5～12h，制备二级种子备用。

发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为50-85％，初始甘油为40g/L，通入氮气或者空气，通气量为0.1～0.5vvm，接种量为2～20％的二级种子接入其中，温度30～40℃，80～150rpm培养，发酵中以多乙烯多胺控制pH6～8，待甘油降至一定浓度时补加甘油。

pH控制：在于发酵制备中流加多乙烯多胺系列溶液控制发酵pH在设定范围，如二乙烯三胺(DETA)、三乙烯四胺(TETA)和四乙烯五胺(TEPA)等，浓度范围20～95％。

脱盐工序：经过发酵、除菌体后，选用纳滤膜截留分子量150～500之间的有机物盐(多乙烯多胺盐)，当流出的过滤液达到母液的80％左右时，开始缓缓添加蒸馏水，蒸馏水的添加量为母液的20％左右，最终使1，3-丙二醇的回收率＞98％。

下面通过具体实例进一步对本专利进行说明：

实例一：

种子制备：取1，3-丙二醇菌种克雷伯杆菌接入种子培养基中，在30～40℃，搅拌速度80～110rpm条件下培养8～15h，然后转入二代培养基中，条件为pH7.5～9.0，温度30～40℃培养5～12h，制备二级种子备用。

发酵培养：以工业甘油为碳源，装载量为80％，初始甘油为40g/L，通入氮气，通气量为0.1～0.5vvm，接种量为10％的二级种子接入其中，发酵温度30～40℃，搅拌转速80～110rpm进行发酵培养，待甘油降至一定浓度时补加甘油，流加浓度为50％的四乙烯五胺水溶液控制发酵液为pH6.8，待不产酸时停止发酵，最终液相色谱分析，色谱柱为Carbohydrate柱，流动相为0.005mol/L H₂SO₄，流速为0.5ml/min，柱温室温、进样量20μl。检测器为Beckman 126型折光光示差检测器。测定发酵液中1，3-丙二醇浓度85g/L、乳酸浓度8g/L、乙酸浓度6g/L、乙醇浓度5g/L，制备强度3.2g/L.h和甘油对1，3-丙二醇的摩尔转化率75％。

比较例一：

种子制备：同实例一。

发酵培养：其余同实例一，用40％氢氧化钠水溶液代替四乙烯五胺水溶液来控制pH6.8，待不产酸时停止发酵，最终液相色谱分析，色谱柱为Carbohydrate柱，流动相为0.005mol/L H₂SO₄，流速为0.5ml/min，柱温室温、进样量20μl。检测器为Beckman 126型折光光示差检测器。最终液相色谱分析测定发酵液中1，3-丙二醇浓度60g/L、乳酸浓度12g/L、乙酸浓度10g/L、乙醇浓度12g/L，制备强度1.9g/L.h和摩尔转化率50％。

实例二～四：

其他同实例一，分别用浓度为60％二乙烯三胺、70％三乙烯四胺或50％n，n’，n”-三甲基二乙烯三胺水溶液代替四乙烯五胺水溶液重复实验。

发酵液的分析结果列于附表一。

实例五：

将实例一得到的发酵液滤除菌体后得到提取母液(含1，3-丙二醇85g/L、乳酸8g/L、乙酸6g/L、乙醇5g/L)，取提取母液100kg，以聚酰胺类纳滤膜脱盐，脱盐压力1MPa，待母液透过80kg后，缓缓加透析水20kg，在进行纳滤膜脱盐，最终得到透析液100kg，最终液相色谱分析，色谱柱为Carbohydrate柱，流动相为0.005mol/L H₂SO₄，流速为0.5ml/min，柱温室温、进样量20μl。检测器为Beckman 126型折光光示差检测器，透析液中1，3-丙二醇浓度84g/L、乳酸浓度0g/L、乙酸浓度0g/L、乙醇浓度5g/L。

比较例二：

将比较例一得到的发酵液除去菌体得到提取母液(含1，3-丙二醇60g/L、乳酸12g/L、乙酸10g/L、乙醇12g/L)，取提取母液100kg，重复实例五，最终得到透析液100kg，经分析发现，其中含1，3-丙二醇59g/L、乳酸10g/L、乙酸10g/L、乙醇12g/L。

实例六～八：

以实例二～四得到的提取母液100kg，分别用聚砜类、聚酯类、聚烯烃类纳滤膜脱盐，均得到取提液100kg，脱盐压力1MPa，提取液中各物质的含量见附表二.

提取母液	膜材料	1，3丙二醇	乙酸	乳酸	乙醇
						实例二	聚砜类	78g/L	1g/L	0g/L	7g/L
实例三	聚酯类	79g/L	0g/L	0g/L	8g/L
						实例四	聚烯烃类	83g/L	1.5g/L	1g/L	6g/L

[0053] 通过实例可以看出以多乙烯多胺控制发酵液的pH值，降低了副产物有机盐对菌体细胞合成1，3-丙二醇影响和抑制效应，可显著提高1，3-丙二醇的制备强度、转化率和在最终发酵液中的浓度；同时，在脱盐步骤中，除盐工艺操作简单，提取时1，3-丙二醇的损失少，得率高，制备费用低；上述工艺，可以明显降低1，3-丙二醇的制备成本，简化了提取路线，易于工业化制备。

Claims

1.一种以多乙烯多胺控制pH值，甘油发酵制备1,3-丙二醇的方法，其特征在于：在1,3-丙二醇的生产中过程中通过流加多乙烯多胺水溶液来调节发酵液的pH值，并且在发酵结束后，用纳滤膜除去多乙烯多胺有机酸盐，其具体工艺过程如下：

（1）种子制备：取克雷伯杆菌接入种子培养基中，在温度30～40 ℃，搅拌速率80～110 rpm条件下培养8～15 h，转入二代培养基中，在pH为7.5～9.0，温度30～40℃的条件下，培养5～12h，制备二级种子，备用；

（2）发酵培养：将发酵液装入发酵罐内，装载量为50-85%，将步骤（1）制备的二级种子接入其中，接种量为2～20% ，然后通入氮气或者空气，通气量为0.1～0.5vvm，在发酵液的初始pH值 7.5～9.0，温度30～40 ℃，搅拌速率80～110 rpm条件下进行发酵，制备1,3-丙二醇，发酵过程中通过流加多乙烯多胺水溶液来控制发酵液的pH 值为6～8 ，待甘油降至一定浓度时补加甘油，待不产酸时停止发酵；

（3）多乙烯多胺有机酸盐脱除：

b、将上述透明的水溶液用一定孔径的纳滤膜过滤；

c、当收集的过滤液达到母液的80%左右时，开始向纳滤膜内缓缓添加蒸馏水，蒸馏水的添加量为母液的20%左右，得到高纯度1,3-丙二醇的水溶液，

其中，种子培养基：在1000ml蒸馏水中，加入酵母膏 1.5-2.5g 、MgSO4·7H₂O 0.15-0.25 g 、柠檬酸 0.40-0.44g、KH₂PO4 2.5-3.5g，NH₄Cl 1.5-2.5g、CaCl₂0.08-0.12g 、甘油28-32g 、无机离子溶液1.5-2.5ml进行混合作为种子培养基；

发酵培养基：在1000ml蒸馏水中，加入酵母膏0.5- 1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.15-0.25 g 、柠檬酸0.40-0.44g、KH₂PO₄ 0.5-1.5g、NH₄Cl 5.3-5.5g 、CaCl₂ 0.08-0.12g、甘油38-42 g 、无机离子溶液1.5-2.5ml、MnCl₂0.01-0.012 g 混合制得发酵培养基；

无机离子溶液为：在1000ml蒸馏水中，加入以下物质配制而成：ZnCl ₂ 0.65-0.70 g 、MnCl₂10.10-10.20 g 、H₃BO₃ 0.05-0.07 g 、CuCl₂ 0.45-0.50 g、FeCl₃ 5.2-5.6 g、CoCl₂11-15 g、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.23-0.27 g、3mol/L H₂SO₄ 18-22ml。

2.根据权利要求1所述的以多乙烯多胺控制pH值，甘油发酵制备1,3-丙二醇的方法，其特征在于：步骤（3）所述的一定孔径的纳滤膜为可截留分子量在150～500之间的纳滤膜。

3.根据权利要求1所述的以多乙烯多胺控制pH值，甘油发酵制备1,3-丙二醇的方法，其特征在于：步骤（3）所述的纳滤膜的材料选自纤维素衍生物类、聚砜类、聚酰胺类、聚酰亚胺类、聚酯类、聚烯烃类、含氟聚合物中的一种。