生产动物专用抗生素阿维拉霉素的菌株及方法
技术领域
本发明涉及微生物及其发酵生产化合物的领域,属于生物制药技术领域,具体涉及一种生产动物专用抗生素阿维拉霉素的菌株及方法。
背景技术
现代畜牧业的集约化、高密度养殖方式带来了生产效率的提高,同时也大大增加了动物疫病传播的风险。抗生素作为饲料添加剂,不仅可以促进动物生长,更重要的是预防病原菌感染、群体疾病的发生,对集约化饲养业的发展做出了重大贡献,极大地提高了饲养业的经济效益。但同时,也产生了有关耐药菌株、药物残留等问题。由于我国动物专用抗生素品种少,大量人用抗生素同时用于动物疫病治疗和促生长,并且使用方法不科学,导致一方面由于药物残留,动物产品出口遇阻,另一方面,出现了越来越严重的细菌耐药性的问题。为了防止耐药菌的产生对人类健康造成威胁,世界各国的科学家对抗药性的产生机制做了长期的研究,研究结果认为,逐步减少和限制人用抗生素在动物中的使用,发展动物专用抗生素是未来畜牧业的发展趋势。动物专用抗生素,是指专用于动物疾病的预防治疗和促生长,在人类临床上没有应用,不与人用抗生素结构类似,不与人用抗生素产生交叉耐药性的抗生素。
阿维拉霉素(Avilamycin)又名卑霉素,属寡糖类抗生素,是一种使用效果卓越的动物专用抗生素。阿维拉霉素约有A、B、C、D、F、G、H等十二种成分,其中最具活性的是阿维拉霉素A组分,阿维拉霉素具有较高的安全性,在肠道中不吸收,在畜产品中无残留;排泄后(包括分解物)对环境安全;在配合饲料的制作中,很少产生粉尘等污染;在畜禽饲料中添加使用时,无需停药期。由于卓越的使用效果,阿维拉霉素已在世界40多个国家广泛使用。
阿维拉霉素的生产方法主要采用发酵结合后处理工艺。目前,我国尚没有实现阿维拉霉素的工业化生产,主要由于菌种产素能力较低,发酵工艺关键控制点较多,发酵周期长,组分比例难以控制,生产成本高昂。
发明内容
为解决上述存在的问题,本发明提供了一种生产动物专用抗生素阿维拉霉素的菌株。
本发明还提供了利用上述菌株生产阿维拉霉素的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:
所述的生产动物专用抗生素阿维拉霉素的菌株为绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes) SDSL1119,已于2009年7月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.3198。该菌种适应在较高糖浓度下用于阿维拉霉素发酵。
所述的生产阿维拉霉素的方法包括绿色产色链霉菌Streptomycesviridochromogenes SDSL1119的斜面菌种培养、摇瓶菌种培养、发酵培养等步骤。通过优化发酵工艺,解决了阿维拉霉素发酵单位低、组分比例失调、生产成本高等问题。
一、菌株选育
第一阶段
从野生菌Streptomyces viridochromogenes SDSL1号菌出发,经连续紫外诱变得到比出发菌株产量提高161%的104号高产菌株。该菌株经过连续的紫外诱变之后,适应在较高的糖浓度下用于发酵生产阿维拉霉素,克服了野生菌株不适应高糖培养基的缺陷。较高的糖浓度有利于阿维拉霉素的细胞内合成。
第二阶段
将104号高产菌株经连续的链霉素抗性筛选,得到较104菌株产量提高102%的232菌株。
平板筛选培养基组成为:玉米淀粉20~25g/L,KNO3 1~2g/L,K2HPO4 0.5~1g/L,MgSO4·7H2O0.5~0.8g/L,FeSO4·7H2O 0.01~0.02g/L,NaCl 0.5~1g/L,琼脂20~40g/L,培养基pH 7.0~7.2,将链霉素按照30~200ug/ml的浓度添加至培养基中,制作成平板,121℃灭菌30分钟。利用该链霉素抗性筛选平板,筛选抗链霉素的菌株,培养温度27~30℃,培养时间8~11天。
第三阶段
将232菌株经多轮亚硝基胍诱变,结合链霉素抗性筛选得到SDSL1009菌株,较232菌株产量提高56%。
第四阶段
SDSL1009菌株经多轮自然分纯,链霉素抗性筛选得到SDSL1119菌株,产量达到5000U/ml以上。
二、发酵过程
(1)斜面培养:将绿色产色链霉菌Streptomyces viridochromogenes SDSL1119接种在斜面培养基上,培养温度27~30℃,培养时间8~11天。
斜面培养基组成为:玉米淀粉20~25g/L,KNO3 1~2g/L,K2HPO4 0.5~1g/L,MgSO4·7H2O0.5~0.8g/L,FeSO4·7H2O 0.01~0.02g/L,NaCl 0.5~1g/L,琼脂20~40g/L,培养基pH 7.0~7.2。121℃灭菌30分钟。
(2)种子培养:使用无菌水将斜面上培养的孢子制成孢子悬液,并接种0.5ml孢子悬液于100ml种子培养基之中;或者用挖块针刮取25mm2斜面接种于种子培养基中;所述种子培养基的组成为黄豆饼粉15~20g/L,干酵母2.5g/L,葡萄糖2.5~5g/L,糊精10~20g/L,CaCl2 20~30g/L,CaCO3 1g/L,pH 6.4~6.7。121℃灭菌30分钟。种子瓶在27~29℃、转速220~250rpm、振幅5cm的摇床上培养24~26h,培养完毕,种子液颜色为米黄色;镜检发现,菌丝丰富,有很多分枝,小子座状。
(3)发酵:将培养好的种子液接种于发酵培养基中,每瓶接种种子液量为发酵瓶装量的10~13%,发酵培养基所含成分及各自的重量百分比浓度为:葡萄糖2.0%~3.0%,玉米淀粉8%,黄豆饼粉1.25~1.5%,豆油0.4~0.6%,CaCl2 1.0%~2.0%,CaCO3 0.3~0.5%,NaCl 0.05~0.1%,NaNO3 0.45~0.6%,MgSO4 0.004%,CuSO4 0.003%,,(NH4)2SO40.2~0.4%,调pH 7.0~7.2,分装:500ml三角瓶装50ml,121℃灭菌30分钟。发酵20~24小时后加入0.1%~0.15%的L-缬氨酸,发酵瓶在28~32℃条件下培养200-220h,转速220~250RPM,振幅5cm。
发酵完毕,发酵液呈现褐色;将发酵液过滤后,菌丝体用甲醇浸提,离心分离,浸提液经浓缩后,进而加水结晶得到阿维拉霉素结晶粉末。
(4)分析检测:发酵液效价通过HPLC进行检测。
色谱条件为:填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶;流动相为乙腈-0.2%磷酸二氢铵溶液,V(乙腈)∶V(0.2% NH3H2PO3)=51∶49,用磷酸调节pH值为3.0,检测波长为214nm。
标准品溶液中卑霉素A和B生物效价的计算公式为:
标准品卑霉素A生物效价=标准品溶液质量浓度×标准品中卑霉素A含量×卑霉素A的理论生物效价系数1.451(对于组分A,1U相当于1.451ug);
标准品卑霉素B生物效价=标准品溶液质量浓度×标准品中卑霉素B含量×卑霉素B的理论生物效价0.908(对于组分B,1U相当于0.908ug)。
根据求得的标准品溶液中卑霉素A和B的生物效价,按外标法以峰面积计算出供试样品中卑霉素A和B的生物效价,两者相加即为供试品中卑霉素的产量。
经检测可知,发酵液中阿维拉霉素的生物效价达到了5000U/ml。
采用上述技术方案,本发明具有以下积极效果:
1、阿维拉霉素的生产菌种Streptomyces viridochromogenes SDSL 1119,通过经典筛选手段,得到多株高产稳产菌株。
2、经单因子和统计分析试验设计,得到了优化的培养基配方和发酵工艺,大幅提高阿维拉霉素的产量,效价达到5000ug/ml;并改善了阿维拉霉素A组分与B组分的比例,使得生物活性更高的A组分比例大幅提高,A∶B大于4.0∶1。
3、发酵生产得到动物专用抗生素阿维拉霉素,生产过程绿色环保,产品生物活性高、抗菌效果好、无残留、无交叉耐药性,可有效的防止动物疾病的爆发,保证动物源食品的安全。
微生物保藏信息:
绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)SDSL1119,已于2009年7月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCCNo.3198。
附图说明
图1为检测实施例2的发酵液效价的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作具体的说明。以下浓度如无特别说明,均为重量百分比浓度。
实施例1
通过对野生菌SDSL1号菌进行连续紫外诱变,得到适应高糖培养基的104号菌株,操作步骤如下:
将1号菌株接入斜面培养基,培养8天后,选取一支生长良好的试管斜面,加入10ml无菌水,洗涤2~3次,转入带玻璃珠的小三角瓶中打散混匀,得菌悬液,使得细胞控制在108个/ml左右。将悬浮液装在平皿中,暴露于30W紫外灯源下15厘米处,照射60秒。照射后梯度稀释10-3~10-5,涂平板。培养温度28℃,培养时间9天。选取长势良好的菌落,进行发酵验证。同时,将未进行紫外照射的野生菌也进行发酵验证。发酵培养基配制两个糖浓度,A配方添加8%玉米淀粉,B配方不添加,其他组分一致。
经HPLC检测发酵液中阿维拉霉素含量。在B配方中原始野生菌可以正常生长并产阿维拉霉素590U/ml,诱变菌株104号由于糖浓度偏低,产量也仅为603U/ml;在A配方中未经紫外诱变的原始野生菌的生长和产素能力受到高糖浓度强烈抑制,阿维拉霉素产量仅为约80U/ml,而诱变菌株104号的阿维拉霉素产量达到1542U/ml。突变株104号产量超过未经紫外诱变的原始野生菌161%,说明诱变菌株104号具备了在高糖浓度下高产阿维拉霉素的能力。
培养基成分如下:
(1)平板培养基:玉米淀粉20g/L,KNO3 1g/L,K2HPO4 0.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,NaCl 1g/L,琼脂20g/L,培养基pH 7.2,制作成平板,121℃灭菌30分钟。培养温度28℃,培养时间9天。
(2)斜面培养基:由2.0%玉米淀粉,0.1%KNO3,0.1%K2HPO4,0.08%MgSO4·7H2O,0.001%FeSO4·7H2O,0.05%NaCl,2.0%琼脂,100ml蒸馏水组成,pH 7.0,121℃灭菌30分钟,培养温度28℃,培养时间8天。
(3)种子培养基:含有2%黄豆饼粉,0.25%干酵母,0.25%葡萄糖,1%糊精,2%CaCl2,0.1%CaCO3,用蒸馏水定容至100ml,pH 6.5。121℃灭菌30分钟。种子瓶在28℃、转速250rpm、振幅5cm的摇床上培养24h。
(4)发酵:培养完毕后,将种子液5ml接种于50ml发酵培养基中。发酵培养基含有葡萄糖2.0%,玉米淀粉(A配方8%,B配方没有),黄豆饼粉1.5%,豆油0.5%,CaCl2 1.0%,CaCO3 0.5%,NaCl 0.1%,NaNO3 0.5%,MgSO4 0.004%,CuSO4 0.003%,(NH4)2SO4 0.2%,pH 7.2,分装:500ml三角瓶装50ml,121℃灭菌30分钟。L-缬氨酸在发酵24小时后按照0.1%的量加入,发酵瓶在28℃条件下培养220h,转速220RPM,振幅5cm。发酵完毕,发酵液呈现褐色。
实施例2
将菌株104号经过链霉素抗性筛选得到菌株232号。再利用亚硝基胍诱变232号菌株,结合链霉素抗性筛选高产菌株。操作步骤如下:
将232号菌株接入斜面培养基,培养8天后,选取一支生长良好的试管斜面,加入10ml无菌水,洗涤2~3次,转入带玻璃珠的小三角瓶中打散混匀,得菌悬液,使得细胞控制在108个/ml左右。
在通风橱内,进行称取20mg亚硝基胍,按0.1ml/mg的比例先加丙酮使之溶解,再加4倍柠檬酸盐缓冲液稀释,这样制成的溶液浓度为2mg/ml。将孢子悬浮液与亚硝基胍溶液按1∶2混合,在26~28℃下作用30分钟。处理后,离心分离,并反复用生理盐水洗涤离心10次以上,最后用生理盐水恢复到原有体积。然后按照梯度稀释,涂布到链霉素抗性筛选平板中,培养温度28℃,培养时间8天。选取长势良好的菌落,进行发酵验证。经HPLC检测发酵液中阿维拉霉素含量,突变株1009产量超过亚硝基胍诱变前的232号56%,达到4860U/ml。
所涉及到的培养基及生长条件如下:
(1)平板筛选培养基:玉米淀粉20g/L,KNO3 1g/L,K2HPO4 0.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.02g/L,NaCl 1g/L,琼脂20g/L,培养基pH 7.2,将链霉素按照30~200ug/ml的浓度添加至培养基中,制作成平板,121℃灭菌30分钟。利用该链霉素抗性筛选平板,筛选抗链霉素的菌株,培养温度28℃,培养时间9天。
(2)斜面培养:斜面培养基由2.0%玉米淀粉,0.1%KNO3,0.1%K2HPO4,0.08%MgSO4·7H2O,0.001%FeSO4·7H2O,0.05%NaCl,2.0%琼脂,100ml蒸馏水组成,pH 7.0,121℃灭菌30分钟,培养温度28℃,培养时间8天。
(3)种子培养:用挖块针刮取25mm2斜面,接种于100ml液体种子培养基。种子培养基含有2%黄豆饼粉,0.25%干酵母,0.25%葡萄糖,1%糊精,2%CaCl2,0.1%CaCO3,用蒸馏水定容至100ml,pH 6.5。121℃灭菌30分钟。种子瓶在28℃、转速250rpm、振幅5cm的摇床上培养24h。
(4)发酵:培养完毕后,将种子液5ml接种于50ml发酵培养基中。发酵培养基含有葡萄糖2.0%,玉米淀粉8%,黄豆饼粉1.5%,豆油0.5%,CaCl2 1.0%,CaCO3 0.5%,NaCl 0.1%,NaNO3 0.5%,MgSO4 0.004%,CuSO4 0.003%,(NH4)2SO4 0.2%,pH 7.2,分装:500ml三角瓶装50ml,121℃灭菌30分钟。L-缬氨酸在发酵24小时后按照0.1%的量加入,发酵瓶在28℃条件下培养220h,转速220RPM,振幅5cm。发酵完毕,发酵液呈现褐色,HPLC检测含量达到了4860ug/ml。组分A∶组分B=4.1∶1,HPLC图谱见附图1,其中Peak1为组分B,Peak2为组分A。
|
Peak Name |
RT |
Area |
%Area |
Height |
1 |
|
13.292 |
168450 |
2.32 |
10272 |
2 |
Peak1 |
14.906 |
1279848 |
17.63 |
64037 |
3 |
|
15.790 |
252315 |
3.48 |
12939 |
4 |
|
16.415 |
156360 |
2.15 |
6139 |
5 |
|
19.215 |
116737 |
1.61 |
5156 |
6 |
Peak2 |
25.278 |
5286155 |
72.81 |
167686 |
将发酵液经过滤后,将菌丝体用甲醇浸提,离心分离,浸提液经浓缩后,加水结晶得到阿维拉霉素结晶。
实施例3
将已经诱变筛选得到的1009号菌株,再经多轮自然分纯。所用孢子悬液制备同实例1,浓度大约108个/ml。操作操作如下:
选取8支粗试管,在1-8号中加入9毫升无菌水,吸取1ml孢子悬液入1号管,充分震动混匀,从1号管吸1ml到2号管,依次类推,制成梯度浓度。从6号管中吸取0.05ml于平板培养基内涂抹均匀。同理,从7、8号管分别吸取0.1和0.2ml稀释液于平板培养基中。培养温度28℃,培养时间8天。挑选健壮、无杂菌的单菌落接入斜面培养,通过种子培养,然后进行发酵验证。
(1)平板培养基:玉米淀粉25g/L,KNO31g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO4·7H2O0.8g/L,FeSO4·7H2O 0.02g/L,NaCl 1g/L,琼脂20g/L,培养基pH 7.2,制作成平板,121℃灭菌30分钟。培养温度28℃,培养时间8天。
(2)斜面培养:斜面培养基由2.0%玉米淀粉,0.2%KNO3,0.1%K2HPO4,0.06%MgSO4·7H2O,0.002%FeSO4·7H2O,0.05%NaCl,3.0%琼脂,100ml蒸馏水组成,pH7.1,121℃灭菌30分钟。培养温度30℃,培养时间10天。
(3)种子培养:用挖块针刮取25mm2斜面,接种于100ml液体种子培养基。种子培养基由1.8%,黄豆饼粉,0.25%干酵母,0.5%葡萄糖,1%糊精,3%CaCl2,0.1%CaCO3,100ml蒸馏水组成,pH 6.4,121℃灭菌30分钟。种子瓶在29℃、转速230rpm、振幅5cm的摇床上培养25h。
(4)发酵:培养完毕后,将种子液6.5ml接种于50ml发酵培养基中。发酵培养基由葡萄糖2.5%,玉米淀粉8%,黄豆饼粉1.5%,豆油0.6%,CaCl2 2.0%,CaCO3 0.5%,NaCl 0.1%,NaNO3 0.45%,MgSO4 0.004%,CuSO4 0.003%,(NH4)2SO4 0.3%,pH 7.2,分装:500ml三角瓶装50ml,121℃灭菌30分钟。L-缬氨酸在发酵20小时后按照0.15%的量加入,发酵瓶在30℃条件下培养210h,转速220RPM,振幅5cm。发酵完毕,发酵液呈现褐色,HPLC检测含量达到了5107ug/ml。组分A∶组分B=4.6∶1。
实施例4
利用高产菌株1119号,进行发酵培养。
(1)斜面培养:将链霉菌Streptomyces viridochromogenes SDSL 1119接种到斜面培养基上。斜面培养基由2.5%玉米淀粉,0.1%KNO3,0.05%K2HPO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.001%FeSO4·7H2O,0.1%NaCl,4.0%琼脂,100ml蒸馏水组成,pH7.2,121℃灭菌30分钟。培养温度28℃,培养时间11天。
(3)种子培养:用挖块针刮取25mm2斜面,接种于100ml液体种子培养基。种子培养基由1.5%黄豆饼粉,0.25%干酵母,0.3%葡萄糖,2%糊精,2.5%CaCl2,0.1%CaCO3,100ml蒸馏水组成,pH 6.7,121℃灭菌30分钟。种子瓶在30℃、转速240rpm、振幅5cm的摇床上培养24h。
(4)发酵:培养完毕后,将种子液5ml接种于50ml发酵培养基中。发酵培养基由葡萄糖3%,玉米淀粉8%,黄豆饼粉1.25%,豆油0.4%,CaCl2 1.0%,CaCO3 0.3%,NaCl 0.05%,NaNO3 0.6%,MgSO4 0.004%,CuSO4 0.003%,(NH4)2SO4 0.4%,pH 7.2,分装:500ml三角瓶装50ml,121℃灭菌30分钟。L-缬氨酸在20小时后按照0.15%的量加入,发酵瓶在32℃条件下培养220h,转速220RPM,振幅5cm。发酵完毕,发酵液呈现褐色,HPLC检测含量达到了5053ug/ml。组分A∶组分B=4.3∶1。
相比国内一般方法,通过本方法生产阿维拉霉素,产量大幅提高10倍,生产过程更稳定,产物生物活性更高。