CN114231461B - 一种丁酸梭菌、组合物及应用与丁酸梭菌的发酵培养方法 - Google Patents

一种丁酸梭菌、组合物及应用与丁酸梭菌的发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丁酸梭菌、组合物及应用与丁酸梭菌的发酵培养方法，所述丁酸梭菌的名称为JH‑59，分类名称为：Clostridiumbutyricum，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211447，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，丁酸梭菌JH‑59具有优异的益生特性。所述组合物包括丁酸梭菌JH‑59，丁酸梭菌JH‑59或所述组合物可用于饲料、食品或肥料。所述丁酸梭菌的发酵培养方法是将丁酸梭菌的种子液接种至一种新型的发酵培养基中进行发酵培养，发酵转孢率可达90％以上。

Description

一种丁酸梭菌、组合物及应用与丁酸梭菌的发酵培养方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种丁酸梭菌、组合物及应用与丁酸梭菌的发酵培养方法。
背景技术
丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)又名丁酸梭状芽孢杆菌、酪酸梭菌，其是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，主要存在于土壤、树叶、人和动物肠道中，干酪、自然发酵的酸奶、酒曲和窖泥中也可以发现丁酸梭菌。丁酸梭菌具有耐高温、耐酸和耐多种抗生素等生物学特性，能产丁酸、乳酸和乙酸。丁酸梭菌对环境变化具有一定的抗性，丁酸梭菌通过动物肠道时，能耐受胃酸及胆汁酸盐，具有极强的整肠作用，抑制肠道内致病菌的生长，促进肠道中有益菌的增殖，并产生益生物质，从而提高机体的免疫能力。丁酸梭菌的益生特性使其广泛应用于饲料、保健食品、医药、微生物菌肥等领域。
由于不同株的丁酸梭菌性能差异较大，所以筛选获得一株综合性能优异的丁酸梭菌具有重要意义。此外，在传统发酵生产的发酵方法中，转孢率很低，多以营养体(无芽孢)的产量作为丁酸梭菌的产量，但由于丁酸梭菌属于严格厌氧菌，所以丁酸梭菌的营养体接触空气后极易失活，增加了长期保存及运输的难度，因此，在发酵生产丁酸梭菌的过程中，转孢率是衡量发酵生产丁酸梭菌的质量的重要指标。发酵培养基的配方是转孢率的关键影响因素之一，因此，研发一种用于丁酸梭菌的发酵培养基以提升发酵生产丁酸梭菌的转孢率是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种丁酸梭菌、组合物及应用与丁酸梭菌的发酵培养方法。
本发明的技术方案如下所述：
第一方面，本发明提供了一种丁酸梭菌，所述丁酸梭菌的名称为JH-59，分类名称为：Clostridiumbutyricum，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211447，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。
第二方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括如第一方面中所述的丁酸梭菌。
进一步地，所述组合物还包括可接受的辅料。
第三方面，本发明提供了如第一方面中所述的丁酸梭菌或如第二方面中任意一种所述的组合物在制备饲料、食品或肥料中的应用。
第四方面，本发明提供了一种用于丁酸梭菌的发酵培养基，按照质量份数计算，所述发酵培养基包括：3份至8份的速效碳源、22.5份至34份的迟效碳源、7份至15份的酵母浸出物、5份至10份的发酵豆粕、5份至10份的乙酸钠、2份至5份的磷酸氢二钠、0.2份至1.0份的氯化钙、0.5份至2.0份的硫酸镁、0.1份至0.3份的硫酸亚铁以及0.2份至0.3份的硫酸锰。
进一步地，按照质量份数计算，所述迟效碳源包括：20份至30份的第一迟效碳源以及2.5份至4份的第二迟效碳源，其中，丁酸梭菌对所述第二迟效碳源的利用速率慢于丁酸梭菌对所述第一迟效碳源的利用速率。
进一步地，所述速效碳源为葡萄糖，所述第一迟效碳源为玉米淀粉，所述第二迟效碳源为玉米粉。
第五方面，本发明提供了一种丁酸梭菌的发酵培养方法，包括步骤：提供丁酸梭菌的种子液，将所述丁酸梭菌的种子液接种至如第四方面中任意一种所述的发酵培养基中进行发酵培养。
进一步地，所述发酵培养的条件包括：pH为6.0至7.0、温度为35℃至40℃。
进一步地，所述发酵培养的时间为10h至20h。
本发明提供了一种丁酸梭菌、组合物及其应用与丁酸梭菌的发酵培养方法，产生如下的技术效果：
相较于GDMCC1.676丁酸梭菌，本发明的丁酸梭菌JH-59具有更佳的益生特性，具体表现为：丁酸梭菌JH-59对产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、表皮葡萄球菌和猪链球菌均有理想的抑制效果，而GDMCC1.676丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌S、表皮葡萄球菌Sp、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9以及停乳链球菌KYB428均无明显的抑制效果，并且GDMCC1.676丁酸梭菌对无乳链球菌KYB420的抑制效果不如JH-59丁酸梭菌，此外，丁酸梭菌JH-59的产淀粉酶和产酸的性能均优于GDMCC1.676丁酸梭菌。由动物实验可知，相较于GDMCC1.676丁酸梭菌，丁酸梭菌JH-59更有助于提高哺乳仔猪的体重，并显著降低试验仔猪的死亡率和腹泻率。
本发明中丁酸梭菌的发酵培养方法是将丁酸梭菌的种子液接种至一种新型的发酵培养基中进行发酵培养，并结合特定的发酵过程工艺控制，发酵转孢率可达90％以上，当发酵规模为2吨发酵罐时，下罐的发酵液中芽孢浓度可达9.2亿CFU/mL，有效改善传统发酵生产丁酸梭菌存在的转孢率低的问题，有利于提高丁酸梭菌制品的质量。
附图说明
下面结合附图，通过对本发明的具体实施方式详细描述，将使本发明的技术方案及其它有益效果显而易见。
图1为本申请中JH-59和GDMCC1.676的抑菌效果图一，其中，A1至A4分别代表JH-59对CP-1、KYB420、KYB428和S的抑制效果图，B1至B4分别代表GDMCC1.676对CP-1、KYB420、KYB428和S的抑制效果图。
图2为本申请中JH-59和GDMCC1.676的抑菌效果图二，其中，A5至A7分别代表JH-59对SS-2、SS-9和Sp的抑制效果图，B5至B7分别代表GDMCC1.676对SS-2、SS-9和Sp的抑制效果图。
图3为本申请中JH-59和GDMCC1.676的产淀粉酶能力效果图。
图4为本申请实施例1中发酵液的革兰氏染色镜检图。
图5为本申请实施例2的发酵过程中碱液消耗量的变化情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本申请的各个实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，“3份至8份的速效碳源”应当认为从3份到8份的范围描述已经具体公开子范围，如从3份到5份、从3份到6份、从3份到7份、从4份到6份、从4份到7份、从4份到8份、从5份到7份、从5份到8份、从6份到8份等，以及所数范围内的单一数字，例如3份、4份、5份、6份、7份以及8份，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
一、本发明实施例中涉及的抑菌实验说明。
1.1、抑菌实验中涉及的指示菌
表1 指示菌的种类、来源、特性及培养条件
备注：表1中涉及的培养基均购自青岛海博生物技术有限公司，按照厂商条件使用。
1.2、抑菌实验器材
牛津杯：内径为6.0±0.1mm，外径为7.8±0.1mm，高为10.0±0.1mm；
生化培养箱；
CR 22G冷冻高速离心机(Hitachi)。
1.3、抑菌实验方法
Sa、制备丁酸梭菌上清液：将置于甘油管保存的丁酸梭菌活化接种于RCM营养琼脂培养基斜面，在37℃下厌氧培养24h，然后挑取RCM营养琼脂培养基斜面上生长的菌落接种于RCM肉汤液体培养基(采用灭菌液体石蜡液封)，置于37℃下静置培养48h，培养液的菌体浓度为0.42×108CFU/mL，将培养获得的菌液在12000r/min的转速下离心5min，收集上清液以备用；
Sb、将处于对数生长期的指示菌，其OD600达到表2要求，稀释至其使用倍数后涂布于对应的培养基平板上，每种指示菌设置三个平行样；
表2 指示菌的对数期OD600及使用稀释倍数
名称 编号 对数期OD600 稀释倍数 取用量
产气荚膜梭菌 CP-1 0.86 10-1 100μL
金黄色葡萄球菌 S 1.72 10-3 100μL
无乳链球菌 KYB420 1.06 10-3 100μL
停乳链球菌 KYB428 1.13 10-3 100μL
表皮葡萄球菌 Sp 1.42 10-4 100μL
猪链球菌 SS-2 0.39 10-3 100μL
猪链球菌 SS-9 0.52 10-3 100μL
Sc、在涂布有指示菌的培养基平板上等距离放置四个无菌牛津杯；
Sd、向各个牛津杯中分别加入0.15mL的丁酸梭菌上清液，然后置于4℃下扩散24h，再置于37℃下培养24h，采用游标卡尺测量抑菌圈的直径(未扣除牛津杯的直径)，计算每个平板上所有抑菌圈的平均直径值，并拍照记录。
二、本发明实施例中涉及的产淀粉酶能力实验说明
2.1、淀粉酶培养基配方与淀粉酶平板的配制方法
淀粉酶培养基配方：5g的牛肉膏，10g的蛋白胨、2g的可溶性淀粉、20g的琼脂以及1000mL的蒸馏水。
淀粉酶平板的配制方法：将配方中的各个组分混合，然后115℃下灭菌20min，调pH为7.2至7.6，然后倒入至培养皿内，形成7mm厚度的淀粉酶平板。
2.2、实验方法
取100μL的丁酸梭菌上清，于12000r/min下离心5min，收集上清液，然后取2μL的上清液点涂于淀粉酶平板上，每种丁酸梭菌上清液设置两个平行样，置于37℃倒置厌氧培养48h，测量每个透明圈的内径和外径，平行样取平均值，并拍照记录。
三、本发明实施例中涉及的产酸能力实验说明
3.1、产酸能力实验中涉及的培养基
商购的RCM肉汤培养基。
3.2、产酸能力实验中涉及的器材
pH计。
3.3、实验方法
将置于甘油管保存的丁酸梭菌活化接种于RCM营养琼脂培养基斜面，在37℃下厌氧培养24h，然后挑取RCM营养琼脂培养基斜面上生长的菌落接种于RCM肉汤液体培养基(采用灭菌液体石蜡液封)，置于37℃下静置培养48h，获得培养液，培养液的菌体浓度为0.42×108CFU/mL，用pH计测定培养液的pH值。
四、发明实施例中涉及的动物实验说明
4.1、实验动物
选用若干头21日龄健康状况良好、体重接近的“杜长大”哺乳仔猪，随机分成四个组，每组设置两个重复，每个重复15头仔猪，任意两头仔猪之间的出生日期差异在±1天，且任意两头仔猪之间的体重差异在±0.05kg。免疫程序由工作人员按照常规进行，各个组的饲养管理方式和环境条件均相同，实验周期为21天。
4.2、实验试剂
生理盐水；
混合抗生素溶液，由土霉素钙、金霉素、恩拉霉素以及去离子水组成，其中，土霉素钙的浓度为100ppm，金霉素的浓度为75ppm，恩拉霉素的浓度为10ppm；
益生菌剂，由供试丁酸梭菌和葡萄糖组成，其中，供试丁酸梭菌的有效浓度为2.0×107CFU/g；
4.3、实验方法
在实验周期内，每天对对照一组中的各头仔猪灌服生理盐水、对对照二组中的各头仔猪灌服混合抗生素溶液，以及对实验组中的各头仔猪灌服益生菌剂，每次每头仔猪灌服对应试剂的剂量为2mL，每天灌服1次，各个组每次灌服的时间保持一致，记录每头仔猪的初始体重，并每天记录每头仔猪的体重和健康状况，以及计算各个组的21日龄平均体重(Kg/头)、实验周期内的日平均增重(g/d)、实验周期内的日平均采食量(g/d)、体增重/采食量(g/g)以及腹泻率(％)。“21日龄平均体重”是指各组中所有存活仔猪在第21日龄的平均体重，各组取两个重复的平均值，各组中每个重复的所有存活仔猪在第21日龄的平均体重为：所有存活仔猪在第21日龄的总体重/存活头数；“实验周期内的日平均增重”是指各组中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的平均日增重，各组取两个重复的平均值，各组的每个重复中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的平均日增重的计算公式为：所有存活仔猪在第21日龄的总体重-所有存活仔猪的初始总体重)/(实验天数*存活仔猪头数)；“日平均采食量”是指各组中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的平均日采食量；“体增重/采食量”是指各组中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的日平均增重/日平均采食量的比值；“腹泻率”是指在实验周期(21天)内，各组中腹泻仔猪的头数占各组中仔猪总头数的百分比。
本发明实施例提供了一种丁酸梭菌，所述丁酸梭菌的名称为JH-59，分类名称为：Clostridiumbutyricum，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211447，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。
JH-59的筛选过程如下：
S1、分别采集长汀河田鸡肠道和江汉种鸡肠道样品，将各个鸡肠道样品与玻璃珠和无菌水混合制得样品悬浮液，将样品悬浮液稀释涂布于RCM培养基平板，每种样品悬浮液的各个稀释度分别设置三个平行样，将涂布完成的RCM培养基平板置于37℃厌氧的条件培养；
S2、在RCM培养基平板上挑取微黄色、边缘透明且边缘不整齐的菌落进行分离纯化，然后采用100倍的油镜对纯化后获得的单菌落镜检，挑选出镜检结果为纯菌且是梭状杆菌的菌株，并且符合《伯杰细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌系统鉴定手册》中关于丁酸梭菌的形态特征及生理生化指标描述的菌株初步认定为丁酸梭菌；
S3、将步骤S2中初步认定为丁酸梭菌的菌种进行16S rDNA序列鉴定，测序由北京擎科生物科技有限公司完成，命名为JH-59；
S4、对JH-59进行抑菌实验、产淀粉酶能力实验、产酸能力实验以及动物实验。
选取广东省微生物菌种保藏中心编号为GDMCC1.676的丁酸梭菌为对照菌株。
在步骤S4中，对于抑菌实验，图1和图2示出了JH-59和GDMCC1.676的抑菌效果图，抑菌结果详见下表3：
表3JH-59和GDMCC1.676的抑菌实验结果
由图1、图2和表3可知，丁酸梭菌JH-59对产气荚膜梭菌CP-1、金黄色葡萄球菌S、表皮葡萄球菌Sp、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9、无乳链球菌KYB420和停乳链球菌KYB428均有理想的抑制效果，而GDMCC1.676丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌S、表皮葡萄球菌Sp、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9以及停乳链球菌KYB428均无明显的抑制效果，并且GDMCC1.676丁酸梭菌对无乳链球菌KYB420的抑制效果不如JH-59丁酸梭菌。
在产酶能力实验中，图3示出了JH-59和GDMCC1.676两株丁酸梭菌的产淀粉酶能力的效果图，JH-59和GDMCC1.676的产淀粉酶能力实验结果详见下表4：
表4JH-59和GDMCC1.676两株丁酸梭菌的产淀粉酶能力实验结果
由表4可知，JH-59的产淀粉酶能力明显优于GDMCC1.676。
在产酸能力实验中，JH-59及GDMCC1.676的产酸能力实验结果详见下表5：
表5JH-59丁酸梭菌的产酸能力实验结果
丁酸梭菌名称 pH值
JH-59 4.72
GDMCC 1.676 4.89
由表5可知，JH-59的产酸能力明显优于GDMCC1.676。
JH-59及GDMCC1.676的动物实验结果详见下表6：
表6JH-59丁酸梭菌的动物实验结果一览表
由表6可知，相较于GDMCC1.676，JH-59更有助于提高试验仔猪的体重，并显著降低试验仔猪的死亡率和腹泻率。
本申请实施例还提供了一种组合物，所述组合物包括丁酸梭菌JH-59。可以理解的是，丁酸梭菌JH-59在组合物中的存在形式可以是：纯种丁酸梭菌JH-59、丁酸梭菌JH-59的发酵培养物、丁酸梭菌JH-59的发酵培养物离心所得的培养液或其干燥物、丁酸梭菌JH-59的发酵培养物离心所得的菌体或其干燥物。组合物可以是液体，也可以是固体。
在本申请的一些实施例中，组合物为片剂、颗粒剂、粉剂、预混剂、喷雾剂、混悬液或乳剂。
在本申请的一些实施例中，组合物还包括可接受的辅料。辅料是指生产组合物和调配处方时所用的附加成分，具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释等重要功能，以使组合物达到一定的保质期和生物利用度，从而提高组合物的安全性和有效性，辅料包括但不限于是赋形剂、稀释剂、填充剂、溶剂、支持剂、预混剂、崩解剂、表面活性剂和吸附载体等。当组合物应用于制备饲料时，辅料可以是动物饲料科学领域中任何常规的辅料，辅料的选择将取决于组合物的使用方式。当组合物应用于制备食品时，辅料可以是食品科学可接受的辅料，例如香味剂、甜味剂等。当组合物应用于制备肥料时，辅料可以是肥料可接受的辅料，例如吸附载体。
可以理解的是，组合物还可以包括其他微生物，例如其他具有益生功能的微生物。
本申请实施例还提供了一种用于丁酸梭菌的发酵培养基，按照质量份数计算，所述发酵培养基包括：3份至8份的速效碳源、22.5份至34份的迟效碳源、7份至15份的酵母浸出物、5份至10份的发酵豆粕、5份至10份的乙酸钠、2份至5份的磷酸氢二钠、0.2份至1.0份的氯化钙、0.5份至2.0份的硫酸镁、0.1份至0.3份的硫酸亚铁以及0.2份至0.3份的硫酸锰。可以理解的是，所述发酵培养基能够用于发酵生产丁酸梭菌JH-59，也可以用于发酵生产其他株丁酸梭菌，即所述发酵培养基具有普适性。
如本申请所用，“速效碳源”是指能够被丁酸梭菌直接利用的含碳化合物，速效碳源能较快地参与菌体合成、产生能量、合成代谢产物等活动，例如速效碳源可以是葡萄糖。
如本申请所用，“迟效碳源”是指不能够被丁酸梭菌直接吸收利用的含碳化合物，通常是在无速效碳源的前提下为丁酸梭菌利用，需要依赖丁酸梭菌分泌胞外酶以将其分解成小分子物质而利用，因此，丁酸梭菌利用速率缓慢。
在所述发酵培养基的配方中，速效碳源的用量远低于迟效碳源的用量，以利于发酵培养产生的营养体转孢，从而提高转孢率。此外，若采用豆粕粉替代配方中的发酵豆粕作为氮源，由于发酵豆粕的蛋白总量比豆粕粉高，且含有的氨基酸种类也较豆粕粉丰富，从而更有利于丁酸梭菌的快速增殖，所以豆粕粉的用量至少是发酵豆粕的用量的一倍，导致提高了发酵生产成本；进一步地，相较于采用豆粕粉作为氮源，采用发酵豆粕作为氮源更有利于提高转孢率。
在本申请的一些实施例中，所述迟效碳源包括：20份至30份的第一迟效碳源以及2.5份至4份的第二迟效碳源，其中，丁酸梭菌对所述第二迟效碳源的利用速率慢于丁酸梭菌对所述第一迟效碳源的利用速率，第一迟效碳源和第二迟效碳源采用上述复配比例的原因在于：当速效碳源消耗完毕后，丁酸梭菌的菌体利用第一迟效碳源作为其增殖的碳源，丁酸梭菌的菌体继续增殖，但增殖速率较慢，且产酸速率较慢；当第一迟效碳源消耗完毕后，丁酸梭菌的菌体开始利用第二迟效碳源，但丁酸梭菌的菌体对第二迟效碳源的利用速率非常缓慢，基于代谢产物的积累以及营养物质和培养空间的限制，进入转孢阶段，因此，需要控制第一迟效碳源和第二迟效碳源的复配比例，在保证高菌体浓度的同时，促进菌体转孢，从而提高转孢率。
在本申请的一些实施例中，所述速效碳源为葡萄糖，所述第一迟效碳源为玉米淀粉，所述第二迟效碳源为玉米粉，有利于降低发酵生产成本。
本申请实施例还提供了一种丁酸梭菌的发酵培养方法，包括步骤：提供丁酸梭菌的种子液，将所述丁酸梭菌的种子液接种至如本申请实施例中所述的发酵培养基中进行发酵培养。
进一步地，发酵培养的条件包括：pH为6.0至7.0、温度为35℃至40℃。
进一步地，发酵培养的时间为10h至20h。
需要说明的是，申请实施例的丁酸梭菌的发酵培养方法适用于摇瓶发酵阶段、小试阶段、中试阶段、大罐试产阶段以及工业化生产阶段，发酵规模包括但不限于是100L发酵罐、500L发酵罐、2吨发酵罐、10吨发酵罐等，本领域技术人员根据发酵规模，能够依赖自身所掌握的专业知识逐级制备种子液。
下面通过具体实施例和对比例对本申请的丁酸梭菌发酵培养方法及技术效果进行详细说明，以下实施例仅仅是本申请的部分实施例，并非对本申请作出具体限定。
实施例1
本实施例提供了一种丁酸梭菌JH-59的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。
一、制备种子液
(1)种子活化
取-80℃甘油管保存的丁酸梭菌JH-59，待丁酸梭菌JH-59甘油管完全融化后，吸取1mL的菌液接种于100mL的RCM液体培养基(盛装于150mL的三角瓶)中，37℃严格厌氧静置培养12h，获得100mL的丁酸梭菌JH-59活化液以备用。
(2)制备一级种子液
取上述丁酸梭菌JH-59活化液各10ml，分别接种于装量700mL的两瓶RCM液体培养基(盛装于1000mL的三角瓶)中，37℃严格厌氧静置培养8h，获得1400mL的一级种子液以备用。
(3)制备二级种子液
选择100L的发酵罐作为种子罐，向其中加入70L的RCM液体培养基，并且加入2‰(体积比,V/V)的聚二甲基硅氧烷消泡剂，氢氧化钠调节pH为7.2至7.5，然后121℃灭菌20min，灭菌结束后向夹套内通冷水以快速冷却降温，并向罐内通入高纯氮气保压0.05Mpa。
当罐温冷却至40℃，取1400mL的一级种子液按2％(体积比,V/V)的接种量转接于种子罐，在罐压0.05MPa、温度37℃、搅拌转速100r/min的条件下发酵培养，在培养过程中，控制pH为6.4(通过流加40％氢氧化钠控制pH)，培养12h，移种。
二、2吨发酵罐发酵生产
(1)发酵培养基
发酵培养基由以下成分组成：
5g/L的葡萄糖、27g/L的玉米淀粉、3.5g/L的玉米粉、13g/L的酵母浸粉、5g/L的发酵豆粕、5g/L的乙酸钠、2g/L的磷酸氢二钠、0.5g/L的氯化钙、1g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸亚铁以及0.25g/L的硫酸锰。
(2)2吨发酵罐实消
根据发酵罐装液量(罐体积的70％)，称取发酵培养基的各个组分，将称取好的各个组分相混合，并加水分散均匀后倒至发酵罐中，加入2‰(体积比,V/V)的消泡剂，氢氧化钠调节pH为7.2至7.5，然后121℃灭菌20min，灭菌结束后向夹套内通冷水以快速冷却降温，并向罐内通入高纯氮气保压0.05Mpa。
(3)发酵控制
当罐温冷却至40℃，取70L的二级种子液按5％(体积比,V/V)的接种量接种上罐，在罐压0.05MPa、温度37℃以及搅拌转速100r/min的条件下发酵培养，在发酵过程中，当pH降至5.8时，则流加40％氢氧化钠以控制pH为6.5。发酵4h至11h为产酸产气高峰期，需及时补碱和排气，以维持pH为6.5，以及维持罐压在0.04MPa至0.06MPa之间。发酵至20h时，取样镜检，观察转孢状况，当转孢率在90％以上(如图4所示)时，即可下罐。
将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为9.2亿CFU/mL。
实施例2
本实施例提供了一种丁酸梭菌JH-59的发酵培养方法，发酵规模为30L发酵罐。具体操作过程为：按照实施例1中的方法制备获得一级种子液，然后将700mL的一级种子液转接于30L的发酵罐(装液量为16L，发酵培养基与实施例1相同，发酵罐的实消方法参照实施例1进行)，在罐压0.05MPa、温度37℃以及搅拌转速100r/min的条件下发酵培养，在发酵过程中，当pH降至5.8时，则流加40％氢氧化钠以控制pH为6.5。发酵4h至11h为产酸产气高峰期，需及时补碱和排气，以维持pH为6.5，并维持罐压在0.04MPa至0.06MPa之间，发酵20h时，取样镜检发现转孢率在90％以上，下罐，发酵过程中的碱液消耗量如图5所示。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为10.2亿CFU/mL。
实施例3
本实施例提供了一种丁酸梭菌JH-59的发酵工艺，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本实施例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：
5g/L的葡萄糖、30g/L的玉米淀粉、13g/L的酵母浸粉、5g/L的发酵豆粕、5g/L的乙酸钠、2g/L的磷酸氢二钠、0.5g/L的氯化钙、1g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸亚铁以及0.25g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为7.8亿CFU/mL。
实施例4
本实施例提供了一种丁酸梭菌JH-59的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本实施例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：5g/L的葡萄糖、30g/L的玉米粉、13g/L的酵母浸粉、5g/L的发酵豆粕、5g/L的乙酸钠、2g/L的磷酸氢二钠、0.5g/L的氯化钙、1g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸亚铁以及0.25g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为7.0亿CFU/mL。
实施例5
本实施例提供了一种丁酸梭菌JH-59的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本实施例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：3g/L的葡萄糖、20g/L的玉米淀粉、2.5g/L的玉米粉、13g/L的酵母浸粉、5g/L的发酵豆粕、5g/L的乙酸钠、2g/L的磷酸氢二钠、0.5g/L的氯化钙、1g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸亚铁以及0.25g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为6.5亿CFU/mL。
实施例6
本实施例提供了一种丁酸梭菌JH-59的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本实施例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：8g/L的葡萄糖、30g/L的玉米淀粉、4g/L的玉米粉、13g/L的酵母浸粉、5g/L的发酵豆粕、5g/L的乙酸钠、2g/L的磷酸氢二钠、0.5g/L的氯化钙、1g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸亚铁以及0.25g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为8.8亿CFU/mL。
实施例7
本实施例提供了一种丁酸梭菌GDMCC1.676的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本对比例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基相同，菌种不同，本实施例所使用菌种为丁酸梭菌GDMCC1.676。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为12.5亿CFU/mL。
对比例1
本对比例提供了一种丁酸梭菌JH-59的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本对比例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：25g/L的葡萄糖、3.0g/L的玉米淀粉、0.5g/L的玉米粉、13g/L的酵母浸粉、5g/L的发酵豆粕、5g/L的乙酸钠、2g/L的磷酸氢二钠、0.5g/L的氯化钙、1g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸亚铁以及0.25g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为4.5亿CFU/mL。
对比例2
本对比例提供了一种丁酸梭菌JH-59的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本对比例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：25g/L的葡萄糖、3.5g/L的玉米淀粉、13g/L的酵母浸粉、5g/L的发酵豆粕、5g/L的乙酸钠、2g/L的磷酸氢二钠、0.5g/L的氯化钙、1g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸亚铁以及0.25g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为5.1亿CFU/mL。
对比例3
本对比例提供了一种丁酸梭菌JH-59的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本对比例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：25g/L的葡萄糖、3.5g/L的玉米粉、13g/L的酵母浸粉、5g/L的发酵豆粕、5g/L的乙酸钠、2g/L的磷酸氢二钠、0.5g/L的氯化钙、1g/L的硫酸镁、0.3g/L的硫酸亚铁以及0.25g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于RCM培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃严格厌氧静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中芽孢浓度为3.5亿CFU/mL。
在上述实施例中，对各个实施例和对比例的描述都各有侧重，某个实施例/对比例/实验例中没有详述的部分，可以参见其他实施例/对比例/实验例的相关描述。
以上对本发明实施例所提供的一种丁酸梭菌、组合物及其应用与丁酸梭菌的发酵工艺，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种丁酸梭菌，其特征在于，所述丁酸梭菌的名称为JH-59，分类名称为：Clostridium butyricum，保藏编号为：CCTCC NO: M 20211447，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。
2.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1所述的丁酸梭菌。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括可接受的辅料。
4.如权利要求1所述的丁酸梭菌、或如权利要求2或3所述的组合物在制备饲料中的应用。
5.一种丁酸梭菌的发酵培养方法，其特征在于，所述丁酸梭菌为如权利要求1所述的丁酸梭菌，所述的发酵培养方法包括步骤：提供所述丁酸梭菌的种子液，将所述丁酸梭菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养；
其中，按照质量份数计算，所述发酵培养基包括：3份至8份的葡萄糖，20份至30份的玉米淀粉，2.5份至4份的玉米粉，7份至15份的酵母浸出物、5份至10份的发酵豆粕、5份至10份的乙酸钠、2份至5份的磷酸氢二钠、0.2份至1.0份的氯化钙、0.5份至2.0份的硫酸镁、0.1份至0.3份的硫酸亚铁以及0.2份至0.3份的硫酸锰。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的条件包括：pH为6.0至7.0、温度为35℃至40℃。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为10h至20h。
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Effects of different replicons in conjugative plasmids on transformation efficiency, plasmid stability, gene expression and n-butanol biosynthesis in Clostridium tyrobutyricum.;Yu Mingrui;Applied microbiology and biotechnology.;第93卷(第2期);全文 *

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