CN109837225B - 一株埃博霉素d高产菌及其在发酵产埃博霉素d中的应用 - Google Patents
一株埃博霉素d高产菌及其在发酵产埃博霉素d中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株埃博霉素D高产菌及其在发酵产埃博霉素D中的应用，所述菌株分类命名为纤维堆囊菌（Sporangium cellulosum）SPD‑1935，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M2018531，在摇床发酵实验中诱变菌株埃博霉素D达到436.27mg/L，相比于出发菌株的1.35mg/L的产量提高了323倍；同时在检测过程中发现有微量埃博霉素C存在，但是并没有发现有埃博霉素A和B的产生。经过连续5次传代培养其埃博霉素D的产量并无明显变化，表示其遗传稳定性良好。本发明菌株完全符合工业化生产埃博霉素D的生产技术指标，可用于大规模工业化发酵生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一株埃博霉素D高产菌及其在发酵产埃博霉素D中的应用。
背景技术
粘细菌属于革兰氏阴性细菌，具有复杂多细胞行为的细菌。大约有12属40种，大多种都可以产生大量的次级代谢产物，产生埃博霉素的属于纤维堆囊菌（Sporangiumcellulosum）。纤维堆囊菌生长速度缓慢，达到对数生长期大约要16h，且野生型纤维堆囊菌在合成埃博霉素是产量极低，同时在培养过程中极易感染其他菌种。
埃博霉素(epothilone)是一类大环内酯类化合物，由德国国家生物技术中心(GBF)的G. Höfle等人于1993年首次报道。研究表明纤维堆囊菌菌株发酵液中可以分离埃博霉素。埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性：①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃博霉素没有紫杉醇细胞内毒素活性。③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒性。
生产埃博霉素的方法有化学合成法和生物合成法。其中埃博霉素A有6种合成方法，埃博霉素B有11种，埃博霉素C和D有两种。由于化学合成杂质多，效率低，所以现今主要应用的方法是生物合成法。生物合成法主要是通过粘细菌发酵产生埃博霉素。
埃博霉素作为极其有潜力的抗癌新药，引起了全世界的化学家、生物学家及药学家的极大兴趣和研究热情。从1993年发现至今十多年时间，有关埃博霉素的研究报告达500多篇，并且在埃博霉素的临床试验中，迄今为止已有六种埃博霉素类化合物。如:百美时施贵宝（Squibb）公司的埃博霉素B的另一个半合成类似物BMS-310750；诺华（Novartis）公司的埃博霉素B（EPO906）及其类似物（ABJ879）；还有罗氏（Roche）公司的埃博霉素D(KOS-862)和埃博霉素D的类似物 KOS-1584；以及先灵（Schering）公司的埃博霉素B的类似物ZK-Epo。
大量的临床研究结果显示出该类化合物有极大的药用价值，2007年10月16日，美国FDA批准了埃博霉素B的半合成类似物IXEMPRA(TM) (伊沙匹隆，ixabepilone，BMS-247550) 用于乳腺癌的治疗，这引起了全行业的振奋。
埃博霉素D 及其内酰胺衍生物(Aza-epothilone D)实验证明它具有较强的抑制微管解聚功能，是一种候选抗癌药物。但是目前所有合成埃博霉素D的方法，都无法维持正常需求。Julien通过基因工程技术使得埃博霉素合成酶基因簇在黄色黏球菌中表达，最高产量85mg/L 。2006年，Mutka等通过基因工程技术使得大肠杆菌种埃博霉素C和D仅仅能够达到LC-MS检测水平。阎家麒通过在纤维堆囊菌ATCC15384发酵培养中使用P450埃博霉素环氧酶的一种抑制剂，该抑制剂特异性抑制epoK 基因产物的生成，使得生产菌株只产生埃博霉素D和C ，而不产生埃博霉素A和B 。
生产埃博霉素的的方法有化学合成法和生物合成法。由于化学合成杂质多，效率低，所以现今主要应用的方法是生物合成法。生物合成法主要是通过粘细菌发酵产生埃博霉素。发酵法产生的主要是埃博霉素A和B，目前国际上通过粘细菌发酵合成埃博霉素的产量较低，美国施贵宝达到228mg/L（A:B=1:6），国内李越中等人通过研究改良能达到180mg/L（A:B=2），但是现在并没有关于大规模生产埃博霉素D的报道，所以本发明旨在选育一种新的高产埃博霉素D的菌种，并应用到大规模生产中。
发明内容
本发明的目的是在提供一株埃博霉素D高产菌及其在发酵产埃博霉素D中的应用，诱变操做方法简单、安全、高效，得到的埃博霉素D高产菌效价大幅提升的。
为了达到上述目的，本发明采用的技术手段如下：
一株埃博霉素D高产菌，分类命名为Sporangium cellulosum SPD-1935，已于2018年 8 月 9 日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2018531。
上述埃博霉素D高产菌SPD-1935特征：革兰氏阴性菌，兼性厌氧，菌落边缘颜色为淡黄色，菌落大小为3-8μm；适宜生长温度28-33℃；适宜在pH 7.0-8.0中间变化；菌种呈椭圆形。
初始菌种样本来自于南京工业大学生化工程中心后山腐败枝叶及土壤分离纯化后的纤维堆囊菌，经过低能氮离子注入诱变后，初步筛选、摇瓶发酵复筛选获得的埃博霉素D高产菌作为下一轮循环的初始菌种，直至筛选出埃博霉素D高产的目标菌株。
本发明所提供的纤维堆囊菌原始菌株的分离纯化方法，具体步骤如下：
将采集到的腐败枝叶及土壤风干后用液氮研磨法研磨至80目，将样品粉末均匀洒在CNST滤纸水琼脂平板的滤纸上，滤纸事先用30μg/mL的放线菌酮溶液浸泡。待接种好的平板上的样品充分湿润后，30℃恒温箱正置培养，40h后每天观粘细菌的扩展状况，并挑接出现的粘细菌（黄色黏状物）扩展至新的CNST滤纸水琼脂平板的滤纸上，滤纸事先用50μg/mL的重铬酸钾溶液浸泡，30℃正置培养，80h后出现子实体结构，将子实体结构在VY/2平板上划线培养，并取边缘粘细菌菌落反复转接培养3次，将营养细胞接入LB培养基内，摇床培养过夜，将澄清的培养液离心，收集子实体转接到CNST平板滤纸上，完成纯化，获得出发菌株纤维堆囊菌SPD-0。
上述菌种分离纯化所需CNST培养基配方为：KNO3 0.05%，Na2HPO4 0.025%，MgSO4·7H2O 0.1%，FeCL3 0.001%，琼脂 2%，微量元素液 1 mL/L，pH 7.2，115℃高压蒸汽灭菌 20min。微量元素液：MnCL2·4H2O 0.01%，氯化钴0.002%，氯化锌0.002%，氯化锂0.0005%，硫酸铜0.001%，H3BO3 0.001%，KBr 0.002%，KI 0.002%，Na2MoO4·2H2O 0.001%，SnCL2·2H2O0.0005% 。
上述菌种分离纯化所需VY/2培养基配方为：酵母膏0.5%，CaCL2·2H2O 0.1%，KOH调节PH至7.2。
上述菌种分离纯化所需LB培养基配方为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，PH7.0。
本发明所提供的埃博霉素D高产菌诱变方法，具体步骤如下：
（1）细胞悬浮液制备：将出发菌株纤维堆囊菌SPD-0制成浓度为106/mL悬浮液；
（2）低能氮离子注入诱变：取0.1 mL的步骤(1)中细胞悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在10-20 KeV，注入剂量为100×1014~500×1014ions/cm3下对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1 mL无菌水洗脱，涂布到M26平板培养基上，在28-33℃下倒置培养，培养时间为3-5d。
（3）诱变菌株的筛选：
初筛：将步骤（2）得到的单菌落接种至斜面培养基上，28-33℃下倒置培养，培养时间为3-5d，再将斜面上单菌落挑接到96孔板上，发酵培养基200~300μL/孔，大孔吸附树脂AB-8体积分数2%，28-33℃，150-300rpm摇床培养，培养时间5-7d，直至发酵液无色，吸出发酵液10000rpm离心10min弃上清，沉淀用去离子水洗涤3次，加入300μL异丙醇，浸提8h，收集浸提液，酶标仪检测249nm下吸收峰，取吸光度最高的20-30株进行复筛。
复筛：将初筛获得的菌株经过斜面培养后转接到种子培养基内扩大培养，玻璃转子打碎后按照5-15%（v:v）接种量接种至装有50-100mL的500mL发酵培养基上培养，培养温度为28-33℃，摇床转速为150-300rpm，培养时间5-7d，间隔4h取发酵液检测埃博霉素D含量，当埃博霉素D含量不再变化时停止发酵。发酵结束后，取5mL发酵液离心取上清液加入10%体积分数的大孔吸附树脂AB-8，磁力搅拌混匀4h，10000rpm离心10min收集大孔吸附树脂，去离子水重复洗涤3次，加入5~6倍体积的异丙醇，浸提8h，8000rpm离心10min收集浸提液于50mL容量瓶内，用异丙醇定容至刻度，取适量浸提液过0.22μm有机膜后进行HPLC检测埃博霉素D含量，筛选出产量最高的5-10株，重复（1）（2）（3），直到筛选到目标菌株。
上述诱变中，步骤（2）中离子注入诱变能量为15KeV，注入剂量为300×1014ions/cm3。
上述诱变中，步骤（2）中M26平板培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
上述的诱变中，步骤（3）中斜面培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
上述诱变中，步骤（3）中种子培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
上述诱变中，步骤（3）中发酵培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
上述诱变中，步骤（2）（3）中平板培养条件为：31℃±1℃，4.5d。
上述诱变中，步骤（3）中斜面培养条件为：31℃±1℃，4.5d。
上述诱变中，步骤（3）中种子培养培养条件为：31℃±1℃，4.5d，200rpm。
上述诱变中，步骤（3）中发酵培养条件为：接种量10%，装液量60/500mL，转速250rpm，时间6.5d，温度31℃±1℃。
上述的诱变中，步骤（3）中最终筛选的目标菌株命名为纤维堆囊菌（Sporangiumcellulosum）SPD-1935。
本发明所提供的埃博霉素D高产菌在发酵产埃博霉素D中的应用，具体步骤如下：
（1）M26平板培养：将上述诱变获得的菌株SPD-1935挑取单菌落接种于M26平板培养基上，培养温度为28-33℃，倒置培养时间3-5d;
（2）斜面培养：将步骤（1）平板培养基上的纤维堆囊菌SPD-1935挑一菌环接种至斜面培养基上静置培养，培养温度为28-33℃，培养时间3-5d;
（3）种子培养：将步骤（2）中的纤维堆囊菌SPD-1935接种至种子装有20-50mL液体种子液的250mL摇瓶培养基上培养，培养温度为28-33℃，摇床转速为150-300rpm，培养时间3-5d;
（4）发酵培养：将步骤3）中的纤维堆囊菌SPD-1935按照5-15%（v:v）接种量接种至装有50-100mL的500mL发酵培养基上培养，培养温度为28-33℃，摇床转速为150-300rpm，培养时间5-7d，间隔4h取发酵液检测埃博霉素D含量，当埃博霉素D含量不再变化时停止发酵。
埃博霉素D的含量检测：取5mL发酵液离心取上清液加入10%体积分数的大孔吸附树脂AB-8，磁力搅拌混匀4h，10000rpm离心10min收集大孔吸附树脂，去离子水重复洗涤3次，加入5~6倍体积的异丙醇，浸提8h，8000rpm离心10min收集浸提液于50mL容量瓶内，用异丙醇定容至刻度，取适量过0.22μm有机膜后进行HPLC检测埃博霉素D含量（上述检测每组重复3次取平均）。
上述的应用中，步骤（1）中M26平板培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
上述的应用中，步骤（2）中斜面培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
上述的应用中，步骤（3）中种子培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
上述的应用中，步骤（4）中发酵培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａCL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
上述的应用中，步骤（1）中平板培养条件优选为：31℃±1℃，4.5d。
上述的应用中，步骤（2）中斜面培养条件优选为：31℃±1℃，4.5d。
上述的应用中，步骤（3）中种子培养培养条件优选为：31℃±1℃，4.5d，200rpm。
上述的应用中，步骤（4）中发酵培养条件优选为：接种量10%，装液量60/500mL，转速250rpm，时间6.5d，温度31℃±1℃。
有益效果：
本发明通过低能离子束注入诱变后筛选所获得目标菌株SPD-1935，通过HPLC检测得到诱变菌种摇床发酵后其埃博霉素D产量为436.27mg/L，相比于出发菌株的1.35mg/L的产量提高了323倍；同时在检测过程中发现有埃博霉素C的产量为10.18mg/L，相比于出发菌株的0.26mg/L提升了大约40倍，但是并没有发现有埃博霉素A和B的产生。经过连续5次传代培养其埃博霉素D的产量并无明显变化，表示其遗传稳定性良好。在500L发酵罐上对该菌种进行工业化发酵生产，得到其埃博霉素D的产量为451.93mg/L，相比于出发菌株提高了335倍。所以本发明菌株完全符合工业化生产埃博霉素D的生产技术指标，可用于大规模工业化发酵生产，具有重大社会意义。
具体实施方式
实施例1
本实施例说明原始纤维堆囊菌分离纯化方法，具体步骤如下：
将采集到的腐败枝叶及土壤风干后用液氮研磨法研磨至80目，将样品粉末均匀洒在CNST滤纸水琼脂平板的滤纸上（滤纸做唯一碳源），滤纸事先用30μg/mL的放线菌酮溶液浸泡。待接种好的平板上的样品充分湿润后，30℃恒温箱正置培养，40h后每天观粘细菌的扩展状况，并挑接出现的粘细菌（黄色黏状物）扩展至新的CNST滤纸水琼脂平板的滤纸上，滤纸事先用50μg/mL的重铬酸钾溶液浸泡，30℃正置培养，80h后出现子实体结构，将子实体结构在VY/2平板上划线培养，并取边缘粘细菌菌落反复转接培养3次，将营养细胞接入LB培养基内，摇床培养过夜，将澄清的培养液离心，收集子实体转接到CNST平板滤纸上，完成纯化。挑选获得的菌株进行摇瓶发酵培养，HPLC检测埃博霉素D产量和显微观察菌株生长状况选定目标菌株，将获得的目标菌株命名为纤维堆囊菌SPD-0。HPLC检测其埃博霉素D产量为1.35mg/L。
上述菌种分离纯化所需CNST培养基配方为：KNO3 0.05%，Na2HPO4 0.025%，MgSO4·7H2O 0.1%，FeCL3 0.001%，琼脂 2%，微量元素液 1 mL/L，pH 7.2，115℃高压蒸汽灭菌 20 min。微量元素液：MnCL2·4H2O 0.01%，氯化钴0.002%，氯化锌0.002%，氯化锂0.0005%，硫酸铜0.001%，H3BO3 0.001%，KBr 0.002%，KI 0.002%，Na2MoO4·2H2O 0.001%，SnCL2·2H2O 0.0005% 。
上述菌种分离纯化所需VY/2培养基配方为：酵母膏0.5%，CaCL2·2H2O 0.1%，KOH调节PH至7.2。
上述菌种分离纯化所需LB培养基配方为：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，PH7.0。
实施例2
本实例说明埃博霉素D高产菌低能离子束注入诱变筛选的方法，具体步骤如下：
（1）细胞悬浮液制备：将出发菌株纤维堆囊菌SPD-0制成浓度为106/mL悬浮液。
（2）低能氮离子注入诱变：取0.1 mL的步骤(1)中细胞悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在15KeV，注入剂量为300×1014ions/cm3，靶室真空度为10-5Pa下，以50S脉冲式注入，间隔5 S，对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1 mL无菌水洗脱，涂布到M26平板培养基上，在31℃下倒置培养，培养时间为4d。
（3）诱变菌株的筛选：
初筛：将步骤（2）得到的单菌落接种至斜面培养基上，31℃下倒置培养，培养时间为3-5d，再将斜面上单菌落挑接到96孔板上，发酵培养基200μL/孔，大孔吸附树脂AB-8体积分数2%，31℃，250rpm摇床培养培养，直至发酵液颜色变淡，吸出发酵液10000rpm离心10min弃上清，沉淀用去离子水洗涤3次，加入400μL异丙醇，浸提8h，收集浸提液，酶标仪检测249nm下吸收峰，取吸光度最高的25株进行复筛。
复筛：将初筛获得的菌株经过斜面培养后转接到种子培养基内扩大培养，玻璃转子打碎后按照10%（v:v）接种量接种至装有60mL的500mL发酵培养基上培养，培养温度为31℃，摇床转速为250rpm，培养时间5-7d，间隔4h取发酵液检测埃博霉素D含量，当埃博霉素D含量不再变化时停止发酵。发酵结束后，取5mL发酵液离心取上清液加入10%体积分数的大孔吸附树脂AB-8，磁力搅拌混匀4h，10000rpm离心10min收集大孔吸附树脂，去离子水重复洗涤3次，加入4倍体积的异丙醇，浸提8h，8000rpm离心10min收集浸提液于50mL容量瓶内，用异丙醇定容至刻度，取适量浸提液过0.22μm有机膜后进行HPLC检测埃博霉素D含量，筛选出产量最高的5-10株，重复（1）（2）（3），直到筛选到目标菌株。
步骤（2）中M26平板培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
步骤（3）中斜面培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
步骤（3）中种子培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
步骤（3）中发酵培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａCL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
发酵结束后检测得目标菌株埃博霉素D产量如下表所示：
| 产物 | 出发菌株 | 诱变后菌种 |
| 埃博霉素D | 1.35mg/L | 436.27mg/L |
实施例3
本实例说明埃博霉素D高产菌鉴定和遗传稳定性，具体步骤如下：
菌种鉴定：革兰氏阴性菌，兼性厌氧，菌种杆状两端钝，无鞭毛，细胞可聚集形成粘液细胞组合的子实体结构。平板培养基上观察菌落边缘颜色为淡黄色，整齐、湿润，菌落大小为3-8μm，表面光滑；适宜生长温度28-33℃；最适生长PH 7.0-8.0中间变化。
传代发酵实验：
（1）M26平板培养：将上述诱变获得的菌株SPD-1935挑取单菌落接种于M26平板培养基上，培养温度为31℃，倒置培养时间4d。
（2）斜面培养：将步骤（1）平板培养基上的纤维堆囊菌SPD-1935挑一菌环接种至斜面培养基上静置培养，培养温度为31℃，培养时间4d。
（3）种子培养：将步骤（2）中的纤维堆囊菌SPD-1935接种至种子装有30mL液体种子液的250mL摇瓶培养基上培养，培养温度为31℃，摇床转速为200rpm，培养时间3-5d。
（4）发酵培养：将步骤3）中的纤维堆囊菌SPD-1935按照10%（v:v）接种量接种至装有60mL的500mL发酵培养基上培养，培养温度为31℃，摇床转速为250rpm培养，间隔4h取发酵液检测埃博霉素D含量，当埃博霉素D含量不再变化时停止发酵。
（5）含量检测：取5mL发酵液离心取上清液加入10%体积分数的大孔吸附树脂AB-8，磁力搅拌混匀4h，10000rpm离心10min收集大孔吸附树脂，去离子水重复洗涤3次，加入5~6倍体积的异丙醇，浸提8h，8000rpm离心10min收集浸提液于50mL容量瓶内，用异丙醇定容至刻度，取适量过0.22μm有机膜后进行HPLC检测埃博霉素D含量。（上述检测每组重复3次取平均）
埃博霉素D高产菌遗传表
| 传代次数 | 埃博霉素D/(mg/L) |
| 1 | 434.28 |
| 2 | 429.72 |
| 3 | 430.36 |
| 4 | 423.57 |
| 5 | 425.98 |
步骤（1）中M26平板培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
步骤（2）中斜面培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL ５g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
步骤（3）中种子培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａＣL 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
步骤（4）中发酵培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，ＮａCL 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
实施例3
本实例说明埃博霉素D高产菌发酵产埃博霉素D的应用，具体步骤如下：
（1）M26平板培养：将上述诱变获得的菌株SPD-1935挑取单菌落接种于M26平板培养基上，培养温度为31℃，倒置培养时间4d。
（2）斜面培养：将步骤（1）平板培养基上的纤维堆囊菌SPD-1935挑一菌环接种至斜面培养基上静置培养，培养温度为31℃，培养时间4d。
（3）种子培养：将步骤（2）中的纤维堆囊菌SPD-1935接种至种子装有30mL液体种子液的250mL摇瓶培养基上培养，培养温度为31℃，摇床转速为200rpm，培养时间3-5d。
（4）发酵培养：将步骤3）中的纤维堆囊菌SPD-1935按照10%（v:v）接种量接种至装有60mL的500mL发酵培养基的摇瓶上培养，培养温度为31℃，摇床转速为250rpm培养，间隔4h取发酵液检测埃博霉素D含量，当埃博霉素D含量不再变化时停止发酵。
（5）含量检测：取5mL发酵液离心取上清液加入10%体积分数的大孔吸附树脂AB-8，磁力搅拌混匀4h，10000rpm离心10min收集大孔吸附树脂，去离子水重复洗涤3次，加入5~6倍体积的异丙醇，浸提8h，8000rpm离心10min收集浸提液于50mL容量瓶内，用异丙醇定容至刻度，取适量过0.22μm有机膜后进行HPLC检测埃博霉素D含量（上述检测每组重复3次取平均）。
发酵后得到埃博霉素D产量为431.52mg/L，相比于出发菌株提升了320倍。
本实例培养基配方如下：
M26平板培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基配方：七水硫酸镁0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
发酵培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
实施例4
本实例说明埃博霉素D高产菌发酵产埃博霉素D的应用，具体步骤如下：
（1）M26平板培养：将上述诱变获得的菌株SPD-1935挑取单菌落接种于M26平板培养基上，培养温度为31℃，倒置培养时间4d。
（2）斜面培养：将步骤（1）平板培养基上的纤维堆囊菌SPD-1935挑一菌环接种至斜面培养基上静置培养，培养温度为31℃，培养时间4d。
（3）种子培养：将步骤（2）中的纤维堆囊菌SPD-1935接种至种子装有30mL液体种子液的250mL摇瓶培养基上培养，培养温度为31℃，摇床转速为200rpm，培养时间3-5d。
（4）发酵培养：将步骤3）中的纤维堆囊菌SPD-1935按照10%（v:v）接种量接种至装有60mL的500mL发酵培养基上培养，培养温度为31℃，摇床转速为250rpm培养，40h后，间隔4h取发酵液检测埃博霉素D含量，当埃博霉素D含量不再变化时停止发酵。
（5）含量检测：取5mL发酵液离心取上清液加入10%体积分数的大孔吸附树脂AB-8，磁力搅拌混匀4h，10000rpm离心10min收集大孔吸附树脂，去离子水重复洗涤3次，加入5~6倍体积的异丙醇，浸提8h，8000rpm离心10min收集浸提液于50mL容量瓶内，用异丙醇定容至刻度，取适量过0.22μm有机膜后进行HPLC检测埃博霉素D含量（上述检测每组重复3次取平均）。
发酵后得到埃博霉素D产量为433.91mg/L，相比于出发菌株提升了321倍。
本实例培养基配方
M26平板培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
发酵培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
实施例5
本实例说明埃博霉素D高产菌发酵产埃博霉素D的应用，具体步骤如下：
（1）M26平板培养：将上述诱变获得的菌株SPD-1935挑取单菌落接种于M26平板培养基上，培养温度为31℃，倒置培养时间4d。
（2）斜面培养：将步骤（1）平板培养基上的纤维堆囊菌SPD-1935挑一菌环接种至斜面培养基上静置培养，培养温度为31℃，培养时间4d。
（3）种子培养：将步骤（2）中的纤维堆囊菌SPD-1935接种至种子装有60mL液体种子液的500mL摇瓶培养基上培养，培养温度为31℃，摇床转速为200rpm，培养时间3-5d。
（4）发酵培养：将步骤3）中的纤维堆囊菌SPD-1935按照10%（v:v）接种量接种至装有35L的50L发酵培养基的发酵罐上培养，培养温度为31℃，转速为250rpm培养，通气量为1.0VVM，40h间隔4h取发酵液检测埃博霉素D含量，当埃博霉素D含量不再变化时停止发酵。
（5）含量检测：取5mL发酵液离心取上清液加入10%体积分数的大孔吸附树脂AB-8，磁力搅拌混匀4h，10000rpm离心10min收集大孔吸附树脂，去离子水重复洗涤3次，加入5~6倍体积的异丙醇，浸提8h，8000rpm离心10min收集浸提液于50mL容量瓶内，用异丙醇定容至刻度，取适量过0.22μm有机膜后进行HPLC检测埃博霉素D含量。（上述检测每组重复3次取平均）
发酵后得到埃博霉素D产量为437.52mg/L，相比于出发菌株提升了324倍。
本实例培养基配方
M26平板培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
发酵培养基配方：七水硫酸镁0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
实施例6
本实例说明埃博霉素D高产菌发酵产埃博霉素D的应用，具体步骤如下：
（1）M26平板培养：将上述诱变获得的菌株SPD-1935挑取单菌落接种于M26平板培养基上，培养温度为31℃，倒置培养时间4d。
（2）斜面培养：将步骤（1）平板培养基上的纤维堆囊菌SPD-1935挑一菌环接种至斜面培养基上静置培养，培养温度为31℃，培养时间4d。
（3）种子培养：将步骤（2）中的纤维堆囊菌SPD-1935接种至种子装有60mL液体种子液的500mL摇瓶培养基上，作为一级种液，培养温度为31℃，摇床转速为200rpm，培养4d后，按照接种量为20%接种至装有30L种子培养基的50L种子罐上，作为二级种液，培养时间4d，培养温度为31℃，转速为200rpm，通气量0.5VVM。
（4）发酵培养：将步骤3）中的二级种液按照10%（v:v）接种量接种至装有350L的500L发酵培养基的发酵罐上培养，培养温度为31℃，转速为250rpm，通气量1.0VVM，培养40h后，间隔4h取发酵液检测埃博霉素D含量，当埃博霉素D含量不再变化时停止发酵。
（5）含量检测：取5mL发酵液离心取上清液加入10%体积分数的大孔吸附树脂AB-8，磁力搅拌混匀4h，10000rpm离心10min收集大孔吸附树脂，去离子水重复洗涤3次，加入5~6倍体积的异丙醇，浸提8h，8000rpm离心10min收集浸提液于50mL容量瓶内，用异丙醇定容至刻度，取适量过0.22μm有机膜后进行HPLC检测埃博霉素D含量。（上述检测每组重复3次取平均）
发酵后得到埃博霉素D产量为443.19mg/L，相比于出发菌株提升了328倍。
本实例培养基配方
M26平板培养基配方为：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉２g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
斜面培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
种子培养基配方：七水硫酸镁0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
发酵培养基配方：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，马铃薯淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
埃博霉素D检测方法：
试剂：色谱纯异丙醇;
检测条件：流动相为异丙醇:水=7:2.5(v:v)；流速为1.0mL/min；检测波长为249nm；进样量为20μL；柱温为25℃。
标准品制备：准确称量埃博霉素D标准品20mg（精确至1mg）溶于50mL容量瓶内，用色谱纯异丙醇溶解并定容至刻度，再分别稀释成浓度梯度为0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40g/L的标准液备用。
样品制备：发酵结束后，取5mL发酵液离心取上清液加入10%体积分数的大孔吸附树脂AB-8，磁力搅拌混匀4h，10000rpm离心10min收集大孔吸附树脂，去离子水重复洗涤3次，加入4倍体积的异丙醇，浸提8h，8000rpm离心10min收集浸提液于50mL容量瓶内，用异丙醇定容至刻度，取适量过0.22μm有机膜后进行HPLC检测埃博霉素D含量（上述检测每组重复3次取平均）。
含量计算：用标准品绘制标准曲线（同一浓度重复三组取平均值），标准曲线线性方程为：
埃博霉素D浓度=1.4784 × 10-5 ×埃博霉素D峰面积（R2=0.99481）。
Claims (6)
1.一株埃博霉素D高产菌株，分类命名为纤维堆囊菌（Sporangium cellulosum）SPD-1935，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2018531。
2.权利要求1所述的埃博霉素D高产菌株在发酵产埃博霉素D中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1）平板培养：将纤维堆囊菌SPD-1935接种至M26平板培养基上培养，培养温度为28-33℃，倒置培养时间3-5d；
2）斜面培养：将步骤1）平板培养基上的纤维堆囊菌SPD-1935接种至斜面培养基上静置培养，培养温度为28-33℃，培养时间3-5d；
3）种子培养：将步骤2）中的纤维堆囊菌SPD-1935接种至种子培养基上培养，培养温度为28-33℃，培养时间3-5d；
4)发酵培养：将步骤3）中的纤维堆囊菌SPD-1935按照5-15%v:v接种量接种至发酵培养基上培养，培养温度为28-33℃，间隔4h取发酵液检测埃博霉素D含量，当埃博霉素D含量不再变化时停止发酵，培养时间5-7d；
步骤1）中M26平板培养基包含如下组分：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述步骤2）中斜面培养基包含如下组分：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，琼脂 15g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述步骤3）中种子培养基包含如下组分：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl 5g/L，酵母粉 2g/L，葡萄糖 15g/L，大豆蛋白胨10g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.2，115℃灭菌30min。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述步骤4）中的发酵培养基包含如下组分：七水硫酸镁 0.05g/L，一水硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾2g/L，NaCl10g/L，氯化锌0.01g/L，三氯化铁0.01g/L，氯化钴0.01g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖 30g/L，大豆蛋白胨15g/L，土豆淀粉10g/L，其余为水，pH调至7.6，115℃灭菌30min。
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