TWI750530B - 動物用益生芽孢桿菌製劑及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種動物用益生芽孢桿菌製劑，其包括至少三菌株，該至少三菌株包括至少一第一類菌株、至少一第二類菌株及至少一第三類菌株，各該第一類菌株具高蛋白酶(protease)活性，各該第二類菌株可抑制病原菌，各該第三類菌株具有降解黃麴毒素之活性，各該第一類菌株、各該第二類菌株及各該第三類菌株分別選自一枯草芽孢桿菌或一液化芽孢澱粉桿菌；以及一載體，與該至少三菌株均勻混合。本發明關於一種前述動物用益生芽孢桿菌製劑之製備方法，從前述第一至三類菌株各選出單一菌種培養於含有碳源及氮源之液體培養基中，再與該載體混合。

Description

動物用益生芽孢桿菌製劑及其製備方法
本發明係有關於一種動物用益生芽孢桿菌製劑及其製備方法。
歐洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA) (2015) 將益生菌定義為Direct Feed Microbial (DFM)，為具「穩定單胃和反芻動物消化道中的微生物菌相」功能的微生物飼料添加物。而聯合國糧食及農業組織(FAO)及世界衛生組織(WHO)則將益生菌定義為「足量使用的情況下，對宿主健康有益的活體微生物」。益生菌亦被定義為單種或多種混和的活微生物，透過改善、平衡腸道菌相以提升宿主腸道狀態，進而促進腸道健康，部分研究報告顯示益生菌可調節宿主免疫系統。
歐洲負責評估飼料添加物的歐盟食品安全域性(EFSA)採用安全菌株認可(Qualified presumption of safety, QPS)安全資格認定作為微生物風險評估工具，安全菌株認可(Qualified presumption of safety, QPS)為歐盟食品安全域性(EFSA)於2007年所建立，對進入飼料、食品鏈中的微生物進行飼用、食品及環境安全風險評估，並針對較安全的菌種擬定安全菌株認可(Qualified presumption of safety, QPS)菌種列表，飼料用安全菌種為安全菌株認可(Qualified presumption of safety, QPS)或菌種已核准作為食品添加物時，不需進行對象動物耐受性試驗(Tolerancestudies)；而微生物飼料添加物僅含安全菌株認可(Qualified presumption of safety, QPS)菌種時，不需進行微生物試驗(Microbial studies)。美國管理准許使用之動物飼料添加物品目採正面表列，一為公認安全 (Subtances generally recognized as safe, GRAS)，另一為通過申請之飼料添加物。
益生菌是對動物具有益處的活性微生物，在通過一定的攝取量後，對宿主產生一種或多種特殊的作用，進而超越固有的基本營養價值；如芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等，腸胃道有益菌的生長及定值，能顯著減少病原菌的數量。
芽孢桿菌因會產生孢子的特性而被廣泛研究，並產生抗微生物化合物且合成不同的外源酶，例如：澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶和肌醇六磷酸酶(植酸酶)能使芽孢桿菌屬菌株有助於提高營養物質消化率、降低腸黏度、維持有益的腸道微生物群，最終能促進家禽的腸道健康。芽孢桿菌可作為直接餵養動物的微生物以替代抗生素，提高家禽的生長、免疫力和腸道健康。
然而以往都是以單一菌種作為生物製劑(如添加於動物的飼料)，導致其使用上的效果有限。
因此，有必要提供一種新穎且具有進步性之動物用益生芽孢桿菌製劑之製造方法，以解決上述之問題。
本發明之主要目的在於提供一種動物用益生芽孢桿菌製劑及其製備方法，其提供具多重功能的複合製劑且耐熱性佳。
為達成上述目的，本發明提供一種動物用益生芽孢桿菌製劑，包括：至少三菌株，該至少三菌株包括至少一第一類菌株、至少一第二類菌株及至少一第三類菌株，各該第一類菌株具高蛋白酶(protease)活性，各該第二類菌株可抑制病原菌，各該第三類菌株具有降解黃麴毒素之活性，各該第一類菌株、各該第二類菌株及各該第三類菌株分別選自一枯草芽孢桿菌或一液化芽孢澱粉桿菌；以及一載體，其與該至少三菌株均勻混合。
為達成上述目的，本發明另提供一種動物用益生芽孢桿菌製劑之製備方法，用以製成如前述之動物用益生芽孢桿菌製劑，該製備方法包括步驟：(1)從該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株中各選出單一菌種培養於含有碳源及氮源之液體培養基中，以溫度範圍30.00℃至40℃下培養數小時；(2) 添加保護劑至該液體培養基後，再以40.00℃至50.00℃保溫使該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株分別產孢5小時至10小時；(3) 混合產孢後的該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株並添加佔該製劑之重量百分比為10.00%至15.00%之載體混合均勻乾燥後，即可獲至少為109 CFU/g之動物用益生芽孢桿菌製劑。
以下僅以實施例說明本發明可能之實施態樣，然並非用以限制本發明所欲保護之範疇，合先敘明。
請參考圖1至4，其顯示本發明之一較佳實施例，本發明之動物用益生芽孢桿菌製劑，包括：至少三菌株及一載體。
該至少三菌株包括至少一第一類菌株、至少一第二類菌株及至少一第三類菌株，各該第一類菌株具高蛋白酶(protease)活性，各該第二類菌株可抑制病原菌，各該第三類菌株具有降解黃麴毒素之活性，各該第一類菌株、各該第二類菌株及各該第三類菌株分別選自枯草芽孢桿菌或液化芽孢澱粉桿菌；以及該載體與該至少三菌株均勻混合。於本實施例中，該至少三菌株之總菌數為每公克至少1x109 菌落形成單位(CFU/g)，該載體佔該動物用益生芽孢桿菌製劑之重量百分比為10.00%至15.00%。本發明之動物用益生芽孢桿菌製劑可耐熱85℃至少10分鐘不失去活性。也就是說，本發明之動物用益生芽孢桿菌製劑為提供多重功能的複合製劑且耐熱性佳。
各該第一類菌株、各該第二類菌株及各該第三類菌株，均為貿立實業股份有限公司分離鑑定為公認安全 (Subtances generally recognized as safe, GRAS)之安全菌株，並以MS編號後，於NCBI基因資料庫註冊之菌株。其中可選用之菌株名稱及系統演化樹(phylogenetic tree)，如圖2。詳細地說，該至少一第一類菌株為於NCBI基因資料庫註冊之菌株，該至少一第一類菌株為編號為NCBI登錄編號為10502182之枯草芽孢桿菌MS00903、NCBI登錄編號為10691089 之枯草芽孢桿菌MS07903、枯草芽孢桿菌MS10002、枯草芽孢桿菌MS30002、NCBI登錄編號為10496972 之液化芽孢澱粉桿菌MS02204、液化芽孢澱粉桿菌MS06503或液化芽孢澱粉桿菌MS06704。
該至少一第二類菌株於NCBI基因資料庫註冊之菌株，該至少一第二類菌株為NCBI登錄編號為10502182之枯草芽孢桿菌MS00903、NCBI登錄編號為10691089 之枯草芽孢桿菌MS07903、枯草芽孢桿菌MS50001、枯草芽孢桿菌MS50002、液化芽孢澱粉桿菌MS06503或液化芽孢澱粉桿菌MS06704。該至少一第二類菌株可抑制下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙門氏菌(Salmonella typhimuriunm)、水禽雷氏桿菌(Riemerella anatipestifer)。
該至少一第三類菌株於NCBI基因資料庫註冊之菌株，該至少一第三類菌株選自編號為枯草芽孢桿菌MS20022或枯草芽孢桿菌MS20023。
本發明另提供一種動物用益生芽孢桿菌製劑之製備方法，用以製成如前述之動物用益生芽孢桿菌製劑，該製備方法包括步驟：(1) 從該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株中各選出單一菌種培養於含有碳源及氮源之液體培養基中，以溫度範圍30.00℃至40℃(於本實施例為溫度範圍35.00℃至37.00)下培養數小時(於本實施例為24至48小時)。(2) 添加保護劑至該液體培養基後，再以溫度範圍40.00℃至50.00℃(較佳45.00℃)保溫使該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株分別產孢5小時至10小時(本實施例為6小時至8小時)；(3) 混合產孢後的該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株並添加佔該製劑之重量百分比為10.00%至15.00%之載體混合均勻乾燥後，即可獲至少為109 CFU/g之可於2小時至4小時內萌芽之該動物用益生芽孢桿菌製劑，該動物用益生芽孢桿菌製劑為粉末狀。
該液體培養基含有0.50%至2.50%碳源；該碳源種類係選自糖蜜、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖及玉米糖漿所組成之群組。較佳地，該碳源種類為糖蜜佔該液體培養基的重量百分比範圍為0.50%至1.00%，使益生芽孢桿菌生長佳。
該液體培養基含有0.05%至2.50%(較佳地0.10%至2.50%)氮源，該氮源種類係選自大豆分離蛋白、大豆胜肽、酵母抽出物、魚粉及羽毛粉所組成之群組；較佳地，該氮源種類為大豆胜肽佔該液體培養基的重量百分比範圍為0.10%至0.50%，使益生芽孢桿菌生長佳。
該保護劑的添加量佔該製劑之重量百分比為0.02%至0.25%；該保護劑為無機材質保護劑，該保護劑種類係選自活性碳、矽藻土、黏土及二氧化矽所組成之群組。較佳地，該保護劑為活性碳，添加量佔該動物用益生芽孢桿菌製劑之重量百分比為0.02%至0.20%使各該菌株/種在高溫85℃及pH 2.0~3.0的鹽酸下保護力較佳。
該載體係選自米糠、麩皮、大豆粨、碳酸鈣、滑石粉、麥芽糊精所組成之群組。其中該載體為麥芽糊精，其佔該製劑之重量百分比10%至15%較佳。
於步驟(3)之乾燥載體、該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株混合物的方式可為噴霧乾燥、熱風乾燥或冷凍乾燥；其中，該噴霧乾燥係在溫度範圍100.00℃至270.00℃下進行；該熱風乾燥係在溫度範圍45.00℃至85℃下進行；冷凍乾燥係在-40.00℃下進行。
以下茲介紹二實施例的製備步驟以及其功效：
(實施例一)
製備方法之步驟如下：
(1) 選用為枯草芽孢桿菌MS00903之該第一類菌株、為液化芽孢澱粉桿菌MS06704之該第二類菌株、為枯草芽孢桿菌MS20022之該第三類菌株分別培養於液體培養基中。
(2) 液體培養基包含有重量百分比0.50%糖蜜及重量百分比1.00%酵母抽出物，以37.00℃培養24小時後，添加重量百分比0.02%活性碳粉混合均勻。
(3) 分別培養完成之枯草芽孢桿菌MS00903、液化芽孢澱粉桿菌MS06704及枯草芽孢桿菌MS20022以45℃保溫產孢8小時，混合前述產孢後的枯草芽孢桿菌MS00903、液化芽孢澱粉桿菌MS06704及枯草芽孢桿菌MS20022，添加佔該製劑之重量百分比為10%之載體，該載體為麥芽糊精，混合均勻後以噴霧乾燥(Inlet 100℃，Outlet 73℃，Gas Spray flow650L/hr)即可獲1010CFU/g之動物用益生芽孢桿菌製劑粉末，本動物用益生芽孢桿菌製劑之水活性為Aw 0.6。
請參考圖3，本發明之動物用益生芽孢桿菌製劑(粉末)具有以下特性及功效：可以耐受模擬動物腸道胃酸(pH2.5之鹽酸(HCl))及1.00%蛋白酶(porcine pepsin)處理2小時後不降低菌數；亦可以耐受模擬動物腸道0.3%膽鹽處理6小時後不降低菌數；且可以耐受85℃熱處理30分鐘後不降低菌數；再者可於加水後可於2小時萌芽達80%以上。
請參考圖4，本發明之動物用益生芽孢桿菌製劑(粉末)添加250克/每公噸於白肉雞飼料中，可於雞糞中測得大腸桿菌群(coliform)數目較控制組少2 log CFU/g(雞糞乾種)；並可改善後期肉雞每日增重相較於未添加者多出5.8%；降低雞隻死亡率5.62%。
(實施例二)
製備方法之步驟如下：
(1)選用枯草芽孢桿菌MS07903之該第一類菌株3、液化芽孢澱粉桿菌MS02204之該第二類菌株、枯草芽孢桿菌MS20023之該第三類菌株分別培養於液體培養基中。
(2)液體培養基包含有重量百分比0.5%糖蜜及重量百分比1%大豆蛋白，以37.00℃培養24小時後，添加重量百分比0.05%矽藻土混合均勻。
(3)分別培養完成之枯草芽孢桿菌MS07903、液化芽孢澱粉桿菌MS02204及枯草芽孢桿菌MS20023分別以45℃保溫產孢8小時，混合產孢後的枯草芽孢桿菌MS07903、液化芽孢澱粉桿菌MS02204及枯草芽孢桿菌MS20023，添加佔該製劑之重量百分比為10%之碳酸鈣(載體)及佔該製劑之重量百分比為5%之米糠(麩皮)(載體)，混合均勻後以-40.00℃冷凍乾燥即可獲1011 CFU/g之動物用益生芽孢桿菌製劑粉末，本製劑之水活性為Aw 0.58。
請參考圖5，本發明之動物用益生芽孢桿菌製劑(粉末)具有以下特性及功效：可以耐受模擬動物腸道胃酸(pH 2.0 HCl)處理2小時後菌數下降1.79 log CFU/mL及1%蛋白酶(procine pepsin)處理2小時後不降低菌數；亦可耐受模擬動物腸道0.3%膽鹽處理6小時後不降低菌數；再者，可以耐受85℃熱處理10分鐘後不降低菌數；且可於加水後可於2小時萌芽達80%以上。
此外，請參考圖6，本發明之動物用益生芽孢桿菌製劑(粉末)添加250克/每公噸於白肉雞飼料中，可於雞糞中測得大腸桿菌群(coliform)數目較控制組少1.8 log CFU/g (雞糞乾種)；並可改善後期肉雞每日增重相較於未添加者多出3.31%。
綜上，本發明之動物用益生芽孢桿菌製劑之製造方法，透過將該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株與該載體均勻混合製成該動物用益生芽孢桿菌製劑，該動物用益生芽孢桿菌製劑為提供具多重功能的複合製劑且耐熱性佳。
S1至S3:步驟
圖1為本發明一第一較佳實施例之製備方法流程圖。 圖2表示本發明一第一、二較佳實施例所使用芽孢桿菌的菌株之16S rDNA的分子系統演化樹。圖中，樹枝的分枝附近的數字是引導值(bootstrap)。對照用標準菌株為Bacillus subtilis strain ATCC 21228及Bacillus amyloliquefaciens ML581。 圖3為本發明一第一較佳實施例之動物用益生芽孢桿菌製劑對環境因子之抗性分析圖。 圖4為本發明一第一較佳實施例之動物用益生芽孢桿菌製劑對白肉雞之生長影響之分析圖。 圖5為本發明一第二較佳實施例之動物用益生芽孢桿菌製劑對環境因子之抗性分析圖。 圖6為本發明一第二較佳實施例之動物用益生芽孢桿菌製劑對白肉雞之生長影響之分析圖。
S1至S3:步驟

Claims (8)

  1. 一種動物用益生芽孢桿菌製劑，包括：至少三菌株，該至少三菌株包括至少一第一類菌株、至少一第二類菌株及至少一第三類菌株，各該第一類菌株具高蛋白酶(protease)活性，各該第二類菌株可抑制病原菌，各該第三類菌株具有降解黃麴毒素之活性，各該第一類菌株、各該第二類菌株及各該第三類菌株分別選自一枯草芽孢桿菌或一液化芽孢澱粉桿菌；以及一載體，與該至少三菌株均勻混合；其中，該至少一第一類菌株為枯草芽孢桿菌MS00903、枯草芽孢桿菌MS07903、枯草芽孢桿菌MS10002、枯草芽孢桿菌MS30002、液化芽孢澱粉桿菌MS02204、液化芽孢澱粉桿菌MS06503或液化芽孢澱粉桿菌MS06704；其中，該至少一第二類菌株為枯草芽孢桿菌MS00903、枯草芽孢桿菌MS07903、枯草芽孢桿菌MS50001、枯草芽孢桿菌MS50002、液化芽孢澱粉桿菌MS06503或液化芽孢澱粉桿菌MS06704；其中，該至少一第三類菌株選自枯草芽孢桿菌MS20022或枯草芽孢桿菌MS20023；其中，該至少三菌株之總菌數為每公克至少1x109菌落形成單位(CFU/g)，該載體佔重量百分比為10.00%至15.00%；其中，該載體為麥芽糊精。
  2. 如請求項1所述的動物用益生芽孢桿菌製劑，其中該至少一第二類菌株可抑制下列組成群組中至少一種病原菌，該組成群組包括：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙門氏菌(Salmonella typhimuriunm)、水禽雷氏桿菌(Riemerella anatipestifer)。
  3. 一種動物用益生芽孢桿菌製劑之製備方法，用以製成如請求項1至2所述任一項之動物用益生芽孢桿菌製劑，該製備方法包括步驟：(1)從該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株中各選出單一菌種培養於含有碳源及氮源之液體培養基中，以溫度範圍30.00℃至40℃下培養數小時；(2)添加保護劑至該液體培養基後，再以溫度範圍40.00℃至50.00℃保溫使該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株分別產孢5小時至10小時；(3)混合產孢後的該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株並添加重量百分比為10.00%至15.00%之載體混合均勻乾燥後，即可獲至少為109CFU/g之動物用益生芽孢桿菌製劑；其中，於步驟(3)之乾燥載體、該至少一第一類菌株、該至少一第二類菌株及該至少一第三類菌株混合物的方式可為噴霧乾燥、熱風乾燥或冷凍乾燥；其中，該噴霧乾燥係在溫度範圍100.00℃至270.00℃下進行；該熱風乾燥係在溫度範圍45.00℃至85℃下進行；冷凍乾燥係在-40.00℃下進行；該動物用益生芽孢桿菌製劑為粉末狀；其中，該保護劑的添加量佔重量百分比為0.02%至0.25%；其中，該保護劑為無機材質保護劑，該保護劑種類係選自活性碳、矽藻土、黏土及二氧化矽所組成之群組；其中，於步驟(2)係以溫度範圍45.00℃保溫產孢6小時至8小時。
  4. 如請求項3所述的動物用益生芽孢桿菌製劑之製備方法，其中於步驟(1)係以溫度範圍35.00℃至37.00℃下培養24至48小時。
  5. 如請求項3所述的動物用益生芽孢桿菌製劑之製備方法，其中該液體培養基包含有碳源佔重量百分比為0.50%至2.50%；該碳源種類係選自糖蜜、 蔗糖、葡萄糖、麥芽糖及玉米糖漿所組成之群組；該液體培養基包含有氮源佔重量百分比0.05%至2.50%，該氮源種類係選自大豆分離蛋白、大豆胜肽、酵母抽出物、魚粉及羽毛粉所組成之群組。
  6. 如請求項5所述的動物用益生芽孢桿菌製劑之製備方法，其中該碳源種類為糖蜜佔該液體培養基的重量百分比範圍為0.50%至1.00%。
  7. 如請求項5所述的動物用益生芽孢桿菌製劑之製備方法，其中該氮源種類為大豆胜肽佔該液體培養基的重量百分比範圍為0.10%至0.50%。
  8. 如請求項6所述的動物用益生芽孢桿菌製劑之製備方法，其中該保護劑為活性碳，添加量佔該動物用益生芽孢桿菌製劑之重量百分比為0.02%至0.20%。
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