CN116083272A - 一种丁酸梭菌及其生物饲料添加剂的应用 - Google Patents

一种丁酸梭菌及其生物饲料添加剂的应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及微生物发酵的技术领域，具体公开了一种丁酸梭菌及其生物饲料添加剂的应用。本申请提供的丁酸梭菌XDY‑1619保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.7.382，保藏时间：2022年8月23日；利用上述丁酸梭菌制备的发酵物、发酵上清液、菌悬液和菌剂；以及上述制剂在制备生物饲料方面的应用。本申请提供的丁酸梭菌XDY‑1619既能耐胃酸、耐胆盐，还能有效抑制肠道中的致病菌；利用上述丁酸梭菌XDY‑1619制备的生物饲料添加剂的储存稳定好，存留率高，而且可以促进畜禽生长，减少畜禽的死亡率与腹泻率，降低畜禽的料肉比。

Description

一种丁酸梭菌及其生物饲料添加剂的应用
技术领域
本申请涉及微生物发酵的技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌及其生物饲料添加剂的应用。
背景技术
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，又叫酪酸梭菌，是一种能够合成丁酸的严格厌氧的革兰氏阳性芽抱杆菌。在全面“禁抗”的大背景下，丁酸梭菌也被认为是比较理想的抗生素替代物。研究表明，丁酸梭菌发酵可以产生各种酶并分泌到胞外，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。此外，还可以产生多种短链脂肪酸如丁酸、乙酸等，其中丁酸是其主要产物。丁酸梭菌能够定植于动物肠道，为生物机体提供营养，修复肠道损伤，并抑制沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌在肠道中的生长，与双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌共存，具有极强的整肠作用。作为一种天然的丁酸生产菌，丁酸梭菌已被广泛用作人类和食用动物的益生菌，在多个行业中已有应用。
然而，目前丁酸梭菌的工业化发酵工艺普遍存在芽孢形成率低、产品质量稳定性差、高活力维持周期短等问题，导致其储存运输条件受限、使用效果差。因此，筛选一株性状优良的丁酸梭菌具有十分重要的意义。
发明内容
为了提高丁酸梭菌产品的质量稳定性，使丁酸梭菌产品保持较长的活力期，并且具备优异的使用效果。本申请提供一种丁酸梭菌及其生物饲料添加剂的应用。
第一方面，本申请提供一种丁酸梭菌，采用如下的技术方案：
一种丁酸梭菌，所述丁酸梭菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)XDY-1619，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.7.382，保藏时间为：2022年8月23日。
本申请提供的丁酸梭菌XDY-1619从断奶仔猪的肠道中分离获得，该丁酸梭菌的储存稳定好，存留率高，而且能够耐胃酸、耐胆盐，对肠道中致病性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及产气荚膜梭菌等有较强抑制作用，还可以直接利用淀粉进行发酵，而且芽孢整齐度高，稳定性好。
进一步，所述丁酸梭菌的菌体呈单个、直杆梭状，两端钝圆、中间部分轻度膨胀，周身鞭毛；在RCM培养基上，该丁酸梭菌的菌落呈乳白色，边缘整齐，圆形稍凸；所述丁酸梭菌为革兰氏阳性菌。
优选的，所述丁酸梭菌的分离、纯化方法包括以下步骤：
(1)取样：取断奶仔猪的肠道内容物置于水中，充分振荡摇匀，获得待分离样品；
(2)分离与培养：将所述待分离样品水浴加热，然后进行厌氧培养，获得菌液；
(3)纯化：将所述菌液依次进行稀释、划线培养、纯化，然后保存备用。
具体的，菌株的分离、纯化方法如下：
(1)取样：取健康断奶仔猪的肠道内容物置于无菌蒸馏水中，充分振荡摇匀，获得待分离样品；
(2)分离与培养：对步骤(1)获得的待分离样品水浴加热，然后将样品接种于RCM液体培养基中进行厌氧培养，获得菌液；
(3)纯化：将步骤(2)获得的菌液稀释，然后涂布于RCM固体培养基上，挑取形态不同的典型菌落在相同培养基的平板上划线接种做纯培养；挑取少量纯培养的单菌落，均匀涂于玻片上，进行结晶紫简单染色并镜检；将产生芽孢且形态为梭状的单菌落转入RCM固体培养基试管斜面厌氧培养，然后置于4℃下保存备用。
将上述获得的菌株命名为XDY-1619菌株，对上述XDY-1619菌株进行抑菌效果测试、人工胃酸耐受效果测试、人工胆盐耐受性效果测试，结果发现，XDY-1619菌株具有优异的抑菌效果，且耐酸性、耐胆盐性好。
对上述XDY-1619菌株进行16S rDNA序列测序，其16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示；经过鉴定，XDY-1619菌株的16S rDNA序列与Clostridium butyricum(丁酸梭菌)的同源性达100.0％，其形态特征及生理生化特性与Clostridium butyricum(丁酸梭菌)最相似，确定该XDY-1619菌株为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。
优选的，所述丁酸梭菌XDY-1619的最佳培养条件为：温度为37℃，pH为7.0，转速为300r/min。
第二方面，本申请提供一种发酵物，所述发酵物包括上述丁酸梭菌。
第三方面，本申请提供一种发酵上清液，所述发酵上清液是所述发酵物经离心后获得的上层澄清液。
第四方面，本申请提供一种菌悬液，所述菌悬液包括上述丁酸梭菌。
本申请中，发酵物是指菌种经过培养后，获得的既含有菌种又含有菌种代谢产物的混合物；发酵上清液是指菌种经过培养、离心，获得的上层澄清液体，其主要成分为菌种代谢产物；菌悬液是指将菌种培养、离心获得的沉淀物(菌泥)利用溶剂进行悬浮而获得的均一溶液。
第五方面，本申请提供一种菌剂，所述菌剂包括上述丁酸梭菌。
第六方面，本申请提供的丁酸梭菌、发酵物、发酵上清液、菌悬液、菌剂在制备饲料方面的应用。
第七方面，本申请提供一种生物饲料添加剂，所述生物饲料添加剂中的活菌数≥4.0×1010CFU/g。
第八方面，本申请提供一种饲料，所述饲料包含所述生物饲料添加剂。
具体的，所述饲料为肉鸡饲料或猪饲料。
优选的，所述生物饲料添加剂在饲料中的添加量为10-50mg/kg。
本申请提供的丁酸梭菌、发酵物、发酵上清液、菌悬液、菌剂和生物饲料添加剂均可在饲料中应用。将生物饲料添加剂用于饲料中，并将生物饲料添加剂的添加量控制在上述范围内，能够使生物饲料添加剂中的丁酸梭菌随着饲料定植于动物肠道中，丁酸梭菌产生的丁酸能够调节动物肠道的微生物菌群、促进肠道发育，最终提高动物机体的免疫力。
丁酸梭菌发酵能够产生丁酸，将其用于饲料添加剂，可提高动物抵抗力，减少抗生素的使用。丁酸是一种无毒的，具有水、脂两亲性的短链脂肪酸，可透过革兰氏阳性菌和阴性菌细胞膜，促进有益菌的增殖，抑制有害菌的生长，从而使整个肠道趋于健康状态。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请提供一种丁酸梭菌，该丁酸梭菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)XDY-1619；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.7.382，保藏时间：2022年8月23日。
2.本申请提供的丁酸梭菌的菌体呈单个、直杆梭状，两端钝圆、中间部分轻度膨胀，周身鞭毛；在RCM培养基上，该丁酸梭菌的菌落呈乳白色，边缘整齐，圆形稍凸；所述丁酸梭菌属于严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌。
3.本申请提供的丁酸梭菌的储存稳定好，存留率高，既能耐胃酸、耐胆盐，还能有效抑制肠道中的致病菌；利用含有该菌制备的生物饲料添加剂的饲料对畜禽进行喂养，可以促进畜禽生长，减少畜禽的死亡率与腹泻率，降低畜禽的料肉比。
4.本申请提供的丁酸梭菌不会在动物体内残留，也不会对人类健康造成危害，可以制备出健康安全的生物饲料添加剂。
附图说明
图1是本申请提供的丁酸梭菌XDY-1619在RCM培养基中的培养结果。
图2是本申请提供的丁酸梭菌XDY-1619在光学显微镜下×1000下的结晶紫染色示意图。
具体实施方式
本申请提供一种丁酸梭菌，该丁酸梭菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)XDY-1619；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.7.382，保藏时间：2022年8月23日。上述丁酸梭菌的菌体呈单个、直杆梭状，两端钝圆、中间部分轻度膨胀，周身鞭毛；在RCM培养基上，该丁酸梭菌的菌落呈乳白色，边缘整齐，圆形稍凸；所述丁酸梭菌为革兰氏阳性菌。
上述丁酸梭菌的分离、纯化方法如下：
(1)取样：取健康断奶仔猪的肠道内容物置于无菌蒸馏水中，充分振荡摇匀；
(2)分离与培养：对步骤(1)获得的样品水浴加热，然后将样品接种于RCM液体培养基中进行厌氧培养，获得菌液；
(3)纯化：将步骤(2)获得的菌液稀释，然后涂布于RCM固体培养基上，挑取形态不同的典型菌落在相同培养基的平板上划线接种做纯培养；挑取少量纯培养的单菌落，均匀涂于玻片上，进行结晶紫简单染色并镜检；将产生芽孢且形态为梭状的单菌落转入RCM固体培养基试管斜面厌氧培养，然后置于4℃下保存备用。
本申请实施例中所使用的试剂、溶剂和其他实验材料均可通过商购获得。
本申请中所用到的仪器设备：厌氧培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)。
本申请中所用到的培养基来源、配方及制备方法如下：
(1)RCM培养基购自青岛海博生物技术有限公司，该培养基为RCM液体培养基；
RCM固体培养基制备方法为：按照RCM培养基的产品说明配制培养基，并另外以20g/L左右的比例添加琼脂粉(注：琼脂粉的添加量可视菌落长势酌情调整)，充分溶解，混合均匀，121℃高压蒸汽灭菌20min；待培养基降温至50℃左右，于无菌操作台倒入已灭菌的空平皿中，每皿约20mL左右，待培养基冷却凝固后于37℃恒温培养箱倒置空培24h，确认未染菌后包好备用。
(2)种子培养基包含：胰蛋白胨(10g/L)，植物胨(5g/L)，酵母粉(3g/L)，
Figure BDA0003830686060000041
蛋白胨(10g/L)，葡萄糖(10g/L)，L-半胱氨酸盐酸盐(0.3g/L)，K2HPO4·3H2O(2.5g/L)，氯化钠(3g/L)，硫代乙醇酸钠(0.3g/L)。
(3)发酵培养基包含：玉米粉6g/L，淀粉11.5g/L，酵母膏0.98g/L，氯化钠0.5％，碳酸氢钠0.1％，硫酸锰0.02％，七水硫酸镁0.05％，碳酸钙0.3％。
(4)种子培养基及发酵培养基的制备方法如下：分别称取各组分并混合均匀，溶解于自来水中，定容至所需体积，并调节体系pH为7.0，在121℃下灭菌20min，即可获得所需培养基。
以下结合实施例、应用例、附图说明及检测试验对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1
菌株的分离、纯化
(1)取样：取健康断奶仔猪的肠道内容物约1g置于盛有45mL的无菌蒸馏水的三角瓶中，充分振荡摇匀。(健康断奶仔猪来源于北京昕大洋科技发展有限公司养殖场)
(2)目标菌初分离：将三角瓶置于75℃水浴中10分钟，取10mL菌液加入到100mL的RCM液体培养基中，在37℃厌氧培养24小时。
(3)将培养24小时后的菌液稀释后涂于RCM固体培养基上，挑取形态不同的典型菌落在相同培养基的平板上划线接种做纯培养；挑取少量纯培养的单菌落，均匀涂于玻片上，进行结晶紫简单染色并镜检；将产生芽孢且形态为梭状的单菌落转入RCM固体培养基试管斜面37℃厌氧培养24小时，然后置于4℃下保存备用。
将上述菌株的分离与纯化获得的菌株命名为XDY-1619菌株。
实施例2
实施例2提供一种发酵上清液。
上述发酵上清液的制备方法如下：将实施例1分离得到的XDY-1619菌株接种于装有10mL的RCM培养基中，于厌氧培养箱中37℃培养24小时，获得发酵物；然后将上述发酵物离心，离心的转速为5000r/min，离心完毕获得上清液与沉淀物，该上清液即为XDY-1619发酵上清液。
对比例1
对比例1提供了一种发酵上清液。
对比例1提供的发酵上清液中采用的菌株为丁酸梭菌WL-53，保藏编号为CCTCCNO：M2019252。
抑菌效果测试
对实施例2、对比例1提供发酵上清液进行抑菌效果测试，具体如下：
(1)制备指示菌平板：取大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)三种致病菌作为指示菌；将三种菌分别接种于装有20mLRCM培养基的500mL三角瓶中，在37℃、180r/min的条件下培养12h；再分别取三种菌液各100μL分别转接到另一个新鲜无菌的20mLRCM液体培养基中，继续在37℃，180r/min的条件下培养，直到OD600值为0.4，即可获得三种活化好的指示菌菌悬液。需要注意的是，其中产气荚膜梭菌厌氧培养。
(2)将步骤(1)活化好的3种指示菌菌悬液各取100μL分别均匀涂布在LB琼脂平板上，然后在每个LB平板上放置2个牛津杯，向每个LB平板中的2个牛津杯分别加入实施例2、对比例1提供发酵上清液各200μL，将各LB平板置于37℃培养24小时观察并测定抑菌圈大小，测试结果如表1所示。
表1实施例2、对比例1提供的发酵上清液对致病菌的抑菌效果测试结果
Figure BDA0003830686060000061
由上表可以看出，对比例1提供的WL-53菌株对大肠杆菌的抑制效果优于实施例2提供的XDY-1619菌株对大肠杆菌的抑制效果；而实施例2提供的XDY-1619菌株对产气荚膜梭菌的抑制效果优于对比例1提供的WL-53菌株对产气荚膜梭菌的抑制效果，且实施例2提供的XDY-1619菌株对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制效果。因此，说明本申请提供的丁酸梭菌XDY-1619具有很好的抑菌效果。
实施例3
实施例3提供一种发酵物。
上述发酵物的制备方法如下：将实施例1分离得到的XDY-1619菌株接种于装有10mL的RCM培养基中，于厌氧培养箱中37℃培养24小时，获得XDY-1619发酵物。
人工胃酸耐受效果测试
对实施例3提供发酵物进行人工胃酸耐受效果测试，具体如下：
(1)配制人工胃液：1％胃蛋白酶，0.85％的氯化钠，用HCl调节pH至2.0，并用细菌过滤器过滤，获得人工胃液。
(2)将菌株以10％的接种量接种到步骤(1)获得的人工胃液中，在37℃、70r/min下摇床培养；然后分别于0、1、2、3、4和5小时取样进行平板菌落计数，并计算活菌存留率。
活菌存留率计算公式为：
C＝B/A×100％
其中，C为活菌存留率；B为人工胃液处理后的活菌数；A为人工胃液处理前的活菌数。
以上菌株对人工胃液的耐受效果测试结果如表2所示：
表2实施例3提供的发酵物对人工胃液的耐受效果测试结果
时间/h 0 1 2 3 4 5
活菌存留率(％) 100 95.14 93.47 90.36 86.87 82.21
由上表可以看出，随着人工胃液处理时间的延长，上述菌种发酵物中的活菌数均有所降低，但是在经过5小时的人工胃液处理后，XDY-1619发酵物的活菌存留率仍然＞80％，由于人工胃液呈现强酸性，因此说明本申请提供的丁酸梭菌XDY-1619具有良好的耐酸性。
人工胆盐耐受性效果测试
对实施例3提供发酵物进行人工胆盐耐受性效果测试，具体如下：
(1)配置人工胆盐，在生理盐水中加入猪胆盐，配置成浓度为0.3％的人工胆盐溶液，并在121℃高压灭菌20min。
(2)将XDY-1619菌株以10％的接种量接种到步骤(1)获得的人工胆盐溶液中，在37℃、70r/min下摇床培养；然后分别于0、2、6、12和24小时取样进行平板菌落计数，并计算活菌存留率。
以上菌株对人工胆盐耐受效果测试结果如表3所示：
表3实施例3提供的发酵物对人工胆盐耐受效果测试结果
时间/h 0 2 6 12 24
活菌存留率(％) 100 96.43 95.76 90.10 83.49
根据表3的试验结果可以看出，本申请提供的XDY-1619菌株在24小时、0.3％胆酸盐溶液的作用下，仍然具有80％以上的活菌存留率。因此，说明本申请提供的XDY-1619菌株对胃肠液具有很好的耐受性。
实施例4
菌株的鉴定
对分离获得的XDY-1619菌株进行PCR特异性扩增与分子生物学鉴定，具体为：首先利用DNA提取试剂盒提取菌株的基因组，然后进行PCR特异性扩增，最后测定菌株16S rDNA基因序列并进行同源性比较。
其中，PCR特异性扩增所用的引物及引物序列如下：
正向引物：27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)
反向引物：1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。
PCR反应体系如下：Template(基因组DNA)0.5μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，TaqDNA酶0.2μL，上游引物、下游引物(10uM)各0.5μL，加ddH2O至25μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃45s；55℃45s；72℃1min；30个循环，72℃延伸10min。
检测结果
形态学特征
将XDY-1619菌株于RCM培养基上培养，通过肉眼观察发现，上述菌株的菌落呈乳白色，边缘整齐，圆形稍凸。上述菌株在RCM培养基中的形态如图1所示。
在光学显微镜×1000下观察XDY-1619菌株，该菌株的菌体呈单个、直杆梭状，两端钝圆、中间部分轻度膨胀，经过结晶紫染色后如图2所示。
生理生化特征
根据《细菌属的鉴定指导》中介绍的方法，测定分离菌对各种碳源的利用情况以及进行其他生理生化试验。结果见表4。
表4 XDY-1619菌株的生理生化特征
Figure BDA0003830686060000081
Figure BDA0003830686060000091
根据形态学特征观察结果、生理生化特征试验结果，并对照《伯杰氏系统细菌学手册》检索，发现上述XDY-1619菌株的特征与丁酸梭菌菌种的特征接近，初步判断该菌株为丁酸梭菌。
鉴定
XDY-1619菌株的16rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将XDY-1619菌株的16SrDNA序列与Clostridium butyricum(丁酸梭菌)的同源性达100.0％，其形态特征及生理生化特性与Clostridium butyricum(丁酸梭菌)最相似，因此确定该XDY-1619菌株为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。将该丁酸梭菌XDY-1619保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.7.382，保藏时间：2022年8月23日。
实施例5
实施例5提供了一种丁酸梭菌XDY-1619的菌悬液。
上述菌悬液的制备方法如下：将丁酸梭菌XDY-1619菌株接种于装有10mL的RCM培养基中，于厌氧培养箱中37℃培养24小时，获得发酵物；然后将上述发酵物离心，离心的转速为5000r/min，离心完毕获得上清液与沉淀物，该沉淀物为丁酸梭菌XDY-1619菌体，然后用无菌水对菌体进行稀释，获得菌悬液。
实施例6
实施例6提供一种生物饲料添加剂。
(1)种子液培养：将丁酸梭菌XDY-1619菌株接种到种子培养基上，于35℃厌氧培养36-48小时；然后挑取单菌落接种到种子培养基中，于37℃、300r/min下厌氧培养36-48小时；再将种子培养基置于水浴摇床，在70-80℃下热处理10min，得到丁酸梭菌种子液。
(2)扩大培养及后处理：将种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，装量3T，试验全程罐体内不通氧气，用氮气作为保压气体，全程罐压为0.02～0.05MPa。培养基灭菌前pH7.0±0.1，灭菌时温度为120±1℃，灭菌时间为30分钟；灭菌完毕，将培养基降温至37℃时接种种子液，接种量为10％，然后在37℃±1℃下进行培养；培养过程中，全程开启搅拌，用灭菌的食用碱控制pH为6.5～7.0；当镜检芽孢较多且不增加时，停止培养，pH调至5.3～5.6，降温至20℃后放罐，放罐后用管式离心机进行处理得菌泥，添加25％的麦芽糊精于低温流化床干燥机烘干获得生物饲料添加剂。
对生物饲料添加剂的活菌数进行检测，活菌数检测方法具体如下：首先按照GB/T14699.1的标准进行采样；然后按照GB/T 20195进行待检测试样的制备；再依次对待检测试样进行提取、稀释、接种、培养、菌落计数及试样活菌数计算。
通过以上检测方法可得，实施例6提供的生物饲料添加剂的成品活菌数为4.0×1010CFU/g。
常温储存稳定性试验
对实施例6提供的生物饲料添加剂及利用其制备的饲料进行常温储存稳定性试验。
常温储存稳定性试验方法为：将生物饲料添加剂及饲料进行常温储存，然后分别在储存的2、4、6、8、10、12月，采用平板计数法测定活菌数并计算活菌存留率。
利用生物饲料添加剂制备饲料的方法为：取玉米52.01g，豆粕35.10g，麦麸4.9975g，豆油4.50g，豆粉1.52g，L-赖氨酸0.35g，L-苏氨酸0.06g，磷酸氢钙1.00g，食盐0.3g，蛋氨酸0.16g，生物饲料添加剂0.0025g混合均匀，即可获得饲料。
生物饲料添加剂及利用其制备的饲料的常温储存稳定性试验结果如表5所示。
表5实施例6获得的生物饲料添加剂及利用其制备的饲料的常温储存试验结果
Figure BDA0003830686060000101
由上表可以看出，本申请提供的生物饲料添加剂及利用其制备的饲料在常温下储存6个月后，其活菌存留率均＞95％；储存12个月后，活菌存留率均＞80％。因此，说明本申请提供的利用丁酸梭菌XDY-1619制备的生物饲料添加剂以及利用该饲料添加剂制备的饲料均能够在长时间下储存。
应用例
应用例1
应用例1提供一种肉鸡饲料。
上述肉鸡饲料的制备方法如下：取玉米52.01g，豆粕35.10g，麦麸4.9980g，豆油4.50g，豆粉1.52g，L-赖氨酸0.35g，L-苏氨酸0.06g，磷酸氢钙1.00g，食盐0.3g，蛋氨酸0.16g，生物饲料添加剂0.0020g混合均匀，即可获得肉鸡饲料。其中，生物饲料添加剂来源于实施例6。
对比例2
对比例2提供一种肉鸡饲料。
对比例2与应用例1的区别之处：生物饲料添加剂。
上述肉鸡饲料的制备方法如下：取玉米52.01g，豆粕35.10g，麦麸4.9980g，豆油4.50g，豆粉1.52g，L-赖氨酸0.35g，L-苏氨酸0.06g，磷酸氢钙1.00g，食盐0.3g，蛋氨酸0.16g，生物饲料添加剂0.0020g混合均匀，即可获得肉鸡饲料。其中，生物饲料添加剂的制备方法与实施例6提供的生物饲料添加剂的制备方法相同，不同之处在于生物饲料添加剂中采用的菌种为丁酸梭菌WL-53。
经检测，利用上述丁酸梭菌WL-53制备的生物饲料添加剂的成品活菌数为9×109CFU/g。
对比例3
对比例3提供一种肉鸡饲料。
对比例3与应用例1的区别之处：生物饲料添加剂。
上述肉鸡饲料的制备方法如下：取玉米52.01g，豆粕35.10g，麦麸4.9980g，豆油4.50g，豆粉1.52g，L-赖氨酸0.35g，L-苏氨酸0.06g，磷酸氢钙1.00g，食盐0.3g，蛋氨酸0.16g，生物饲料添加剂0.0020g混合均匀，即可获得肉鸡饲料。其中，生物饲料添加剂的制备方法与实施例6提供的生物饲料添加剂的制备方法相同，不同之处在于生物饲料添加剂中采用的菌种为丁酸梭菌ZJU-F1；丁酸梭菌ZJU-F1的保藏编号为CGMCC No.8939。
经检测，利用上述丁酸梭菌ZJU-F1制备的生物饲料添加剂的成品活菌数为1×109CFU/g。
喂养试验
对应用例1、对比例2-3提供的肉鸡饲料进行喂养试验。
1.试验动物及分组：试验选取288羽1日龄AA+白羽肉鸡，雌雄各半，随机分为4个组，每组72只；试验期为42d。
2.试验方法：1组喂食应用例1提供的肉鸡饲料；1组喂食对比例2提供的肉鸡饲料；1组喂食对比例3提供的肉鸡饲料；1组喂食基础日粮。试验期间，所有条件基本一致，按常规程序进行免疫、驱虫，每日饲喂2次，自由采食与饮水，每天清理粪便一次，并刷洗一次水槽。
基础日粮的制备方法如下：取玉米52.01g，豆粕35.10g，麦麸5g，豆油4.50g，豆粉1.52g，L-赖氨酸0.35g，L-苏氨酸0.06g，磷酸氢钙1.00g，食盐0.3g，蛋氨酸0.16g混合均匀，即可获得肉鸡饲料。
3.试验结果：对各组肉鸡的生产性能及死淘率进行测定，结果如表6所示；
(1)生产性能测定方法：记录每周的饲料消耗量；于每周日的清晨，称量肉鸡的空腹体重；计算每周的肉鸡的平均日增重、平均日采食量和料肉比；最后计算6周(42天)的肉鸡的平均日增重、平均日采食量和料肉比的平均值。
平均日采食量的计算公式：平均日采食量＝每周饲料消耗量/7
平均日增重的计算公式：平均日增重＝(试验末平均体重-起始平均体重)/7
料肉比的计算公式：料肉比＝平均日采食量/平均日增重
(2)死淘率测定方法：试验期间记录死淘鸡只数，试验结束统计各组肉鸡在42天内的死淘率。
死淘率的计算公式：死淘率＝死淘鸡数/试验鸡总数×100％
表6肉鸡的生产性能及死淘率检测结果
肉鸡饲料来源 平均日采食量(g) 平均日增重(g) 料肉比 死淘率(％)
应用例1 96.75 61.13 1.58 1.39(2只)
对比例2 97.69 60.25 1.62 1.39(2只)
对比例3 96.15 59.98 1.60 2.08(3只)
基础日粮 95.03 56.14 1.69 4.17(6只)
由上表可以看出，喂食应用例1的肉鸡的平均日增重明显高于喂食对比例2-3及喂食基础日粮的肉鸡的平均日增重，且喂食应用例1的肉鸡的料肉比低于喂食对比例2-3及基础日粮的肉鸡料肉比，说明肉鸡食用了本申请提供的添加有生物饲料添加剂的肉鸡饲料，可以显著提高肉鸡的胃口，并将喂养的肉鸡饲料更多地转化为鸡肉。
根据死淘率的检测结果可知，喂食应用例1及对比例2的肉鸡死淘率均为1.39％，而喂食对比例3及基础日粮的肉鸡死淘率分别为2.08％、4.17％。因此，说明向肉鸡饲料中添加含有丁酸梭菌XDY-1619的生物饲料添加剂，既能降低料肉比，还能显著降低肉鸡的死淘率。
应用例2
应用例2提供一种猪饲料。
上述猪饲料的制备方法如下：取玉米57.3g，豆粕26g，麦麸9.9975g，石粉2.0g，鱼粉3.0g，食盐0.3g，赖氨酸0.2g，磷酸氢钙1.20g，生物饲料添加剂0.0025g混合均匀，即可获得猪饲料。其中，生物饲料添加剂来源于实施例6。
对比例4
对比例4提供一种猪饲料。
对比例4与应用例2的区别之处：生物饲料添加剂。
上述猪饲料的制备方法如下：取玉米57.3g，豆粕26g，麦麸9.9975g，石粉2.0g，鱼粉3.0g，食盐0.3g，赖氨酸0.2g，磷酸氢钙1.20g，生物饲料添加剂0.0025g混合均匀，即可获得猪饲料。其中，生物饲料添加剂的制备方法与实施例6提供的生物饲料添加剂的制备方法相同，不同之处在于生物饲料添加剂中采用的菌种为丁酸梭菌WL-53。
对比例5
对比例5提供一种猪饲料。
对比例5与应用例2的区别之处：生物饲料添加剂。
上述猪饲料的制备方法如下：取玉米57.3g，豆粕26g，麦麸9.9975g，石粉2.0g，鱼粉3.0g，食盐0.3g，赖氨酸0.2g，磷酸氢钙1.20g，生物饲料添加剂0.0025g混合均匀，即可获得猪饲料。其中，生物饲料添加剂的制备方法与实施例6提供的生物饲料添加剂的制备方法相同，不同之处在于生物饲料添加剂中采用的菌种为丁酸梭菌ZJU-F1。
喂养试验
对应用例2、对比例4-5提供的猪饲料进行喂养试验。
1.试验动物及分组：体重7.5kg左右的28日龄断奶仔猪共240头，随机分成4组，每组60头(公猪母猪各半)，放入按防疫要求消毒后的猪舍中饲养。
2.试验方法：1组喂食应用例2提供的猪饲料；1组喂食对比例4提供的猪饲料；1组喂食对比例5提供的猪饲料；1组喂食基础日粮。试验期间，所有条件基本一致，猪舍温度保持在24℃左右，根据常规免疫程序免疫以及除虫等，每日饲喂4次，自由采食与饮水，每天清理粪便一次。预试期7d，正式试验期30d。
基础日粮的制备方法如下：取玉米57.3g，豆粕26g，麦麸10g，石粉2.0g，鱼粉3.0g，食盐0.3g，赖氨酸0.2g，磷酸氢钙1.20g混合均匀，即可获得猪饲料。
3.试验结果：对正式试验期中仔猪的生产性能及腹泻率进行测定，结果如表7所示；
(1)生产性能测定方法：试验开始日早晨，对断奶仔猪进行空腹称重；试验期间记录断奶仔猪的每日采食量；试验结束后停止喂食，并记录24h后断奶仔猪的体重。分别计算断奶仔猪的平均日增重、平均日采食量和料肉比，计算方法参考应用例1的喂养试验。
(2)腹泻率的测定方法：在试验记录期，每日记录腹泻头数，肛门附近有粪便为发生腹泻，最后统计试验期腹泻头总次数。
腹泻率的计算公式：腹泻率＝腹泻头总次数/(断奶仔猪总数×试验天数)×100％
表7仔猪的生产性能及腹泻率检测结果
肉鸡饲料来源 平均日采食量(g) 平均日增重(g) 料肉比 腹泻率(％)
应用例2 768 523 1.47 4.3(77次)
对比例4 756 504 1.50 6.0(108次)
对比例5 749 482 1.55 6.8(123次)
基础日粮 723 454 1.59 10.7(192次)
由上表可以看出，喂食应用例2的仔猪的平均日采食量及平均日增重均高于喂食对比例4-5、基础日粮的仔猪的平均日采食量及平均日增重；且喂食应用例2的仔猪肉料比明显低于喂食对比例4-5及基础日粮的仔猪肉料比。因此，说明当断奶仔猪食用了本申请提供的添加有生物饲料添加剂的猪饲料，可以显著提高断奶仔猪的胃口，并将喂养的猪饲料更多地转化为猪肉。
根据腹泻率的检测结果可知，喂食应用例2的仔猪的腹泻率为4.3％，而喂食对比例4-5、基础日粮的仔猪腹泻率分别为6.0％、6.8％、10.7％。说明向猪饲料中添加含有丁酸梭菌XDY-1619的生物饲料添加剂，能够显著降低断奶仔猪的腹泻率。
综上所述，本申请提供的丁酸梭菌XDY-1619既能够耐人工胃酸、胆盐，还能抑制肠道中的致病菌。利用上述丁酸梭菌XDY-1619可以制生物饲料添加剂，将该生物饲料添加剂添加至畜禽饲料中对畜禽进行喂食，能够促进畜禽生长，减少畜禽的死亡率与腹泻率，降低畜禽的料肉比，可以显著提高畜禽肉的产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种丁酸梭菌，其特征在于，所述丁酸梭菌为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）XDY-1619；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.7.382，保藏时间：2022年8月23日。
2.如权利要求1所述的丁酸梭菌的分离、纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取样：取断奶仔猪的肠道内容物置于水中，充分振荡摇匀，获得待分离样品；
（2）分离与培养：将所述待分离样品水浴加热，然后进行厌氧培养，获得菌液；
（3）纯化：将所述菌液依次进行稀释、划线培养、纯化，然后保存备用。
3.一种发酵物，其特征在于，所述发酵物包括权利要求1所述的丁酸梭菌。
4.一种发酵上清液，其特征在于，所述发酵上清液是权利要求3所述的发酵物经离心后获得的上层澄清液。
5.一种菌悬液，其特征在于，所述菌悬液包括权利要求1所述的丁酸梭菌。
6.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的丁酸梭菌。
7.如权利要求1-2中任一项所述的丁酸梭菌、权利要求3所述的发酵物、权利要求4所述的发酵上清液、权利要求5所述的菌悬液、权利要求6所述的菌剂在制备饲料方面的应用。
8.一种生物饲料添加剂，其特征在于，所述生物饲料添加剂中丁酸梭菌的活菌数≥4.0×1010CFU/g。
9.一种饲料，其特征在于，所述饲料包含权利要求8所述的生物饲料添加剂。
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