TWI569731B

TWI569731B - 飼料添加菌劑及其製備方法

Info

Publication number: TWI569731B
Application number: TW104144444A
Authority: TW
Inventors: 高婉容; 黃俊男; 魏偉勝; 陳敏敏; 楊逸至; 林俊良
Original assignee: 聯發生物科技股份有限公司
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2017-02-11
Also published as: TW201722285A

Description

飼料添加菌劑及其製備方法

一種飼料添加菌劑及其製備方法，尤指一種可利用解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)或其組合添加碳酸鈣粉末後所製成的飼料添加菌劑及其製備方法。

畜牧農業的發展已伴隨著人類社會數百年的歷史，近年來，用於禽畜類的飼料，為了其功能性而參入許多種類的飼料添加劑。

而一般的常見的飼料添加劑功能包括增加動物攝食量、提高動物生產力、提高健康水平、改善飼料質量、調節動物生理過程、提高動物相關產品品質以及改善環境狀況等。

其中，亦有幫助動物吸收飼料營養之飼料添加劑，一般這類飼料添加劑屬於微生物製劑的一種。以往微生物製劑以大多以乳酸菌類為主，但若使用單一菌種或僅使用純乳酸菌，往往可獲得之效果十分有限。

近年來人們遂開始尋找其他較為合適之菌株作為研發目標，其中，安全性與有效性皆佳的產孢型非腸道菌類逐漸被人們發現其功效，除了前述之優點外，更可使飼料發揮的效果更加多元化。惟該類菌株之運用方式中，尚未找到具有多重功效之優良複合製劑。

為解決先前技術中所提及之問題，本發明提供了一種飼料添加菌劑，包含一菌粉及一填充物，該填充物可為碳酸鈣粉末或麥芽糊精等。

其中該菌粉包含複數個菌株，包含一枯草桿菌(Bacillus subtilis)、一短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)或其組合。

上述該複數個菌株之總菌數為每公克至少1x10⁹菌落形成單位(CFU/g)，且每一該複數個菌株佔該飼料添加菌劑之重量百分比相等，而該填充物之使用方式係將菌粉稀釋至目標濃度。

本飼料添加菌劑所述該枯草桿菌(Bacillus subtilis)之寄存號碼為NITE BP-02169，而該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)之寄存號碼為NITE BP-02170。

此外，本發明更提供了一種飼料添加菌劑的製備方法，首先執行步驟(a)，挑選一菌株接入一第一種瓶中活化，該菌株為一枯草桿菌(Bacillus subtilis)、或一短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。

接著執行步驟(b)，再將該第一種瓶中該菌株之菌落接入一第二種瓶中放大，該第二種瓶之容量大於該第一種瓶，其後執行步驟(c)，透過一接種箱再將該菌株接入一發酵槽同時活化放大，直至該菌株進入對數生長期。

再執行步驟(d)，將該菌株打入一發酵罐直至該菌株孢子化，並製備為一菌粉，之後執行步驟(e)，重複步驟(a)~(d)直至該枯草桿菌(Bacillus subtilis)、及該短小芽孢桿菌(Bacillus pumulus)皆製備為該菌粉並均勻混和，且該枯草桿菌(Bacillus subtilis)、及該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)佔該菌粉之重量百分比相等，最後，執行步驟(f)，將該菌粉與一填充物均勻混合。

本飼料添加菌劑的製備方法所述該枯草桿菌(Bacillus subtilis)之寄存號碼為NITE BP-02169，而該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)之寄存號碼為NITE BP-02170。

本發明更提供了一種一種菌株篩選方法，包含步驟(甲)，選取一土壤作為樣本，接著執行步驟(乙)，取一重量之該樣本加入無菌水中，依序於一第一條件及一第二條件中培養，再執行步驟(丙)，將該樣本序列稀釋為10⁴~10⁷倍，得到一樣本稀釋液。

接著執行步驟(丁)，將該樣本稀釋液塗抹於對應之篩選培養基，以一第三條件培養，獲得如請求項1所述之複數個菌株，最後依序執行步驟(戊)對該複數個菌株鑑定其16S rDNA序列及澱粉、纖維、脂質、蛋白質、鈣磷、鐵磷、鋁磷分解能力是否符合標準，以及步驟(己)將符合標準之該複數個菌株保存。

(甲)~(己)‧‧‧步驟

(a)~(f)‧‧‧步驟

圖1係本發明飼料添加菌劑之菌株篩選方法流程圖。

圖2係本發明飼料添加菌劑之製備方法流程圖。

為能瞭解本發明的技術特徵及實用功效，並可依照說明書的內容來實施，茲進一步以如圖式所示的較佳實施例，詳細說明如後：本實施例所述之飼料添加菌劑包含菌粉及其填充物，其中該填充物可為碳酸鈣粉末或麥芽糊精，依照使用者判斷該飼料添加菌劑是否需溶於水而決定。而該填充物佔該飼料添加菌劑之重量百分比為98%以上(視菌粉濃度調整比例)，且該飼料添加菌劑含水量之重量百分比為10%以下。

其中該菌粉包含複數個菌株，包含一枯草桿菌(Bacillus subtilis)、一短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)或其組合。又，在其他實施例中，該複數個菌株更可包含一解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。而上述之菌株係透過如下方式篩出：請參照圖1，圖1係本發明飼料添加菌劑之菌株篩選方法流程圖。所述之複數個菌株係藉由土壤篩選而得，首先執行步驟(甲)，選取一土壤作為樣本。該土壤之質地為砂壤土(Sand silt)，更精確地來說，係為屏東縣長治鄉聯發生物科技股份有限公司場內之土壤。

接著，執行步驟(乙)，取一重量之該樣本加入無菌水中，依序於一第一條件及一第二條件中培養。在本實施例中，首先會取1公克之樣本加入50毫升的無菌水中，接著以第一條件，也就是在室溫28℃下培養24小時，接著再以第二條件28℃的條件之下培養16小時以上。

再執行步驟(丙)，將該樣本序列稀釋為10⁴~10⁷倍，得到一樣本稀釋液。本實施例中所述之序列稀釋係以序列稀釋塗盤的方式進行，取1毫升之樣本液體加9毫升之無菌水，依照技術人員之需求稀釋為10⁴~10⁷倍。

接著執行步驟(丁)，將該樣本稀釋液塗抹於對應之篩選培養基，以一第三條件培養，獲得如前述之複數個菌株。本實施例係將前述之每1毫升的樣本稀釋液塗於相對應篩選培養基上，培養基可選自營養洋菜培養基(Nutrient Agar,NA)或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato Dextrose Agar,PDA)，再以第三條件28℃培養24小時後，觀察其菌相及菌數。

接著執行步驟(戊)，對該複數個菌株鑑定其16S rDNA序列及澱粉、纖維、脂質、蛋白質、鈣磷、鐵磷、鋁磷分解能力是否符合標準。本實施例中，該複數個菌株對於澱粉、纖維、脂質、蛋白質、鈣磷、鐵磷、鋁磷的分解能力係藉由在培養基中參雜該些物質並觀察其代謝反應或檢測其產物而得；而16S rDNA之序列可以透過次世代定序(Next Generation Sequencing,NGS)等方式判斷，本發明不以此為限。

最後，執行步驟(己)，將符合標準之該複數個菌株保存。本實施例係將該複數個菌種純化後再以甘油(Glycerol)製作為凍管保存於-80℃之冷凍裝置中。

本實施例所篩選出解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)之品系編號為AGB-F002，該枯草桿菌(Bacillus subtilis)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)AGB-F002及短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)其16SrDNA基因序列之特徵依序如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示。

上述該複數個菌株之總菌數為每公克至少1x10⁹菌落形成單位(CFU/g)，且每一該複數個菌株佔該飼料添加菌劑之重量百分比相等，而該填充物與該菌粉均勻混合。

在本實施例中，將舉以實際用於農畜動物身上之實例以及實驗數據，證明本發明足具有優異之功效及進步性。

實施例1

請參照表1-1~1-2，表1-1係以「雞」做為餵養動物之實驗條件；表1-2為本實施例所獲得增肉率之相關結果。

實施條件：

(1)選用白肉雞(Gallus gallus)之雛雞12隻，並分為兩組，空白組僅餵養一般飼料；實驗組之飼料添加有本實施例所述之飼料添加菌劑。

(2)進行三重覆之試驗。

(3)餵養間期：五週。

(4)早晚各供應一次50公克之雞飼料。

接著請參照表1-2之實驗結果，本實施例係以飼料增肉率(Feed Conversion Rate,FCR)作為計算標準，飼料增肉率是指每增重一個單位體重所需的飼料量，若FCR之為3，則代表需要使用3單位的飼料來增加一單位餵養生物之重量。

因此，本實施例顯示加入飼料添加菌劑後，對於餵養雞隻而言，可提升飼料利用率、促進雞隻生長與吸收，進而使飼料增肉率(Feed Conversion Rate,FCR)下降。

接著，請參照表1-3，表1-3係針對利用本飼料添加菌劑於雞隻後，對雞蛋質量影響之結果。

在雞蛋質量的實驗中，所有條件均與表1-1極其實施條件相同，僅餵養間期拉長至3個月，而測定之方式採用諾德斯卡格和范斯沃夫法(Nordskog and Famsworth)檢定之，其中檢定項目包含：

i.雞隻均日產蛋率：計算每日蛋數並除以當日活雞數取百分比(%)，將試驗期間之數值平均即得。

ii.雞隻均日產蛋重：計算每日蛋重並除以當日活雞數，將試驗期間之數值(公克)平均即得。

iii.蛋殼強度：使用電動式拉力機進行測定，測定時將雞蛋正放(尖端朝上)，速度設定為50毫米/分鐘，而其測定單位為公斤。

iv.蛋殼厚度：將雞蛋上中下部分(尖端、中端、鈍端)各取一片蛋殼，精測其厚度(毫米)後取平均值，此為蛋殼之厚度。

因此，本實驗之結果如下表1-3所示。

在實施例1中，該飼料添加菌劑隨著飼料被雞攝入其腸胃道中，除可以穩定雞體內的腸道菌群外，更改善了雞只對於飼料養分的吸收，因此本實施例之飼料添加菌劑可以在不用增加飼料消耗量的狀況下，增加雞隻的增重率，使其消化較為完整，並降低有毒氮氣的排放，進而改善雞舍中的臭味問題；此外，微生物更能夠改善雞只對於蛋白質、鈣質與微量元素的消化與吸收。

此外，在餵養雞隻的期間，實施例1更研究了選用本實施例之飼料添加菌劑造成相關的環境影響。首先，在實施之雞舍裡，其空氣中硫化氫、氨氣及其它臭味顯著減少，而水源的部分，水中之有機質分解較完全，生化需氧量(Biochemical oxygen demand,BOD)下降，此外，該飼料添加菌劑中之微生物隨著雞隻的排泄物排放至土壤中，重建土壤菌相，使有機質分解快速、完全，增加土壤肥力。

此外，根據糞便軟硬程度，實際上可看出家禽的健康狀況，對於雞隻而言，下痢是病變的原因之一，有礙生長及降低飼料效率，過份的硬便也是消化不良的現象，會造成對生長有不良影響；而糞便鬆軟則表示其消化吸收良好。

係因本實施例之飼料添加菌劑可使腸內菌族群改變，進而促進其分泌出豐富的消化酵素，分解飼料營養物質使飼料的消化吸收更快速更完全，排泄物在大腸停留時間較短，被吸收的水份也減少，所以糞便鬆軟。

至於對雞隻內分泌的影響，本實施例中之枯草桿菌在小腸中進行醯酵時能產生促進腦下垂體分泌正常，而促使家禽發育良好，改善雞群整齊度，使出產之家禽良率較高，此外，更可增強雞隻的抵抗力。

此外，表1-3中更證明了，本飼料添加菌劑對於雞蛋質量亦有相當正面之影響，添加本實施例飼料添加菌劑之後，雞隻其均日產蛋率較空白組高25%，且該組之蛋重、蛋殼強度與厚度均較空白組高。可見添加本實施例飼料添加菌劑對於雞隻所產之雞蛋質量有顯著提升。

綜上所述，在實施例1中，將本實施例所述之飼料添加菌劑用於雞隻的飼養時，所產出之雞肉彈性較佳，品質提高，此外亦提高了整體雞群之良率；除此之外更具有節省成本的額外優點，縮短飼養時間、提高飼料效率，而雞隻發育良好，在抵抗力較佳的情況下，雞隻不易發生疾病，間接省去綜合維他命及抗生素之使用。

實施例2

請參照表2-1~2-2，表2-1係以「豬」做為餵養動物之實驗條件；表2-2為本實施例所獲得平均成長率及飼料轉換率之相關結果。

實施條件：

(1)選用體重80公斤左右之大豬(Sus scrofa domestica)18隻，並分為兩組，空白組僅餵養一般飼料；實驗組之飼料添加有本實施例所述之飼料添加菌劑。

(2)餵養間期：49天。

接著請參照表2-2，表2-2係本實施例餵養試驗之結果。

以添加有該飼料添加菌劑的飼料餵食豬隻後，可增加其腸道環境中的有益菌含量，提升豬只對於飼料和養分的吸收，因此，使用本實施例飼料添加菌劑可以在不增加飼料的用量下，增加豬隻的平均成長率。此外，腸道中的益生菌被排泄出體外後，亦能在糞便中存活，讓糞便更容易分解，減少處理所需時間。

其功效除了如前述實施例1中所述具有提升豬肉質量及增加豬隻免疫力之功效相當之外，利用本實施例之飼料添加菌劑餵養之豬群更具有額外的優點，例如豬隻之糞便鬆軟，易於清潔沖洗，除了可節省水力及人力的費用之外，飼料添加菌劑中之微生物隨排泄物排出在體外後，尚能繼續繁殖，可進一步的分解排泄物中的有機質，在未來製成肥料時，可間接改善土壤菌相，提高排泄物的再利用價值。

由於本實施例所述之飼料添加菌劑主要之作用位置係主要位於蓄養動物之消化道，因此其實際上在動物體消化道中之狀態亦顯得相當重要。接著，將針對本實施例所述之飼料添加菌劑進行腸胃道模擬耐受性測試。本腸胃道模擬耐受性測試之測試項目主要有兩大項，包含：

a.酸鹼值與溫度

b.鹽度

當混有本實施例飼料添加菌劑之飼料由動物體之口腔經由食道進入胃後，酸鹼值(pH)會驟降至1.5~2.5左右，但進入十二指腸後，酸鹼值會陡升為9，接著在腸道維持中性偏鹼的酸鹼值。因此，本實施例之菌株必須具備可以克服劇烈酸鹼值變化之特性才得以生存。

此外，由於飼料之保存或加工，有時會在高溫下進行造粒，故如本實施例中飼料添加菌劑等微生物製劑的耐熱性亦是一大重點。

通常以酵素或乳酸菌等生物製劑的熱穩定性較差，但本實施例飼料添加菌劑之熱穩定性相當優異，主要係因本實施例飼料添加菌劑於製備完成時，其內之菌株皆已形成內孢子之型態。

因此，在a.酸鹼值與溫度的測試項目中，下表3-1之實驗結果證明，本實施例飼料添加菌劑所採用之菌株具備順利抵達動物體腸道之特性。

其中，內孢子態時可存活之溫度範圍雖為-20℃~65℃，但實際上本實施例之飼料添加菌劑在特殊情況下最高可耐受維持100℃十分鐘或90℃二十分鐘的環境，因此可接受飼料在造粒時產生的瞬間高溫。

而下表3-2則是本實施例飼料添加菌劑對於b.鹽度之耐受程度試驗結果，由於被畜養之動物不一定會使用市售的飼料，故須考慮鹽度是否會影響本實施例飼料添加菌劑中菌株之活性。

在試驗b.中，將飼料添加菌劑中之菌株分別培養在鹽度0%、1%、3%、5%及10%的培養液中，於48小時後塗在培養皿上，結果顯示所有種類之菌株皆可於鹽度10%的環境下存活，表示在正常且常用的畜牧飼料中，本實施例之飼料添加菌劑不會因不同配方產生的不同鹽度，進而影響到其功效。

因此，根據上述所有實驗結果，本實施例飼料添加菌劑可同時發揮多種功效，包括抑制害菌生存、提高飼料利用率並促進中營養物質的消化與吸收以及增加動物之免疫能力，此外，更具有使用便利以及利於各種加工方式之優點，足見其進步性。

此外，本發明更提供了一種飼料添加菌劑的製備方法，首先請參照圖2，圖2係本發明飼料添加菌劑之製備方法流程圖。

如圖2所示，首先執行步驟(a)，挑選一菌株接入一第一種瓶中活化，該菌株為枯草桿菌(Bacillus subtilis)及短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。當然，更可包含前述之解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。其中，如前所述，本實施例採用之解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)係解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)AGB-F002之品系，此外，該菌株會被接入100毫升之第一種瓶活化24小時，待活化完畢之後執行步驟(b)。

在步驟(b)中，所述菌株會被接入2公升的種瓶進行第一次次的菌種放大，其放大時間約18-24小時，其後便進入步驟(c)，將步驟(b)中已放大之該該菌株，利用接種箱接入500公升之發酵槽中，同時活化以及再次放大，直到測量該菌株之數量進入對數生長期(Exponentialphase)。

步驟(c)中所採用之活化放大條件係以通氣量0.3vvm、轉速80 r.p.m.以及溫度35℃之條件進行活化放大，本實施例另該菌株生長至對數生長期所需之時間約莫為12小時。

待基礎菌株之數量足夠後，執行步驟(d)，將該菌株打入一發酵罐直至該菌株孢子化，並製備為一菌粉。步驟(d)中所述之發酵罐係選用5噸(T)之發酵罐，待該菌株孢子化後收集該些內孢子，形成菌粉。

本實施例製作菌粉之方式主要包三步驟，首先執行步驟I，將該菌株之發酵液經轉速14000rpm處理，並取得一菌泥，接著執行步驟II，將該菌泥添加一保護劑後冷凍乾燥，冷凍乾燥之條件為：溫度攝氏-50℃~60℃、壓力0毫米汞柱(mmHg)，並維持48小時的時間，完成後可取得乾燥菌塊；最後，執行步驟III，將該乾燥菌塊粉碎後製得該菌粉。

其中，上述步驟II中之保護劑可為甘油(Glycerol)等抗凍劑，本發明不以此為限。

之後執行步驟(e)，重複步驟(a)~(d)直至該枯草桿菌(Bacillus subtilis)、該解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)及該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)皆製備為該菌粉並均勻混和，且該枯草桿菌(Bacillus subtilis)、該解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)或該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)佔該菌粉之重量百分比相等。

由於本實施例係以最佳實施例作為範例，因此需以三種菌株之菌粉製備後均勻混合而得之，而本實施例中所述乾燥菌塊及該菌粉之目數(mesh)為80~100單位。

最後，執行步驟(f)，將該菌粉與一填充物均勻混合。其中，所述填充物可為碳酸鈣粉末或麥芽糊精，其所佔製備完成後飼料添加菌劑之重量百分比為98%以上。

待該飼料添加菌劑製備完成後，尚須檢驗該飼料添加菌劑是否符合規格。首先，針對質量檢驗請參照下表4，表4係針對飼料添加菌劑之檢驗項目及其標準表。

首先，本實施例對於總菌數之檢測法係利用平板計數法(Plate Count Method)測得，本實施例所採之平板計數法係屬於一種密度測定法。先將本實施例所製備之飼料添加菌劑經過適當的10倍連續稀釋後，在無菌操作下，吸取1毫升稀釋水樣至無菌培養皿(petri dish)(二重複)，待稀釋水乾燥後，倒置在30℃之培養箱內24~48小時。而本實施例培養皿中之培養基係選用營養洋菜培養基(Nutrient Agar,NA)。

直至菌落生成後，選擇菌落生成數目在30至300之間者計數，並反推算原飼料添加菌劑之含菌密度。利用所述之平板計數法可以測出總好氧、兼氧異營性細菌密度。

本實施例中，酸鹼值(pH)值之計算可先將飼料添加菌劑以去離子水(Deionized water)稀釋至1%之後，再利用酸鹼計(pH meter)或其他可測得酸鹼值之方法達成；而針對含水量之計算，本實施例以紅外線水分分析儀測定。將紅外線水分分析儀歸零後放入2.1公克的飼料添加菌劑到測定盤上，開始測定，直至螢幕顯示水分含量後即完成。

最後，外觀之部分僅以肉眼進行光學觀察即可得之，本發明不以此為限。

本實施例中所述之該枯草桿菌(Bacillus subtilis)係以寄存號碼NITE BP-02169所活存之菌種據以實施，而短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)則以寄存號碼NITE BP-02170所活存之菌種據以實施。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即依本發明申請專利範圍及說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明涵蓋之範圍內。

【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

枯草桿菌(Bacillus subtilis)：

寄存國家：日本國

寄存機構：獨立行政法人製品評價技術基盤中心專利微生物寄託中心(独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託 ,NITE Patent Microorganisms Depositary(NPMD))

寄存日期：西元2015年12月3日

寄存號碼：NITE BP-02169

短小芽孢桿菌( Bacillus pumilus ) ：

寄存國家：日本國

寄存日期：西元2015年12月3日

寄存號碼：NITE BP-02170

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<212> DNA

<213> 解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)

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<212> DNA

<213> 短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)

<220>

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<222>

<400> 3

(a)~(f)‧‧‧步驟

Claims

一種飼料添加菌劑，包含：一菌粉，包含複數個菌株，其中該複數個菌株包含一枯草桿菌(Bacillus subtilis)、一解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)及一短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，該複數個菌株之總菌數為每公克至少1x10⁹菌落形成單位(CFU/g)，且每一該複數個菌株佔該飼料添加菌劑之重量百分比相等；以及一填充物，與該菌粉均勻混合；其中，該枯草桿菌(Bacillus subtilis)之寄存號碼為NITE BP-02169；該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)之寄存號碼為NITE BP-02170。
如請求項1所述之飼料添加菌劑，其中該填充物可為碳酸鈣粉末或麥芽糊精，該填充物佔該飼料添加菌劑之重量百分比為98%。
如請求項1所述之飼料添加菌劑，其中該飼料添加菌劑含水量之重量百分比為10%以下。
如請求項1所述之飼料添加菌劑，其中該複數個菌株之16S rDNA序列為：枯草桿菌(Bacillus subtilis)為SEQ ID NO.1之序列；解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)為SEQ ID NO.2之序列；短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)為SEQ ID NO.3之序列。
一種飼料添加菌劑的製備方法，包含：(a)挑選一菌株接入一第一種瓶中活化，該菌株為一枯草桿菌(Bacillus subtilis)、一解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)或一短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)； (b)再將該第一種瓶中該菌株之菌落接入一第二種瓶中放大，該第二種瓶之容量大於該第一種瓶；(c)透過一接種箱再將該菌株接入一發酵槽同時活化放大，直至該菌株進入對數生長期；(d)將該菌株打入一發酵罐直至該菌株孢子化，並製備為一菌粉；(e)重複步驟(a)~(d)直至該枯草桿菌(Bacillus subtilis)、該解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)及該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)皆製備為該菌粉並均勻混和，且該枯草桿菌(Bacillus subtilis)、該解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)及該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)佔該菌粉之重量百分比相等；以及(f)將該菌粉與一填充物均勻混合，並製成如請求項1乃至4所述之一飼料添加菌劑；其中，該枯草桿菌(Bacillus subtilis)之寄存號碼為NITE BP-02169；該短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)之寄存號碼為NITE BP-02170。
如請求項5所述之飼料添加菌劑的製備方法，步驟(b)中該第一種瓶之容量為100毫升，該第二種瓶之容量為2公升。
如請求項5所述之飼料添加菌劑的製備方法，步驟(c)中該發酵槽之容量為500公升。
如請求項5所述之飼料添加菌劑的製備方法，步驟(c)中之活化放大條件為通氣量0.03vvm、轉速80r.p.m.及溫度攝氏35℃。
如請求項5所述之飼料添加菌劑的製備方法，步驟(d)中該發酵罐為5噸(T)發酵罐。
如請求項5所述之飼料添加菌劑的製備方法，步驟(d)中製備為該菌粉的方法包含：I. 將該菌株之發酵液經轉速14000rpm處理，並取得一菌泥；II. 將該菌泥添加一保護劑後冷凍乾燥，冷凍乾燥之條件為：溫度攝氏-50℃~60℃、壓力0毫米汞柱(mmHg)以及時間48小時，並取得一乾燥菌塊；以及III. 將該乾燥菌塊粉碎後製得該菌粉。
如請求項10所述之飼料添加菌劑的製備方法，步驟II.中之該保護劑為甘油(Glycerol)。