CN103060222A

CN103060222A - 具有益生作用的枯草芽孢杆菌b27及其应用

Info

Publication number: CN103060222A
Application number: CN2012103510416A
Authority: CN
Inventors: 刁其玉; 张乃锋; 屠焰; 董晓丽; 周盟
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.6538的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27及其应用。本发明的枯草芽孢杆菌B27，最适pH7.2~7.4，最适温度37℃，能够耐受体内环境，具有良好的益生效果，作为一种新型的益生菌添加剂，可广泛应用于饲料中。

Description

具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27及其应用

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一种具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27及其应用。

背景技术

抗生素自20世纪50年代以来广泛应用于畜禽养殖业，在促进动物生长，保证动物健康，节约饲料成本，提高经济效益等方面做出了巨大贡献。由于抗生素在动物养殖业中的长期使用，近些年来，由其所致的毒副作用和药物残留问题已引起人们的关注。2006年，欧盟已经全面禁止了饲料中抗生素的使用，美国和日本等国家也对其做出了严格的限制。2011年，韩国全国禁止在动物饲料中添加抗生素。随着人们对畜产品安全和环境保护意识的不断加强，益生菌作为抗生素的替代品倍受关注，越来越多的应用于动物营养和饲料中。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂。其主要作用效果体现在改善动物新陈代谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。

由于芽孢杆菌对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。因此，获得新型具有益生特性的芽孢杆菌的研究具有重大意义。分离和筛选抗病原菌且具有益生效果的枯草芽孢杆菌，可以更好的应用于饲料添加剂，以代替抗生素。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27，是从北京市大兴养猪场附近土壤中筛选到的一株芽孢杆菌。经 16S rRNA基因序列分析和体外益生效果评价，该菌株为能够抑制病原菌且具有益生效果的枯草芽孢杆菌，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.6538，保藏日期2012年9月7日。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，无荚膜。菌体表明粗糙，在液体培养基中生长时形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉。

本发明还提供含有该具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的菌剂。

本发明还提供所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27或上述菌剂在广谱抗菌中的应用。其中，具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的抑菌谱包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，如Staphylococcus aureus IVDC C56005（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心）；所述革兰氏阴性菌为致病性大肠杆菌，如K88（Escherichia coli IVDC C83901），鼠伤寒沙门氏菌，如Salmonella typhimurium IVDC C79-13（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心）。

本发明还提供所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27在制备动物饲料添加剂中的应用。

本发明还提供一种含有该具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的动物饲料添加剂。

本发明还提供一种含有该具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的动物饲料。其中，所述动物饲料中枯草芽孢杆菌B27的活菌数为1.0×10⁸~3.0×10⁸CFU/g基础日粮，优选2.0×10⁸CFU/g基础日粮。

本发明通过体外法鉴定了枯草芽孢杆菌B27的益生效果，结果表明，枯草芽孢杆菌B27能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。

本发明还提供了一种体外法鉴定菌株耐酸、耐胆盐和模拟胃肠道环境中生长的益生潜力，包括以下步骤：

1)配制不同pH值的培养基，检测枯草芽孢杆菌B27的生长情况；

2)配制不同胆盐浓度的培养基，检测枯草芽孢杆菌B27的生长情况；

3)模拟人工胃肠液，检测枯草芽孢杆菌B27的生长情况。

本发明进一步验证了枯草芽孢杆菌B27在断奶仔猪饲料添加中的应用效果。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27，最适pH 7.2~7.4，最适温度37℃，能够耐受体内环境，具有良好的益生效果。它是一株能够抑制肠道内病原菌的益生菌，它能够耐酸耐盐耐人工胃肠液的环境，表明其具备益生菌的潜质。通过在断奶仔猪饲料添加中应用效果的研究，表明枯草芽孢杆菌B27可作为一种新型的益生菌添加剂，广泛应用于饲料中。

附图说明

图1为本发明实施例2中枯草芽孢杆菌B27抑制病原菌的生长情况；其中，A为对照组，B为试验组。

图2为本发明实施例4中枯草芽孢杆菌B27在不同pH值下的生长情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中涉及的试验材料和试剂：

1、菌株：病原菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus IVDC C56005）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium IVDC C79-13）、大肠杆菌K88（Escherichia coli IVDC C83901）由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供。

2、生化试剂：DNA提取试剂盒购自天根公司，胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶购自Sigma公司，其它均为国产试剂。

3、培养基：

（1）肉汤培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000mL，pH值7.2~7.4，121℃灭菌20min。

（2）肉汤固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000mL，琼脂20g，pH值7.2~7.4，121℃灭菌20min。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中描述的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 枯草芽孢杆菌的分离

采集北京市大兴养猪场附近的土壤，按1:10倍比稀释于生理盐水中。取100μL稀释液涂布于营养肉汤固体培养基上，37℃培养24h。挑起菌落表面形成皱醭的单菌落在营养肉汤固体培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法分离到36株菌种，分别命名为B1-B36。

实施例2 抗病原菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27的筛选

应用琼脂扩散的牛津杯法筛选具有抑菌活力的枯草芽孢杆菌。向肉汤培养基中加入琼脂后，溶解均匀，高压灭菌，冷却到50℃左右，每20mL培养基加入20μL新鲜培养的指示菌（10⁸CFU/mL），混匀倒入培养皿冷却。用灭菌的镊子将无菌的牛津杯轻轻的放入培养皿中，在牛津杯中分别加入B1-B36各80μL单株菌液，向另一个牛津杯中加入80μL无菌营养肉汤培养基作对照，37℃培养24h。筛选出能形成抑菌圈的菌液(图1)，其菌株编号为B27。

以上使用的指示菌分别为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus IVDC C56005）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium IVDC C79-13）、大肠杆菌K88（Escherichia coli IVDC C83901）。

实施例3 枯草芽孢杆菌B27的菌种鉴定

取10mL GF103培养液，低速离心获得菌体。用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，DP302）提取细菌总DNA。

以10ng纯化的细菌总DNA作为模板，扩增16S rRNA基因。所用引物为原核生物16S rRNA基因的通用引物：27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。引物由北京博迈德生物有限公司合成。

PCR扩增体系为50μL，包括0.5μL Taq酶（0.5U/mL）、5.0μL10×PCR反应缓冲液、4.0μL dNTP Mixture、1.0μL模板DNA、1.0μL正向引物27F(25μmol/L)、1.0μL反向引物1492R(25μmol/L)和37.5μL ddH₂O。

扩增条件：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30个循环；72℃ 7min，4℃终止反应。PCR产物序列测定由北京博迈德生物有限公司完成。

枯草芽孢杆菌B27经16S rRNA基因测序，提交到GenBank，获得序列登录号为JQ673431。测得序列经Blast比对，结果该菌株与GenBank中Bacillus subtilis strain A2 16S ribosomal RNA gene（GenBank accession number:EU567068）序列相似性为99%。初步确定B27为枯草芽孢杆菌。其微生物学特性为：革兰氏阳性菌，无荚膜。菌体表明粗糙，在液体培养基中生长时形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉。

实施例4 枯草芽孢杆菌B27耐酸耐胆盐特性测定

测定枯草芽孢杆菌B27在低pH中的生长状态，用1mol/L盐酸调节营养肉汤培养基为不同pH值梯度，分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和6.4。枯草芽孢杆菌B27培养液按1%（v/v）分别接种于不同pH值营养肉汤培养基中，37℃培养24h，测OD_600nm值。试验结果如图2所示，枯草芽孢杆菌B27在pH=2.0的培养基中存活率为34%，在pH=3的培养基中存活率为72%，说明枯草芽孢杆菌B27在低酸的环境能够保持一定的活菌数。

在营养肉汤培养基中加入猪胆盐，使其浓度分别为0%（对照）、0.15%、0.3%和0.6%。枯草芽孢杆菌B27接种于上述不同浓度的营养肉汤培养基中，37℃培养24h，通过平板计数法计算活菌数。结果见表1，枯草芽孢杆菌能够耐受0.3%胆盐浓度。由于动物体内胆盐浓度在0.3%左右，所以枯草芽孢杆菌B27能够体内的胆盐环境。

表1 枯草芽孢杆菌B27在不同浓度胆盐中培养24h的活菌数

注：a、b表示差异极显著(P<0.01)，下同。

实施例5 枯草芽孢杆菌B27抗人工胃肠液的耐受性测定

人工胃液的配制：取9.5%~10.5%的盐酸16.4mL，加水稀释，使pH值达3.0。每100mL溶液中加入1.0g胃蛋白酶，混匀，用0.2μm无菌滤膜过滤。

人工肠液的配制：称取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL溶解，用0.4%的氢氧化钠溶液调pH值至6.8，加水稀释至1000mL，每100mL液体中加入1.0g胰蛋白酶，混匀，用0.2μm无菌滤膜过滤。

将枯草芽孢杆菌B27培养液分别接种于人工胃液或人工肠液中，37℃，140r/min摇床培养，分别在0、30min和180min进行活菌平板计数。结果见表2，枯草芽孢杆菌B27在人工胃液中生长0.5h时，活菌数不受影响，生长3h时存活率在87.7%；枯草芽孢杆菌B27在人工肠液中生长0.5h，活菌数没有显著的变化，生长3h时存活率达到96.8%。该结果说明枯草芽孢杆菌能够耐受人工胃肠液的环境。

表2 枯草芽孢杆菌B27在人工胃肠液中的活菌数

实施例6 枯草芽孢杆菌B27在断奶仔猪饲料添加中应用效果的测定

1、枯草芽孢杆菌B27制剂的制备

将枯草芽孢杆菌B27接种于营养肉汤培养基中，37℃培养24h。将1L培养物与0.25kg麸皮混合真空冷冻干燥。应用平板计数法计算冻干样品中的活菌数为2.0×10⁸CFU/g。

2、枯草芽孢杆菌B27在断奶仔猪饲料添加中应用的试验设计

试验采用单因子随机区组试验设计，将64头断奶仔猪随机分成2个组，每组4个重复，每个重复8头猪。试验分为2个处理组：1）对照组（CT），饲喂基础日粮（不添加抗生素和益生菌）；2）枯草芽孢杆菌组（BS），基础日粮+枯草芽孢杆菌B27制剂（2.0×10⁸CFU/猪·d）；试验全过程共35d，分为两个阶段，第一阶段为0-14d，第二阶段为15-35d。

3、枯草芽孢杆菌B27在断奶仔猪饲料添加中应用效果的测定

饲喂枯草芽孢杆菌B27对断奶仔猪生长性能的影响见表3。结果表明，试验第一阶段即仔猪断奶初期，饲喂仔猪枯草芽孢杆菌B27能降低饲料采食量（P<0.05），并能改善饲料转化率（P<0.05），仔猪的平均每天日增重不受益生菌的影响（P>0.05）。试验第二阶段即断奶后期，日粮益生菌对仔猪日增重、平均采食量和饲料转化率均无显著影响（P>0.05）。在整个试验期，仔猪日粮中添加枯草芽孢杆菌B27能够改善饲料转化率（P<0.05），但是平均采食量和日增重未受到影响（P>0.05）。

表3 饲喂枯草芽孢杆菌B27对断奶仔猪生长性能的影响

饲喂枯草芽孢杆菌B27对断奶仔猪血清免疫指标的影响见表4。结果表明，在试验第14d和第35d，日粮添加枯草芽孢杆菌B27仔猪血清IgM的含量均显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比，试验第35d，饲喂枯草芽孢杆菌B27的仔猪血清中IgA的浓度显著高于对照组(P<0.05)。

表4 饲喂益生菌对断奶仔猪血液免疫指标的影响

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.具有益生作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B27，其保藏号为CGMCC NO.6538。

2.含有权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的菌剂。

3.权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27或权利要求2所述菌剂在广谱抗菌中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的抑菌谱包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；

所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌为致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌。

5.权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27在制备动物饲料添加剂中的应用。

6.一种含有权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的动物饲料添加剂。

7.一种含有权利要求1所述具有益生作用的枯草芽孢杆菌B27的动物饲料。

8.根据权利要求7所述的动物饲料，其特征在于，动物饲料中枯草芽孢杆菌B27的活菌数为1.0×10⁸~3.0×10⁸CFU/g基础日粮。

9.根据权利要求8所述的动物饲料，其特征在于，动物饲料中枯草芽孢杆菌B27的活菌数为2.0×10⁸CFU/g基础日粮。