CN106995830A - 一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，操作步骤为：1）斜面培养；2）种子培养；3）发酵培养；4）提纯。有益效果为：本发明简单易行，不需要频繁的进行菌种分纯复壮，节省了时间和人力资源；发酵培养基能满足绿色链霉菌对碳源、氮源以及各种生长因子的需求，产量达到3.56g/L以上；生物活性最高的A组分的比例大幅提升，得到的阿维拉霉素的生物活性高，可减少在饲料中的投放量，降低成本；利用废糖蜜、国库陈粮等农副产品下脚料及其结合葡萄糖、蛋白胨作为发酵培养基的混合碳源，发酵生产阿维拉霉素，做到了废物利用；生产过程绿色环保，可有效的促进动物生长和预防动物疾病，保证动物源食品的安全。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，具体是一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法。
背景技术
抗生素添加于饲料中用以促进畜禽生长发育和提高产量报道已有近 60 年的历史，许多国家都长期应用抗生素添加剂。然而，伴随着抗生素类促生长剂的广泛使用，一系列问题也逐渐显露，主要是药物残留和耐药性问题。长期、广泛、不加选择地使用抗生素饲料给细菌性疾病的控制和治疗带来了极大的麻烦和困难，同时也给人类的健康带来潜在的威胁。目前虽然关于是否应该在饲料中使用抗生素存在众多的争议，但实践证明，合理地使用抗生素添加剂能都促进畜禽生长，提高饲料的转化率。同时也有报告显示，禁止在饲料中添加抗生素或其他抗菌促生长剂的国家会造成畜牧业生产成本增加、盈利减少，同时也有可能引发诸如生态环境及国家之间的贸易战争等问题。事实上，抗生素添加剂仍在大量使用，只有对它们进行全面的认识和合理的应用，才能充分发挥其有利作用，并避免对人类健康造成伤害。当务之急便是针对微生物的耐药性进行研究，开发广谱、高效、安全的新型饲料添加剂，这不仅能带来显著的经济效益，还具有极其重要的社会意义。
阿维拉霉素又称卑霉素、阿美拉霉素，是一种新型消化促进剂或代谢调节剂，是由产绿链霉菌（Streptomycesviridocbromogene）发酵产生的Orthosomycin（寡糖类）抗生素二氯异扁枝衣酸酯，通过与细菌核糖体结合来抑制蛋白质的合成，是一种特殊的蛋白质合成抑制剂。阿维拉霉素为中性，呈无色针状结晶，熔点为 181～182℃，微溶于水，易溶于丙酮、丙醇、乙酸乙酯、苯和乙醚等有机溶剂中。阿维拉霉素约有 A、A′、B、C、D1、D2、E、F、G、H、I、J、K 等十多个组分，其中 A 组分活性最高。
阿维拉霉素主要抑制革兰阳性菌，对革兰阴性菌效果较差，具有稳定而良好的促生长和预防动物疾病的双重效果，安全性高、残留极低、无交叉耐药性、对环境无影响等优点，能够提高猪和肉鸡的平均日增重。众多的国家和地区如拉丁美洲、亚洲和欧洲均允许将阿维拉霉素作为一种抗菌促生长剂添加于猪鸡饲料中。
目前，阿维拉霉素主要采用传统的斜面培养，接种环挖块接种摇瓶，摇瓶再接种子罐工艺，制种工艺繁琐，菌种容易退化，发酵结果不稳定，稳定性差。
现有技术如授权公告号为CN102936608B的中国发明专利，公开了一种微生物发酵生产阿维拉霉素的方法，包括以下步骤：制备产绿链霉菌的带孢子斜面，将斜面孢子接种子瓶培养得到种子液，种子液在液氮下保存；将冻存种子液接种到种子培养基中进行种子培养得到种子液；按 5wt% 的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；发酵后的发酵液进一步处理得到阿维拉霉素的晶体。该方法发酵得到的阿维拉霉素的效价较低，且得到的阿维拉霉素中A组分比例不高，得到的阿维拉霉素的生物活性有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作步骤简单，成本低廉，发酵得到的阿维拉霉素的效价高，A组分所占比例大，生物活性高的微生物发酵高产阿维拉霉素的方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一株绿色链霉菌，保藏号为CGMCC No.13119，鉴定为Streptomyces virichromodenes，于2016年10月17日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）中。
一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，制备步骤为：
1）斜面培养：将保藏号为CGMCC No.13119的绿色链霉菌接种到斜面培养基上，进行斜面培养。斜面培养基成份及其重量份为：玉米淀粉20~30份、酵母浸出膏20~30份、葡萄糖15~27份、KNO31.2~2.4份、K2HPO40.7~1.5份、CaCl22.0~2.7份、琼脂25~34份、大豆蛋白胨10~16份和水200~300份。斜面培养基pH为7.0~7.4，培养温度为27~30℃，培养周期为4~6天；
2）种子培养：将步骤1斜面培养得到的孢子接种到种子培养基中，培养得到种子液。种子培养基成份及其重量份为：黄豆饼粉16~22份、酵母粉2.6~3.0份、葡萄糖2.8~5份、L-缬氨酸2.4~2.5份和水400~500份。种子培养基pH为7.0~7.4，培养温度为27~30℃，培养时间为2~3天，转速为200~230rpm，通气比1:0.9~1.02vvm；
3）发酵培养：将步骤2得到的种子液接种到发酵培养基中，采用氧载体强化氧传递双液相发酵法进行发酵培养；其中，发酵培养基成份及其重量份为：废糖蜜15~22份、国库陈粮10~16份、可溶性淀粉10~13份、葡萄糖5~8份、豆粕粉7~18份、尿囊素0.04~0.07份、甘露醇7.5~8.2份、L-缬氨酸2.4~2.5份、肌醇烟酸酯0.02~0.05份、大豆蛋白胨5.6~6.3份、MgSO40.52~0.61份、（NH4）2SO40.52~0.61份和CaCO30.52~0.61份。培养基初始pH为7.0~7.4，培养温度为27~30℃，通气比 1:0.75~0.83vvm，罐压为0.066~0.075MPa，转速为110~126rpm ，发酵时间为4~8天。上述发酵培养基能满足绿色链霉菌对碳源、氮源以及各种生长因子的需求，新陈代谢和生长繁殖速度快，产阿维拉霉素的效率高，产量达到3.56g/L以上；改善了阿维拉霉素A组分与B组分的比例，生物活性最高的A组分的比例大幅提升，得到的阿维拉霉素的生物活性高，可减少在饲料中的投放量，降低成本。发酵过程中用20~35%碱水控制发酵罐pH 为6.5~7.0，并补加补料，补加葡萄糖，维持发酵过程中还原糖浓度为12~22g/L，20~21h补加0.4~0.6%豆油，24~25h一次性补加0.22~0.27%L-缬氨酸，之后每隔46~48h补加0.09~0.11%L-缬氨酸；
4）提纯：将步骤3得到的发酵液以2.0~4.0MPa的压力进行高压压滤，得到的阿维拉霉素滤饼用甲醇浸提，阿维拉霉素滤饼：甲醇料液比为1g：25~38ml，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉霉素晶体。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明简单易行，不需要频繁的进行菌种分纯复壮，节省了时间和人力资源；2）发酵培养基能满足绿色链霉菌对碳源、氮源以及各种生长因子的需求，新陈代谢和生长繁殖速度快，产阿维拉霉素的效率高，产量达到3.56g/L以上；3）改善了阿维拉霉素A组分与B组分的比例，生物活性最高的A组分的比例大幅提升，得到的阿维拉霉素的生物活性高，可减少在饲料中的投放量，降低成本；4）利用废糖蜜、国库陈粮等农副产品下脚料及其结合葡萄糖、蛋白胨作为发酵培养基的混合碳源，发酵生产阿维拉霉素，做到了废物利用，并节约了成本，资源利用率高；5）生产过程绿色环保，产品生物活性高、抗菌效果好、无残留、无交叉耐药性，可有效的促进动物生长和预防动物疾病，保证动物源食品的安全。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，制备步骤为：
1）斜面培养：将保藏号为CGMCC No.13119的绿色链霉菌接种到斜面培养基上，进行斜面培养。斜面培养基成份及其重量份为：玉米淀粉20~30份、酵母浸出膏20~30份、葡萄糖15~27份、KNO31.2~2.4份、K2HPO40.7~1.5份、CaCl22.0~2.7份、琼脂25~34份、大豆蛋白胨10~16份和水200~300份。斜面培养基pH为7.0~7.4，培养温度为27~30℃，培养周期为4~6天；
2）种子培养：将步骤1斜面培养得到的孢子接种到种子培养基中，培养得到种子液。种子培养基成份及其重量份为：黄豆饼粉16~22份、酵母粉2.6~3.0份、葡萄糖2.8~5份、L-缬氨酸2.4~2.5份和水400~500份。种子培养基pH为7.0~7.4，培养温度为27~30℃，培养时间为2~3天，转速为200~230rpm，通气比1:0.9~1.02vvm；
3）发酵培养：将步骤2得到的种子液接种到发酵培养基中，采用氧载体强化氧传递双液相发酵法进行发酵培养；其中，发酵培养基成份及其重量份为：废糖蜜15~22份、国库陈粮10~16份、可溶性淀粉10~13份、葡萄糖5~8份、豆粕粉7~18份、尿囊素0.04~0.07份、甘露醇7.5~8.2份、L-缬氨酸2.4~2.5份、肌醇烟酸酯0.02~0.05份、大豆蛋白胨5.6~6.3份、MgSO40.52~0.61份、（NH4）2SO40.52~0.61份和CaCO30.52~0.61份。培养基初始pH为7.0~7.4，培养温度为27~30℃，通气比 1:0.75~0.83vvm，罐压为0.066~0.075MPa，转速为110~126rpm ，发酵时间为4~8天。上述发酵培养基能满足绿色链霉菌对碳源、氮源以及各种生长因子的需求，新陈代谢和生长繁殖速度快，产阿维拉霉素的效率高，产量达到3.56g/L以上；改善了阿维拉霉素A组分与B组分的比例，生物活性最高的A组分的比例大幅提升，得到的阿维拉霉素的生物活性高，可减少在饲料中的投放量，降低成本。发酵过程中用20~35%碱水控制发酵罐pH 为6.5~7.0，并补加补料，补加葡萄糖，维持发酵过程中还原糖浓度为12~22g/L，20~21h补加0.4~0.6%豆油，24~25h一次性补加0.22~0.27%L-缬氨酸，之后每隔46~48h补加0.09~0.11%L-缬氨酸；
4）提纯：将步骤3得到的发酵液以2.0~4.0MPa的压力进行高压压滤，得到的阿维拉霉素滤饼用甲醇浸提，阿维拉霉素滤饼：甲醇料液比为1g：25~38ml，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉霉素晶体。
实施例2：
一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，制备步骤为：
1）斜面培养：将保藏号为CGMCC No.13119的绿色链霉菌接种到斜面培养基上，进行斜面培养。斜面培养基成份及其重量份为：玉米淀粉20份、酵母浸出膏20份、葡萄糖15份、KNO31.2份、K2HPO41.5份、CaCl22.7份、琼脂25份、大豆蛋白胨16份和水300份。斜面培养基pH为7.2，培养温度为28℃，培养周期为5天；
2）种子培养：将步骤1斜面培养得到的孢子接种到种子培养基中，培养得到种子液。种子培养基成份及其重量份为：黄豆饼粉16份、酵母粉3.0份、葡萄糖2.8份、L-缬氨酸2.5份和水500份。种子培养基pH为7.2，培养温度为28℃，培养时间为2天，转速为220rpm，通气比1:0.9vvm；
3）发酵培养：将步骤2得到的种子液接种到发酵培养基中，采用氧载体强化氧传递双液相发酵法进行发酵培养；其中，发酵培养基成份及其重量份为：废糖蜜15份、国库陈粮10份、可溶性淀粉13份、葡萄糖5份、豆粕粉7份、尿囊素0.04份、甘露醇7.5份、L-缬氨酸2.4份、肌醇烟酸酯0.02份、大豆蛋白胨5.6份、MgSO40.52份、（NH4）2SO40.52份和CaCO30.52份。培养基初始pH为7.2，培养温度为28℃，通气比 1:0.8vvm，罐压为0.07MPa，转速为120rpm ，发酵时间为6天。上述发酵培养基能满足绿色链霉菌对碳源、氮源以及各种生长因子的需求，新陈代谢和生长繁殖速度快，产阿维拉霉素的效率高，产量达到3.56g/L；改善了阿维拉霉素A组分与B组分的比例，生物活性最高的A组分的比例大幅提升，得到的阿维拉霉素的生物活性高，可减少在饲料中的投放量，降低成本。发酵过程中用30%碱水控制发酵罐pH 为6.8，并补加补料，补加葡萄糖，维持发酵过程中还原糖浓度为17g/L，20~21h补加0.4%豆油，24h一次性补加0.25%L-缬氨酸，之后每隔48h补加0.1% L-缬氨酸；
4）提纯：将步骤3得到的发酵液以2.7MPa的压力进行高压压滤，得到的阿维拉霉素滤饼用甲醇浸提，阿维拉霉素滤饼：甲醇料液比为1g：30ml，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉霉素晶体。
实施例3：
一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，最优选制备步骤为：
1）斜面培养：将保藏号为CGMCC13119的绿色链霉菌接种到斜面培养基上，进行斜面培养。斜面培养基成份及其最优选重量份为：玉米淀粉28份、酵母浸出膏24份、葡萄糖23份、KNO31.9份、K2HPO41.1份、CaCl22.4份、琼脂30份、大豆蛋白胨13份和水250份。斜面培养基pH为7.2，培养温度为28℃，培养周期为5天；
2）种子培养：将步骤1斜面培养得到的孢子接种到种子培养基中，培养得到种子液。种子培养基成份及其最优选重量份为：黄豆饼粉20份、酵母粉2.8份、葡萄糖3.8份、L-缬氨酸2.4份和水460份。种子培养基pH为7.2，培养温度为28℃，培养时间为2天，转速为220rpm，通气比1:0.95vvm；
3）发酵培养：将步骤2得到的种子液接种到发酵培养基中，采用氧载体强化氧传递双液相发酵法进行发酵培养；其中，发酵培养基成份及其最优选重量份为：废糖蜜20份、国库陈粮14份、可溶性淀粉12份、葡萄糖6份、豆粕粉15份、尿囊素0.05份、甘露醇8份、L-缬氨酸2.4份、肌醇烟酸酯0.04份、大豆蛋白胨6份、MgSO40.57份、（NH4）2SO40.57份和CaCO30.57份。培养基初始pH为7.2，培养温度为28℃，通气比 1:0.8vvm，罐压为0.07MPa，转速为120rpm，发酵时间为6天。上述发酵培养基能满足绿色链霉菌对碳源、氮源以及各种生长因子的需求，新陈代谢和生长繁殖速度快，产阿维拉霉素的效率高，产量达到3.69g/L；改善了阿维拉霉素A组分与B组分的比例，生物活性最高的A组分的比例大幅提升，得到的阿维拉霉素的生物活性高，可减少在饲料中的投放量，降低成本。其中，尿囊素和肌醇烟酸酯能够刺激绿色链霉菌在发酵过程中分泌阿维拉霉素A组分，从而达到改善阿维拉霉素A组分与B组分的比例的效果。发酵过程中用30%碱水控制发酵罐pH 为6.8，并补加补料，补加葡萄糖，维持发酵过程中还原糖浓度为17g/L，20~21h补加0.4%豆油，24h一次性补加0.25%L-缬氨酸，之后每隔48h补加0.1% L-缬氨酸；
4）提纯：将步骤3得到的发酵液以2.7MPa的压力进行高压压滤，得到的阿维拉霉素滤饼用甲醇浸提，阿维拉霉素滤饼：甲醇料液比为1g：30ml，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉霉素晶体。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，其特征在于以下步骤：
1）斜面培养：将保藏号为CGMCC No.13119的绿色链霉菌接种到斜面培养基上，进行斜面培养；
2）种子培养：将步骤1斜面培养得到的孢子接种到种子培养基中，培养得到种子液；
3）发酵培养：将步骤2得到的种子液接种到发酵培养基中，采用氧载体强化氧传递双液相发酵法进行发酵培养；
4）提纯：将步骤3得到的发酵液进行高压压滤，得到的阿维拉霉素滤饼用甲醇浸提，浸提液浓缩后结晶得到阿维拉霉素晶体；
其中，所述的发酵培养基成份及其重量份为：废糖蜜15~22份、国库陈粮10~16份、可溶性淀粉10~13份、葡萄糖5~8份、豆粕粉7~18份、尿囊素0.04~0.07份、甘露醇7.5~8.2份、L-缬氨酸2.4~2.5份、肌醇烟酸酯0.02~0.05份、大豆蛋白胨5.6~6.3份、MgSO40.52~0.61份、（NH4）2SO40.52~0.61份和CaCO30.52~0.61份。
2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，其特征在于：所述的斜面培养基成份及其重量份为：玉米淀粉20~30份、酵母浸出膏20~30份、葡萄糖15~27份、KNO31.2~2.4份、K2HPO40.7~1.5份、CaCl22.0~2.7份、琼脂25~34份、大豆蛋白胨10~16份和水200~300份。
3.根据权利要求1所述的一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，其特征在于：所述的斜面培养基pH为7.0~7.4，培养温度为27~30℃，培养周期为4~6天。
4.根据权利要求1所述的一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，其特征在于：所述的种子培养基成份及其重量份为：黄豆饼粉16~22份、酵母粉2.6~3.0份、葡萄糖2.8~5份、L-缬氨酸2.4~2.5份和水400~500份。
5.根据权利要求1所述的一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，其特征在于：所述的种子培养基pH为7.0~7.4，培养温度为27~30℃，培养时间为2~3天，转速为200~230rpm，通气比1:0.9~1.02vvm。
6.根据权利要求1所述的一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，其特征在于：所述的链霉菌发酵培养基初始pH为7.0~7.4，培养温度为27~30℃，通气比 1:0.75~0.83vvm，罐压为0.066~0.075MPa，转速为110~126rpm ，发酵时间为4~8天。
7.根据权利要求1所述的一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，其特征在于：所述的发酵过程中用20~35%碱水控制发酵罐pH 为6.5~7.0，并补加补料，补加葡萄糖，维持发酵过程中还原糖浓度为12~22g/L，20~21h补加0.4~0.6%豆油，24~25h一次性补加0.22~0.27%L-缬氨酸，之后每隔46~48h补加0.09~0.11% L-缬氨酸。
8.根据权利要求1所述的一种微生物发酵高产阿维拉霉素的方法，其特征在于：所述的高压压滤的压力为2.0~4.0MPa，阿维拉霉素滤饼：甲醇料液比为1g：25~38ml。
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