CN111944695A - 一种促进红曲菌固态发酵生产莫纳可林k的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进红曲菌固态发酵生产莫纳可林K的方法，属于微生物发酵技术领域。该方法是在红曲菌的固态发酵过程中添加环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)于固态培养基中，最适添加量为0.7mM，再接种活化好的红曲菌种子液，变温发酵至终点。本发明可稳定提高红曲菌有益次级代谢产物莫纳可林K的产量，且操作方法简单。

Description

一种促进红曲菌固态发酵生产莫纳可林K的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种促进红曲菌固态发酵生产莫纳可林K的方法。
背景技术
红曲菌(Monascus spp.)，又称红曲霉，是我国重要的传统药食两用的丝状真菌，其大米发酵产品——红曲米在我国已有近两千多年的应用历史。现代研究表明，红曲菌可产生莫纳可林K(Monacolin K，MK)和红曲色素(Monascus pigments)等有益次级代谢产物(secondary metabolites，SMs)，但某些菌株也可同时产生有害SMs——桔霉素(citrinin，CIT，一种真菌毒素)。其中，MK可调控人及动物体内胆固醇合成，因此MK高含量红曲在我国已开发成血脂康和脂必妥等降血脂药品，以及多种功能食品。目前，我国MK高含量(1％～3％)的红曲是以固态发酵方式生产的，存在发酵时间长(14～45d)，易被杂菌污染等问题。因此，调控MK产生，缩短MK高含量红曲的发酵时间已成为迫切需要解决的问题之一。
目前，改良菌株和各种发酵调控策略可在一定程度上调控红曲菌有益SMs的产生，但是仍然不能有效解决MK的工业生产周期长、产量低的瓶颈问题。因此，需要寻找更为合适的方法来进一步调控MK的产生。
研究表明，真菌SMs的产生受到多种信号转导途径的调节。其中，依赖环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的信号转导途径是重要调节途径之一。因此，调节细胞内cAMP的水平，为提高红曲菌有益SMs——MK的产生提供了新思路。
发明内容
本发明提供一种促进红曲菌固态发酵生产MK的方法，所述方法是在红曲菌的固态发酵过程中直接添加cAMP于大米固态培养基中。
所述cAMP添加量为0.1～1mM，最适添加量为0.7mM。
所述大米固态培养基的配制方法为：将50g大米装入250mL三角瓶中，调整培养基含水量为35％(w/w)(灭菌前加20％，灭菌后加15％)，乳酸添加量为0.6％(v/w)，MgSO4·7H2O终浓度为0.007mol/kg，于121℃灭菌20min，并趁热打散。
所述发酵方法为：向大米固态培养基中接种10％(v/w)活化好的种子液，30℃培养60h，再在24℃下培养至发酵终点。
所述种子液制备方法为：将红曲菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基试管(18×180mm)斜面中，28℃培养7d后，加5mL无菌水于试管斜面中，用接种环刮下斜面孢子，倒入已灭菌的装有玻璃珠的100mL空三角瓶中打散，再用2～3层已灭菌的擦镜纸过滤，血球计数板计数后，制备成106个/mL的孢子悬液，以10％(v/v)的接种量将孢子悬液接入种子培养基中，30℃，160r/min，培养36h。
所述种子培养基配方为：葡萄糖50g，蛋白胨10g，NH4H2PO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl20.1g，以土豆汁(PDA不添加蔗糖及琼脂)代替蒸馏水定容至1000mL，pH为6.0。
所述红曲菌为高产MK不产桔霉素的丛毛红曲菌(Monascus pilosus)MS-1。
本发明的提高红曲菌固态发酵生产MK的方法，简单高效。
附图说明
图1为红曲菌MS-1在含不同浓度cAMP的大米培养基上变温发酵过程中MK的含量变化。
图2为红曲菌MS-1在含cAMP的固态发酵罐中变温发酵过程中MK含量的变化。
具体实施方式
下面结合实施例和附图，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司；下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
固态发酵样品中MK的测定方法：
(1)样品中MK的提取：称取0.1g经过45℃烘干至恒重的固态发酵样品，加入10mL75％乙醇，水浴超声提取1h后，7000r/min离心15min，取上清过0.22μm微孔滤膜，用于HPLC检测。
(2)HPLC的检测条件：采用岛津LC-20AT液相色谱仪，inertsil ODS-3 4.6×250mm色谱柱，流动相为乙腈∶0.05％磷酸＝60∶40，流速1.0mL/min，柱温40℃，进样量20μL，检测波长为238nm。
实施例1
将配制好的0.05M的cAMP母液加入米饭培养基中，使cAMP终浓度(mM，即mmol/kg)为0.7、1、2(不添加cAMP为对照，CK)，按照说明书所述的红曲菌孢子悬液、种子培养基和大米培养基制备方法和固态发酵方法，将红曲菌MS-1的孢子悬液接种于种子培养基中30℃，160r/min，培养36h，接着接种10％(v/w)活化好的种子液，30℃培养60h后，24℃培养至发酵终点。设置3个平行，分别于3、6、8、10d测定发酵产物中MK的含量。结果如图1所示，随着发酵的进行，所有浓度cAMP试剂组的MK产量均逐渐升高。到发酵第10d时，随着cAMP浓度升高，MK产量由高变低(P＜0.05)，其中，cAMP浓度为0.7mM的试剂组MK产量最高，是对照的1.20倍，达到1.98mg/g(以绝干计)。
实施例2
按照说明书所述的红曲菌孢子悬液、种子培养基和大米固态培养基制备方法和固态发酵方法，以0.2的装填系数将大米固态培养基装入30L的固态发酵罐中，调整cAMP浓度为0.7mM(不添加cAMP为对照，CK)，115℃灭菌20min，接种前以1.5m3/h的风速吹干约3h，并将物料彻底打散后再接种10％(v/w)在30℃培养36h的MS-1种子液，并根据物料湿度适量补加无菌水。发酵前12h内转速调为25r/min，使培养基与种子液迅速混匀，之后，每天25r/min搅拌30min即可。在30℃培养60h后转入24℃继续培养至10d。发酵过程中维持通风量为0.5m3/h，并维持罐内湿度在100％且需根据物料湿度适量补水。每隔1d取样分析MK的含量。结果如图2所示，随着发酵的进行，MK的产量逐渐升高，其中，对照在发酵第4d和第6d时未检出MK，cAMP试剂罐的MK产量呈直线上升。与对照相比，从发酵第4d开始，MK含量便高于对照，且到发酵第10d时，提高到空白罐的4.44倍，达到1.21mg/g(以绝干计)。

Claims (7)

1.一种促进红曲菌固态发酵生产莫纳可林K(Monacolin K，MK)的方法，其特征在于，在红曲菌的固态发酵过程中加入环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，cAMP直接添加至红曲菌的固态培养基中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，固态培养基中cAMP的终浓度为0.1～1mM。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，固态培养基中cAMP的最适终浓度0.7mM。
5.根据权利要求1、2、3、4之一所述的固态培养基，其特征在于，固态培养基为大米培养基，其具体配制及发酵方法为：将50g大米装入250mL三角瓶中，调整培养基含水量为35％(w/w)(灭菌前加20％，灭菌后加15％)，乳酸添加量为0.6％(v/w)，MgSO4·7H2O终浓度为0.007mol/kg，于121℃灭菌20min，并趁热打散，冷却后，接种10％(v/w)活化好的种子液，30℃培养60h后，24℃培养至发酵终点。
6.根据权利要求5所述红曲菌固态发酵方法，其特征在于，所述种子液制备方法为：将红曲菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基试管(18×180mm)斜面中，28℃培养7d，加5mL无菌水于试管斜面中，用接种环刮下斜面孢子，倒入已灭菌的装有玻璃珠的100mL空三角瓶中打散，再用2～3层已灭菌的擦镜纸过滤，血球计数板计数后，制备成106个/mL的孢子悬液，以10％(v/v)的接种量将孢子悬液接入种子培养基中，30℃，160r/min，培养36h。种子培养基配方为：葡萄糖50g，蛋白胨10g，NH4H2PO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl20.1g，以土豆汁(PDA不添加蔗糖及琼脂)代替蒸馏水定容至1000mL，pH为6.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，红曲菌为高产莫纳可林K不产桔霉素的丛毛红曲菌(Monascus pilosus)MS-1。
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