CN111893077A - 一种丁酸梭菌的规模化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丁酸梭菌的规模化生产方法。该方法包括以下步骤：1)将斜面培养的丁酸梭菌菌落配制成丁酸梭菌菌悬液；2)将丁酸梭菌菌悬液接种到种子罐的发酵液中，厌氧培养至对数生长期，获得发酵菌种；3)将发酵菌种接入发酵罐的发酵液中，进行规模化厌氧发酵生产，得到活菌数大于10⁸CFU/ml的丁酸梭菌制品。该方法将斜面培养基上丁酸梭菌菌苔制备成丁酸梭菌菌悬液，然后接入种子罐中进行厌氧发酵，实验结果表明，其可取得丁酸梭菌发酵种子液相同的发酵效果。该方法不需要二级扩培，在整个工艺流程上，缩短了至少一个一级种子发酵周期。与此同时，也减少了至少一次菌种传代，降低了因菌种传代过多而导致菌种变异的风险。

Description

一种丁酸梭菌的规模化生产方法

技术领域

本发明属于丁酸梭菌的培养领域，具体涉及一种丁酸梭菌的规模化生产方法。

背景技术

丁酸梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，在生长过程中对厌氧环境要求极高，采用一般的液体深层发酵方式进行培养，菌体浓度低，培养困难，生产成本高，制约了其工业化生产。

申请公布号为CN110846258A的中国发明专利申请即公开了一种典型的丁酸梭菌发酵工艺，包括一级种子制备、二级种子制备以及发酵接种。目前，丁酸梭菌的规模化生产多采用以下两级发酵工艺：

(1)将丁酸梭菌茄瓶斜面接种于液体培养基进行厌氧培养，获得丁酸梭菌种液。

(2)一级种液发酵：将步骤(1)所制得的丁酸梭菌种液按设定的接种比例接入种子罐中的发酵液进行厌氧培养，种子罐中的丁酸梭菌培养至对数生长期时，获得发酵菌种。

(3)二级发酵培养：将步骤(2)制得的发酵菌种接入发酵罐中，厌氧培养至丁酸梭菌完全转孢。

根据不同工艺需求，以上两级发酵中接种比例介于1％-10％之间。目前规模化生产用丁酸梭菌种子罐体积达到500L以上，有效容纳体积达350L。在采用10％接种量的生产工艺中，所需要的的丁酸梭菌一级种液达35L。此时生产工艺应作出如下调整：

(1)将丁酸梭菌茄瓶斜面接种于液体培养基进行厌氧培养，获得丁酸梭菌种液。

(2)一级种液发酵：将步骤(1)制得的丁酸梭菌种液扩培至50L发酵罐内进行厌氧培养，可制得35L丁酸梭菌一级种液。

(3)二级种液发酵：将步骤(2)制得的丁酸梭菌种液按设定的接种比例接入种子罐中的发酵液内进行厌氧培养，种子罐中的丁酸梭菌培养至对数生长期时，获得发酵菌种。

(4)三级发酵培养：将步骤(3)制得的发酵菌种接入发酵罐中，厌氧培养至丁酸梭菌完全转孢。

经由以上调整后，生产工艺改为三级发酵，菌种传代次数液较之前工艺多了一代。在发酵行业工业化大生产中，经常会出现因菌种传代次数过多而引起菌种变异的情况，菌种变异将直接导致该批次产品报废；其次，工业化生产中，增加一级发酵，不仅延长整个生产周期，而且提高了生产成本；与此同时，多级发酵会增加污染的风险；而三级发酵过程中，对丁酸梭菌种液的需求量较大，基于小容积发酵罐(50L)的数量限制，以上三级发酵工艺并不利于工业化的连续生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌的规模化生产方法，以解决现有方法对丁酸种液需求量大、丁酸传代次数多以及生产周期长的问题。

为实现上述目的，本发明的丁酸梭菌的规模化生产方法的技术方案是：

一种丁酸梭菌的规模化生产方法，包括以下步骤：

1)将斜面培养的丁酸梭菌菌落配制成丁酸梭菌菌悬液；

2)将丁酸梭菌菌悬液接种到种子罐的发酵液中，厌氧培养至对数生长期，获得发酵菌种；丁酸梭菌菌悬液和发酵液形成培养液，丁酸梭菌的接种量控制在所述培养液中丁酸梭菌的活菌数为10²CFU/ml以上；

3)将发酵菌种接入发酵罐的发酵液中，进行规模化厌氧发酵生产，得到活菌数大于10⁸CFU/ml的丁酸梭菌制品。

本发明的丁酸梭菌的规模化生产方法，将斜面培养基上丁酸梭菌菌苔制备成丁酸梭菌菌悬液，然后接入种子罐中进行厌氧发酵，实验结果表明，其可取得丁酸梭菌发酵种子液相同的发酵效果。该方法不需要二级扩培，在整个工艺流程上，缩短了至少一个一级种子发酵周期。与此同时，也减少了至少一次菌种传代，降低了因菌种传代过多而导致菌种变异的风险。

以500L发酵罐的生产工艺为例，对传统丁酸梭菌发酵种子液的需求量达到3.5L，而该方法所需丁酸梭菌菌悬液的体积一般不足500ml。可以一次制备多支丁酸梭菌茄瓶斜面，在车间连续生产时候分批次使用，保证工业化生产连续进行，极大程度上缩短生产流程，提高生产效率。

优选的，步骤2)中，丁酸梭菌的接种量控制在所述培养液中丁酸梭菌的活菌数为10²-10⁴CFU/ml。丁酸梭菌的接种量过大，对整个发酵过程无显著影响，发酵液中丁酸梭菌活菌数无显著增加，对工业生产的经济性不利。

步骤2)中，针对350L发酵液，丁酸梭菌菌悬液的用量为300-500ml，300-500ml丁酸梭菌菌悬液含有的活菌总数为10⁶-10⁹CFU。

步骤3)中，发酵菌种的接种体积为1-10％。接种体积过小，不利于制得活菌数高的发酵产品，接种体积过大，对制品活菌数的提高无显著影响，对工业生产的经济性不利。

优选的，所述配制成丁酸梭菌菌悬液包括以下步骤：向培养有丁酸梭菌的斜面上加入无菌生理盐水，用无菌接种铲将斜面上的菌苔刮落，制备成菌悬液，然后加入无菌生理盐水混合。丁酸梭菌菌悬液制备过程中使用无菌生理盐水混合是为了保持细胞的渗透压，从而保证丁酸梭菌的活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。

以下实施例中，种子罐培养基组分为：葡萄糖：15-20g/L，蛋白胨：10-15g/L，酵母膏：5-10g/L，牛肉膏：5-10g/L，硫酸镁：0.1-0.5g/L，硫酸锰：0.01-0.04g/L，L-半胱氨酸盐酸盐：0.1-0.5g/L，溶剂为水；各原料混合均匀后，115℃灭菌30分钟。

发酵罐培养基组分为：葡萄糖：10-15g/L，酵母膏：10-15g/L，氯化钠：1-5g/L，牛肉粉：5-10g/L，碳酸氢钠:0.2-0.8g/L，磷酸二氢钾：1-5g/L，硫酸锰：0.01-0.04g/L，碳酸钙0.1-0.5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐：0.2-0.5g/L，溶剂为水；各原料混合均匀后，115℃灭菌30分钟。

一、本发明的丁酸梭菌的规模化生产方法的具体实施例

本实施例的丁酸梭菌的规模化生产方法，包括以下步骤：

1)将斜面培养的丁酸梭菌菌落配制成丁酸梭菌菌悬液，具体步骤如下：

①配丁酸梭菌种子培养基，将配好的培养基分装到茄瓶后灭菌，灭过菌的茄瓶放在适宜高度铺成茄瓶斜面。

②从超低温冰箱取出甘油保藏的丁酸梭菌种液，将其接在丁酸梭菌茄瓶斜面上，接种好的茄瓶斜面厌氧培养。

③选取菌落均匀，颜色一致的无菌茄瓶斜面备用。

④准备无菌生理盐水、无菌接种铲、无菌接种瓶。

⑤在洁净区内，使用超净工作台进行以下操作：在酒精灯火焰保护下，将适宜无菌生理盐水倒入茄瓶，用无菌接种铲将斜面上的菌苔刮落下来，按以上操作步骤逐个刮掉茄瓶内的菌苔制备成菌悬液。

⑥在酒精灯火焰保护下，将制备好的菌悬液倒入无菌接种瓶中，随后倒入300ml无菌生理盐水。

2)将丁酸梭菌菌悬液接种到种子罐的发酵液中，厌氧培养至对数生长期，获得发酵菌种。

种子罐的体积为500L，其中发酵液的体积为350L；丁酸梭菌菌悬液接种到发酵液中，整体形成培养液，接种量控制丁酸梭菌活菌数为10²-10⁴CFU/ml。此时，对应丁酸梭菌菌悬液的接种量为300-500ml，其中所含丁酸梭菌活菌总数为10⁶-10⁹CFU。

种子罐的发酵液组成(培养基组分)为：葡萄糖：17g/L，蛋白胨：12g/L，酵母膏：8g/L，牛肉膏：8g/L，硫酸镁：0.3g/L，硫酸锰：0.03g/L，L-半胱氨酸盐酸盐：0.3g/L，溶剂为水；各原料混合均匀后，115℃灭菌30分钟。

厌氧培养的工艺条件为：将丁酸梭菌菌悬液接种至500L丁酸梭菌种子罐内后，37℃厌氧培养至pH值处于5.5-6.5，吸光度0.4-0.7。

3)将发酵菌种以体积比1％接种到发酵罐(发酵罐体积为达到20-35吨，最大盛装发酵液按照70％计算)中，厌氧培养至丁酸梭菌完全转孢。

发酵罐的发酵液组成(培养基组分)为：葡萄糖：12g/L，酵母膏：13g/L，氯化钠：3g/L，牛肉粉：7g/L，碳酸氢钠:0.5g/L，磷酸二氢钾：3g/L，硫酸锰：0.03g/L，碳酸钙0.3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐：0.3g/L，溶剂为水；各原料混合均匀后，115℃灭菌30分钟。

厌氧培养的工艺条件为：将培养好的丁酸种液以1％接种量接入20T发酵罐内，厌氧培养，当pH低于5.5时，补加30％的灭菌后的小苏打，使pH维持在5.5-6.0之间，厌氧培养时间为36h。

二、对比例

对比例的丁酸梭菌的规模化生产方法，包括以下步骤：

1)将丁酸梭菌茄瓶斜面接种于液体培养基进行厌氧培养，获得3.5L丁酸梭菌种液。

2)一级种子液发酵：将将步骤1)所得3.5L丁酸梭菌种液以1％的体积比接种到种子罐中的发酵液(发酵液共350L)中进行厌氧培养，待丁酸梭菌培养至对数生长期时，获得发酵菌种。

3)将发酵菌种以体积比1％接种到发酵罐中，厌氧培养至丁酸梭菌完全转孢。。

对比例所使用的发酵液与厌氧培养工艺与实施例相同。

三、实验例

实验例1

按照以上对比例和实施例的方法，将实施例的菌悬液所含的活菌总数调整至对比例中3.5L丁酸梭菌菌液(丁酸种液)所含的活菌总数为同一数量级，测定接种到种子罐中的0h活菌数和之后在丁酸梭菌发酵罐中含菌量，结果如表1-表3所示。

表1 0h活菌数为9-28CFU/ml情况下的发酵效果对比

表2 0h活菌数为10²CFU/ml级别下的发酵效果对比

表3 0h活菌数为10³CFU/ml级别下的发酵效果对比

由上述数据可知，在0h活菌数基本相同的情况下，将接种入种子罐的3.5L丁酸梭菌一级种子液替换为活菌数基本相同的丁酸梭菌菌悬液。在后续工艺不变条件下，丁酸梭菌厌氧发酵后1ml丁酸梭菌含菌量无明显差异。

实验例2

选取活菌总数为菌悬液的活菌总数为10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰CFU的丁酸梭菌菌悬液分别接入500L的丁酸梭菌一级种子罐内，其他工艺相同情况下，发酵效果如表4和表5所示。

表4不同活菌总数(10⁵、10⁹、10¹⁰CFU)的丁酸梭菌菌悬液发酵效果

表5不同活菌总数(10⁶、10⁷、10⁸CFU)的丁酸梭菌菌悬液发酵效果

通过上述实验可得知：在丁酸梭菌种子罐0h活菌数处于10²～10⁴CFU/ml(第四组-第六组)，即接入的丁酸梭菌活菌总数处于10⁶～10⁹CFU时，丁酸梭菌在一级种子罐内生长至对数生长期所需要的时间相差无几，活菌数基本一致。在后续工艺不变条件下，丁酸梭菌厌氧发酵后1ml丁酸梭菌含菌量无明显差异。

若丁酸梭菌种子罐0h活菌数处于10(CFU/ml)以下，即接入的丁酸梭菌活菌总数低于10⁵CFU时，丁酸梭菌在一级种子罐内生长至对数生长期所需要的时间过长，活菌数太低。在后续工艺不变条件下，丁酸梭菌厌氧发酵后1ml丁酸梭菌含菌量显著降低。所以，接入丁酸梭菌菌悬液活菌数过低，延长整个发酵进程，发酵液中丁酸梭菌活菌数显著降低。不仅耽误生产进程，而且影响产量。

而当丁酸梭菌种子罐0h活菌数处于10⁴(CFU/ml)以上，即接入的丁酸梭菌活菌总数高达到10¹⁰CFU时，丁酸梭菌在一级种子罐内生长至对数生长期所需要的时间几乎相同，活菌数比之略高。在后续工艺不变条件下，丁酸梭菌厌氧发酵后1ml丁酸梭菌含菌量无明显差异。由此可得知：增加接入种子罐丁酸梭菌活菌总数对整个发酵过程无显著影响，发酵液中丁酸梭菌活菌数无显著增加。

综上所述，在接种量为1％，种子罐体积为500L的生产工艺中，将接入丁酸梭菌菌悬液活菌总数定为10⁶～10⁹CFU，工业大规模生产的经济性最佳。

实验例3

参考实施例的方式，将丁酸梭菌菌悬液分别接种到50L、500L、1000L种子罐中进行厌氧培养，然后再将种子罐中所制得的发酵菌种接种到丁酸梭菌发酵罐中进行发酵培养，结果如表6所示。

表6实施例的方法在不同容积种子罐中的发酵效果

通过表6的实验结果可知，通过调整接入时的活菌总数，保证0h活菌数达到10²-10⁴CFU/ml，即可大规模发酵制得活菌数在10⁸CFU/ml以上的丁酸梭菌制品。

实验例4

以上对比例以及实验例是以1％的接种比例，分别接种到种子罐、发酵罐中进行发酵培养，本试验例考察不同接种比例的发酵效果，结果如表7-表12所示。

表7接种比例为3％的发酵效果

表8接种比例为5％的发酵效果

表9接种比例为7％的发酵效果

表10接种比例为10％的发酵效果

表11接种比例为0.15％的发酵效果

表12接种比例为15％的发酵效果

由以上实验结果可知，接种量在1-10％的范围内实施的工业经济性最佳，接种量小于1％，所得制品的活菌数太少，接种大于10％，活菌数并无明显增加。在实际工业生产中，可根据不同生产工艺，使接种量处于1-10％，从而保证工业生产的经济性。

Claims (5)

1.一种丁酸梭菌的规模化生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将斜面培养的丁酸梭菌菌落配制成丁酸梭菌菌悬液；

2)将丁酸梭菌菌悬液接种到种子罐的发酵液中，厌氧培养至对数生长期，获得发酵菌种；丁酸梭菌菌悬液和发酵液形成培养液，丁酸梭菌的接种量控制在所述培养液中丁酸梭菌的活菌数为10²CFU/ml以上；

3)将发酵菌种接入发酵罐的发酵液中，进行规模化厌氧发酵生产，得到活菌数大于10⁸CFU/ml的丁酸梭菌制品。

2.如权利要求1所述的丁酸梭菌的规模化生产方法，其特征在于，步骤2)中，丁酸梭菌的接种量控制在所述培养液中丁酸梭菌的活菌数为10²-10⁴CFU/ml。

3.如权利要求1或2所述的丁酸梭菌的规模化生产方法，其特征在于，步骤2)中，针对350L发酵液，丁酸梭菌菌悬液的用量为300-500ml，300-500ml丁酸梭菌菌悬液含有的活菌总数为10⁶-10⁹CFU。

4.如权利要求1所述的丁酸梭菌的规模化生产方法，其特征在于，步骤3)中，发酵菌种的接种体积为1-10％。

5.如权利要求1、2或4所述的丁酸梭菌的规模化生产方法，其特征在于，所述配制成丁酸梭菌菌悬液包括以下步骤：向培养有丁酸梭菌的斜面上加入无菌生理盐水，将斜面上的菌苔刮落，制备成菌悬液，然后加入无菌生理盐水混合。