CN112080537B - 一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物制药技术领域，涉及一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法，包括以下步骤：首先将培养好的斜面孢子接种到种子罐培养基中，培养40h‑44h，得到种液，将种液按照10％(V/V)接种量接入发酵培养基中。发酵罐运行至14h‑18h，补入质量0.25％的L‑缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h分别补入发酵质量0.1％的L‑缬氨酸。30h‑34h培养温度由27℃‑28℃降低到25℃‑26℃，34h‑38h补入二价金属离子溶液，使其在发酵液中的浓度为0.0004‑0.0010mol/L，发酵液中副产物含量明显降低。有效解决了发酵液副产物含量高，质量不稳定的问题。
Description
技术领域
本发明属于微生物制药技术领域，具体涉及一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法。
背景技术
阿维拉霉素又称为卑霉素、阿美拉霉素、肥拉霉素，是由绿色产色链霉菌发酵而来，属于寡糖类抗生素。其能够调节动物肠内细菌代谢，能作用于革兰氏阳性菌的核糖体而阻碍蛋白质的合成，对革兰氏阳性菌具有较好的抑制效果，阿维拉霉素安全性高，不易被肠道吸收，毒性小，易降解，对环境污染小，具有很好的应用前景。
阿维拉霉素发酵生产过程中，发酵液中的产物包括A、A'、C、D1、D2、E、F、G、H、I、J、K等十多个组分。其中A组分活性最高，B组分次之。现有生产技术由美国礼来公司所垄断。中国大多数研究停留在摇瓶和小试阶段，尚未做到产业化。其中有文献报道，李国栋在20T罐上进行了3批小试工艺验证，平均效价仅有1590μg/mL。
中国兽药典要求成品使用有关物质的检测方法，含量按照面积归一化法峰面积计算，要求A％+B％≥70％，A％≥60％，B％≤18％，其他单一组分、杂质含量均不得高于6％。而阿维拉霉素发酵生产技术在我国研究现状是：发酵单位低、生产成本高、副产物含量高，且副产物含量不易控制。
发酵工艺中补加L-缬氨酸，能够明显提高阿维拉霉素A的含量，但同时发酵产物中却出现了一种副产物，含量较高。使用阿维拉霉素有关物质检测方法，高效液相色谱图中，阿维拉霉素A的出峰时间与副产物出峰时间比约为1.17，该副产物含量偏高，常超出质量要求。在发酵生产工艺中，既要满足阿维拉霉素A≥60％，又要满足最大单杂含量≤6％，这是十分矛盾并且十分严重的问题，如果不解决此问题，一旦发酵液中该产物含量不符合质量要求，后期提取很难去除，会直接造成成品质量不合格。
发明内容
经研究发现，阿维拉霉素在发酵过程中，在原工艺发酵周期35-70h之间，发酵副产物含量极容易上升，此时各有关物质含量变化最大，发酵液质量具有很大不确定性。
本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，提供了一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法，能够有效降低副产物产量。
本发明采用的具体技术方案是：
一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法，关键是，包括以下步骤：
(1)种子培养
将培养好的绿色产色链霉菌，制成孢子悬浊液，接种到种子培养基中，通气比1.0vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，搅拌转速260rpm-300rpm，28-29℃培养40-44h，得到种液；
(2)发酵培养
将生长好的种液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到发酵培养基中，通气比为1.0vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速300-500rpm，培养至240h，得到阿维拉霉素发酵液。
优选的，所述的步骤(1)中，种子培养基配比(以g/100mL为单位计算)：黄豆饼粉1.0-2.0，酵母粉0.2-0.3，葡萄糖0.5-1.0，玉米淀粉2.0-3.0，氯化钙1.8-2.2，碳酸钙0.1-0.2，余量为水，灭前加氢氧化钠调pH7.0-7.2，种子培养基接种孢子量为0.1-0.3亿孢子/20L。
优选的，所述的步骤(2)中，发酵至14h-18h，补入发酵液质量0.25％的L-缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h各补入发酵质量0.1％的L-缬氨酸；所述L-缬氨酸制成L-缬氨酸水溶液，灭后浓度(W/V)7％，实际补入质量为折干后的质量。
优选的，所述的步骤(2)中，发酵培养温度在30h-34h之前27-28℃，30h-34h后，25℃-26℃培养。
所述的步骤(2)中，发酵在34h-38h，补入二价金属离子溶液，使其在补后发酵液中的浓度为0.0004-0.0010mol/L，所述二价金属离子为铜离子、锌离子或钴离子。
优选的，所述的步骤(2)中，发酵40h补加浓度为50％(W/V)的液化玉米淀粉，每24h补加20kg/m3-28kg/m3，220h停止补加。
优选的，所述的步骤(2)中，所述发酵罐培养基配方(以g/100mL为单位)：玉米淀粉4.0-6.0，葡萄糖0.5-1.5，黄豆饼粉0.5-1.5，氯化钙0.1-0.3，碳酸钙0.4-0.6，氯化钠0.08-0.12硝酸钠0.4-0.8，培养基余量为水，灭前加氢氧化钠调pH7.2-7.4
本发明的有益效果是：本发明在前期14h-18h首次补入L-缬氨酸后，菌体初级代谢加速，在30h-34h降温，菌体初级代谢速率下降，工艺重点在于34h-38h补入二价金属离子溶液，使其在发酵液中的浓度为0.0004-0.0010mol/L，能够有效降低发酵液中副产物的含量。降低该副产物含量的效果，以铜离子为最佳。再辅以补加液化淀粉，能够有效将发酵副产物含量降低到6％以下，降低了发酵液中副产物含量，为成品质量的合格、稳定奠定了基础
附图说明
图1为实施例2发酵液有关物质检测法方法的高效液相色谱图；
图2为对照例发酵液有关物质检测法方法的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明：
放罐发酵液中的阿维拉霉素A、阿维拉霉素B等有关物质含量，使用HPLC进行检测，方法为阿维拉霉素有关物质的检测方法。
对照例
(1)种子培养：
将培养好的绿色产色链霉菌，制成孢子悬浊液，接种到种子培养基中，通气比1.0vvm，罐压0.05MPa搅拌转速260rpm，28℃培养42h，得到种液。
a步骤(1)中所述种子培养基配比(以g/100mL为单位计算)：黄豆饼粉1.5，酵母粉0.25，葡萄糖0.75，玉米淀粉2.5，氯化钙2.0，碳酸钙0.15，余量为水。灭前氢氧化钠调pH至7.1。
b步骤(1)中所述种子培养基，接种孢子量为0.02亿孢子/20L种子培养基。
(2)发酵培养
将步骤(1)中生长好的种液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到发酵培养基中，通气比为1.0vvm，罐压0.04MPa，转速400rpm，继续培养至240h，得到发酵液。
a发酵至16h，补入发酵液质量0.25％的L-缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h各补入发酵质量0.1％的L-缬氨酸，所述L-缬氨酸溶液，灭后浓度(W/V)7％，实际补入质量为折干后的质量。
b步骤(2)发酵培养温度在32h之前28℃，32h后，27℃培养。
c步骤(2)中发酵40h补加浓度为50％的液化玉米淀粉，每24h补加24kg/m3，220h停止补加。
d所述发酵罐培养基配方(以g/100mL为单位计算)：玉米淀粉5.0，葡萄糖1.0，黄豆饼粉1.0，氯化钙0.2，碳酸钙0.5，氯化钠0.1，硝酸钠0.6，培养基余量为水。灭前加氢氧化钠调pH至7.2。
将最终发酵液检测结果统计如表1所示：
| 检测项 | 阿维拉霉素A％ | 阿维拉霉素B％ | 最大单杂％ |
| 对照例 | 66.71 | 10.49 | 11.32 |
实施例1
(1)种子培养：
将培养好的绿色产色链霉菌，制成孢子悬浊液，接种到种子培养基中，通气比1.0vvm，罐压0.04MPa搅拌转速260rpm，28℃培养40h，得到种液。
a步骤(1)中所述种子培养基配比(以g/100mL为单位计算)：黄豆饼粉1.0，酵母粉0.2，葡萄糖0.5，玉米淀粉2.0，氯化钙1.8，碳酸钙0.1，余量为水。灭前加氢氧化钠调pH到7.0。
b步骤(1)中所述种子培养基，接种孢子量为0.01亿孢子/20L。
(2)发酵培养
将步骤(1)中生长好的种液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到发酵培养基中，通气比为1.0vvm，罐压0.04MPa，转速300rpm，继续培养至240h，得到发酵液。
a步骤(2)中发酵至16h，补入发酵液质量0.25％的L-缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h各补入发酵质量0.1％的L-缬氨酸，所述L-缬氨酸溶液，灭后浓度(W/V)7％，实际补入质量为折干后的质量。
b步骤(2)中发酵培养温度在30h之前27℃，30h后，25℃培养。
c40h补加浓度为50％的液化玉米淀粉，每24h补加20kg/m3，220h停止补加。
d步骤(2)中发酵发酵34h补入二价金属离子溶液，使其在补后发酵液中的浓度为0.0004mol/L。所述补入二价金属离子为铜离子，阴离子为氯离子。
e步骤(2)中所述发酵罐培养基配方(以g/100mL为单位计算)：玉米淀粉4.0，葡萄糖0.5，黄豆饼粉1.0，氯化钙0.1，碳酸钙0.4，氯化钠0.08，硝酸钠0.4，培养基余量为水。灭前加氢氧化钠调pH7.2。
将最终发酵液检测结果统计如表2所示：
| 检测项 | 阿维拉霉素A％ | 阿维拉霉素B％ | 最大单杂％ |
| 实施例1 | 72.63 | 9.3 | 5.84 |
实施例2
(1)种子培养：
将培养好的绿色产色链霉菌，制成孢子悬浊液，接种到种子培养基中，通气比1.0vvm，罐压0.05MPa搅拌转速280rpm，28.5℃培养42h，得到种液。
a步骤(1)中所述种子培养基配比(以g/100mL为单位计算)：黄豆饼粉1.5，酵母粉0.25，葡萄糖0.75，玉米淀粉2.5，氯化钙2.0，碳酸钙0.15，余量为水。灭前调pH到7.1。
b步骤(1)中所述种子培养基，接种孢子量为0.02亿孢子/20L。
(2)发酵培养
将步骤(1)中生长好的种液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到发酵培养基中，通气比为1.0vvm，罐压0.05MPa，转速500rpm，继续培养至240h，得到发酵液。
a步骤(2)中发酵至16h，补入发酵液质量0.25％的L-缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h各补入发酵质量0.1％的L-缬氨酸，所述L-缬氨酸溶液，灭后浓度(W/V)7％，实际补入质量为折干后的质量。
b步骤(2)中发酵培养温度在32h之前27.5℃，32h后，25.5℃培养。
c步骤(2)中发酵40h补加浓度为50％的液化玉米淀粉，每24h补加24kg/m3，220h停止补加。
d步骤(2)中发酵36h补入二价金属离子溶液，使其在补后发酵液中的浓度为0.0007mol/L。所述补入二价金属离子为铜离子，阴离子为氯离子。
e步骤(2)中所述发酵罐培养基配方(以g/100mL为单位计算)：玉米淀粉5.0，葡萄糖1.0，黄豆饼粉1.0，氯化钙0.2，碳酸钙0.5，氯化钠0.1，硝酸钠0.6，培养基余量为水。灭前加氢氧化钠调pH7.3。
将最终发酵液检测结果统计如表3所示：
| 检测项 | 阿维拉霉素A％ | 阿维拉霉素B％ | 最大单杂％ |
| 实施例2 | 74.65 | 8.76 | 4.55 |
实施例3
(1)种子培养：
将培养好的绿色产色链霉菌，制成孢子悬浊液，接种到种子培养基中，通气比1.0vvm，罐压0.06MPa搅拌转速300rpm，28℃培养44h，得到种液。
a步骤(1)中所述种子培养基配比(以g/100mL为单位计算)：黄豆饼粉2.0，酵母粉0.3，葡萄糖1.0，玉米淀粉3.0，氯化钙2.2，碳酸钙0.2，余量为水，灭前调pH到7.2。
b种子培养步骤中，接种孢子量为0.03亿孢子/20L。
(2)发酵培养
将步骤(1)中生长好的种液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到发酵培养基中，通气比为1.0vvm，罐压0.06MPa，转速500rpm，继续培养至240h，得到发酵液。
a步骤(2)中发酵至18h，补入发酵液质量0.25％的L-缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h各补入发酵质量0.1％的L-缬氨酸，所述L-缬氨酸溶液是灭后浓度(W/V)7％的水溶液，实际补入质量为折干后的质量。
b步骤(2)中发酵培养温度在34h之前28℃，34h后，26℃培养。
c步骤(2)中发酵40h补加浓度为50％的液化玉米淀粉，每24h补加28kg/m3，220h停止补加。
d步骤(2)中发酵38h补入二价金属离子溶液，使其在补后发酵液中的浓度为0.0010mol/L，所述补入二价金属离子为铜离子，阴离子为氯离子。
e步骤(2)中所述发酵罐培养基配方(以g/100mL为单位计算)：玉米淀粉6.0，葡萄糖1.5，黄豆饼粉1.5，氯化钙0.3，碳酸钙0.6，氯化钠0.12硝酸钠0.8，培养基余量为水。灭前加氢氧化钠调pH7.4。
将最终发酵液检测结果统计如表4所示：
| 检测项 | 阿维拉霉素A％ | 阿维拉霉素B％ | 最大单杂％ |
| 实施例3 | 71.42 | 9.12 | 5.64 |
实施例4
(1)种子培养：
将培养好的绿色产色链霉菌，制成孢子悬浊液，接种到种子培养基中，通气比1.0vvm，罐压0.05MPa搅拌转速280rpm，28.5℃培养42h，得到种液。
a步骤(1)中所述种子培养基配比(以g/100mL为单位计算)：黄豆饼粉1.5，酵母粉0.25，葡萄糖0.75，玉米淀粉2.5，氯化钙2.0，碳酸钙0.15，余量为水。灭前调pH到7.1。
b步骤(1)中所述种子培养基，接种孢子量为0.02亿孢子/20L。
(2)发酵培养
将步骤(1)中生长好的种液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到发酵培养基中，通气比为1.0vvm，罐压0.05MPa，转速500rpm，继续培养至240h，得到发酵液。
a步骤(2)中发酵至16h，补入发酵液质量0.25％的L-缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h各补入发酵质量0.1％的L-缬氨酸，所述L-缬氨酸溶液，灭后浓度(W/V)7％，实际补入质量为折干后的质量。
b步骤(2)中发酵培养温度在32h之前27.5℃，32h后，25.5℃培养。
c步骤(2)中发酵40h补加浓度为50％的液化玉米淀粉，每24h补加24kg/m3，220h停止补加。
d步骤(2)中发酵36h补入二价金属离子溶液，使其在补后发酵液中的浓度为0.0007mol/L，所述补入二价金属离子为铜离子，阴离子为硫酸根离子。
e步骤(2)中所述发酵罐培养基配方(以g/100mL为单位计算)：玉米淀粉5.0，葡萄糖1.0，黄豆饼粉1.0，氯化钙0.2，碳酸钙0.5，氯化钠0.1，硝酸钠0.6，培养基余量为水。灭前加氢氧化钠调pH7.3。
将最终发酵液检测结果统计如表5所示：
| 检测项 | 阿维拉霉素A％ | 阿维拉霉素B％ | 最大单杂％ |
| 实施例4 | 73.63 | 9.68 | 4.75 |
实施例5
(1)种子培养：
将培养好的绿色产色链霉菌，制成孢子悬浊液，接种到种子培养基中，通气比vvm，罐压0.05MPa搅拌转速280rpm，28.5℃培养42h，得到种液。
a步骤(1)中所述种子培养基配比(以g/100mL为单位计算)：黄豆饼粉1.5，酵母粉0.25，葡萄糖0.75，玉米淀粉2.5，氯化钙2.0，碳酸钙0.15，余量为水。灭前调pH到7.1。
b步骤(1)中所述种子培养基，接种孢子量为0.02亿孢子/20L。
(2)发酵培养
将步骤(1)中生长好的种液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到发酵培养基中，通气比为1.0vvm，罐压0.05MPa，转速500rpm，继续培养至240h，得到发酵液。
a步骤(2)中发酵至16h，补入发酵液质量0.25％的L-缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h各补入发酵质量0.1％的L-缬氨酸，所述L-缬氨酸溶液，灭后浓度(W/V)7％，实际补入质量为折干后的质量。
b步骤(2)中发酵培养温度在32h之前27.5℃，32h后，25.5℃培养。
c步骤(2)中发酵40h补加浓度为50％的液化玉米淀粉，每24h补加24kg/m3，220h停止补加。
d步骤(2)中发酵36h补入质量占发酵液质量补入二价金属离子溶液，使其在补后发酵液中的浓度为0.0007mol/L，所述补入二价金属离子为锌离子，阴离子为硫酸根离子。
e步骤(2)中所述发酵罐培养基配方(以g/100mL为单位计算)：玉米淀粉5.0，葡萄糖1.0，黄豆饼粉1.0，氯化钙0.2，碳酸钙0.5，氯化钠0.1，硝酸钠0.6，培养基余量为水。灭前加氢氧化钠调pH7.3。
将最终发酵液检测结果统计如表6所示：
| 检测项 | 阿维拉霉素A％ | 阿维拉霉素B％ | 最大单杂％ |
| 实施例5 | 68.92 | 11.53 | 5.61 |
实施例6
(1)种子培养：
将培养好的绿色产色链霉菌，制成孢子悬浊液，接种到种子培养基中，通气比1.0vvm，罐压0.05MPa搅拌转速280rpm，28.5℃培养42h，得到种液。
a步骤(1)中所述种子培养基配比(以g/100mL为单位计算)：黄豆饼粉1.5，酵母粉0.25，葡萄糖0.75，玉米淀粉2.5，氯化钙2.0，碳酸钙0.15，余量为水。灭前调pH到7.1。
b步骤(1)中所述种子培养基，接种孢子量为0.02亿孢子/20L。
(2)发酵培养
将步骤(1)中生长好的种液，按照发酵罐接后体积10％的量，接种到发酵培养基中，通气比为1.0vvm，罐压0.05MPa，转速500rpm，继续培养至240h，得到发酵液。
a步骤(2)中发酵至16h，补入发酵液质量0.25％的L-缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h各补入发酵质量0.1％的L-缬氨酸，所述L-缬氨酸溶液，灭后浓度(W/V)7％，实际补入质量为折干后的质量。
b步骤(2)中发酵培养温度在32h之前27.5℃，32h后，25.5℃培养。
c步骤(2)中发酵40h补加浓度为50％的液化玉米淀粉，每24h补加24kg/m3，220h停止补加。
d步骤(2)中发酵36h补入质量占发酵液质量补入二价金属离子溶液，使其在补后发酵液中的浓度为0.0007mol/L。所述补入二价金属离子为钴离子，阴离子为氯离子。
e步骤(2)中所述发酵罐培养基配方(以g/100mL为单位计算)：玉米淀粉5.0，葡萄糖1，黄豆饼粉1，氯化钙0.2，碳酸钙0.5，氯化钠0.1，硝酸钠0.6，培养基余量为水。灭前加氢氧化钠调pH7.3。
将最终发酵液检测结果统计如表7所示：
| 检测项 | 阿维拉霉素A％ | 阿维拉霉素B％ | 最大单杂％ |
| 实施例6 | 67.81 | 12.76 | 5.91 |
与对照组方法相比，使用实施例方法后，发酵液中的副产物含量均得到明显降低，其中以实施例2降幅最为显著，由11.32％降低至4.55％，解决了提取阶段副产物含量难以降低的难题，为阿维拉霉素成品质量合格奠定基础。
Claims (5)
1.一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）种子培养
将培养好的绿色产色链霉菌，制成孢子悬浊液，接种到种子培养基中，通气比1.0vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，搅拌转速260rpm-300rpm，28-29℃培养40-44h，得到种液；
（2）发酵培养
将生长好的种液，按照发酵罐接后体积10%的量，接种到发酵培养基中，通气比为1.0vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速300-500rpm，培养至240h，得到阿维拉霉素发酵液；
所述的步骤（2）中，发酵至14h-18h，补入发酵液质量0.25%的L-缬氨酸，发酵至40h、64h、88h、156h各补入发酵质量0.1%的L-缬氨酸；所述L-缬氨酸制成L-缬氨酸水溶液，灭后浓度（W/V）7%，实际补入质量为折干后的质量；
所述的步骤（2）中，发酵在34h-38h，补入二价金属离子溶液，使其在补后发酵液中的浓度为0.0004-0.0010mol/L，所述二价金属离子为铜离子、锌离子或钴离子。
2.权利要求1中所述一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，种子培养基配比以g/100mL为单位计算：黄豆饼粉1.0-2.0，酵母粉0.2-0.3，葡萄糖0.5-1.0，玉米淀粉2.0-3.0，氯化钙 1.8-2.2，碳酸钙 0.1-0.2，余量为水，灭前加氢氧化钠调pH 7.0-7.2，种子培养基接种孢子量为0.1-0.3亿孢子/20L。
3.权利要求1中所述一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，发酵培养起始温度控制在27-28℃，发酵至30h-34h，降低温度至25℃-26℃培养。
4.权利要求1中所述一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，发酵40h补加浓度为50%（W/V）的液化玉米淀粉，每24h补加20kg/m³-28kg/m³，220h停止补加。
5.权利要求1中所述一种降低阿维拉霉素发酵液中副产物含量的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，所述发酵培养基配方以g/100mL为单位：玉米淀粉4.0-6.0，葡萄糖0.5-1.5，黄豆饼粉0.5-1.5，氯化钙 0.1-0.3，碳酸钙 0.4-0.6，氯化钠 0.08-0.12，硝酸钠0.4-0.8，培养基余量为水，灭前加氢氧化钠调pH 7.2-7.4。
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