CN101822321A - 枯草芽孢杆菌ansb060的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及枯草芽孢杆菌ANSB060(保藏编号为CGMCC No.3440)的应用，尤其涉及所述菌株在养殖动物的饮水和/或饲料中的应用。所述枯草芽孢杆菌ANSB060是通过反复分离、纯化、复壮等工艺得到，具有生物活性强、益生性显著并且抗逆性能好等优点。本发明将经过液体深层发酵等生产工艺得到的枯草芽孢杆菌ANSB060的发酵液添加到动物饮水和饲料中，在进入动物肠道后该菌株能迅速活化、繁殖并且能够形成优势的有益菌群，具有减少肠道中的有害菌群、调节肠道微生态平衡、替代抗生素等药物、提高动物增重以及饲料利用率等功效。

Description

枯草芽孢杆菌ANSB060的应用

技术领域

本发明涉及枯草芽孢杆菌ANSB060的应用，尤其涉及该菌株作为养殖动物饲料添加剂的应用。

背景技术

现代集约化畜牧生产限制了动物接触土壤以及其周围的自然环境，这种饲养条件下不利于动物建立胃肠道的正常菌群。当外界环境条件发生变化时，容易导致动物胃肠道微生态菌群失调，从而降低对病原菌的抵抗力。目前主要是通过改善饲养管理和在日粮中添加抗生素的方法来降低这种损失，但是随着抗生素的广泛使用，其导致的耐药性和残留问题日益凸现出来，引起了从科学工作者到普通消费者的高度关注。益生素因其安全性、无残留、有利于生态环境的可持续性发展等优点成为抗生素替代品的首选，而芽孢杆菌更是益生素中使用最为广泛的一种微生态制剂。

前人的研究证实芽孢杆菌具有较好的抗逆性，此类细菌对干燥、高温、高压、氧化等不良的环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的应用潜力。但是不同的芽孢杆菌的抗逆性不同，筛选出一株高抗逆性的芽孢杆菌是一种微生态制剂是否发挥作用的重要前提。

与此同时，沙门氏菌、大肠杆菌以及葡萄球菌是畜牧生产中最为常见的有害菌，对动物的生产性能以及经济效益的影响十分显著。芽孢杆菌对上述菌的生长抑制作用也是衡量其益生效果的重要参数。

只有抗逆性与益生性均较强的芽孢杆菌才能在动物肠道中发挥作用，平衡微生态区系，产生多种酶类、蛋白以及维生素等，提高动物的生产性能，维护动物机体的健康。

目前，关于枯草芽孢杆菌ANSB060的益生性和抗逆性，以及在养殖动物的饮水和饲料中的应用尚未见报道。

发明内容

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ANSB060于2009年11月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.3440。

本发明涉及枯草芽孢杆菌ANSB060在抑制鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌中的应用。所述菌株具有显著的益生性，可显著抑制鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌等致病菌的生长繁殖。

优选地，本发明还涉及枯草芽孢杆菌ANSB060在模拟胃液和/或模拟胆盐和/或高温环境中的应用。所述菌株具有较强的抗逆性，可以耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持较高的芽孢存活率。其中，所述高温是指75-90℃的温度范围；所述芽孢存活率为90％以上。

本发明还涉及枯草芽孢杆菌ANSB060作为养殖动物饲料添加剂的应用。所述应用是将所述菌株的发酵液添加到养殖动物的饮水和/或饲料中。

所述枯草芽孢杆菌ANSB060的发酵液在养殖动物饮水中的添加量为10⁸-10¹⁰CFU/L饮水，优选10¹⁰CFU/L饮水；

所述枯草芽孢杆菌ANSB060的发酵液在养殖动物饲料中的添加量为10⁸-10¹⁰CFU/Kg饲料，优选10⁹CFU/Kg饲料。

其中，优选地，所述养殖动物为反刍动物，诸如牛、羊；

优选地，所述养殖动物为还包括鱼、鸭或鹅；

更优选地，所述养殖动物为肉鸡；

更优选地，所述养殖动物为蛋鸡；

更优选地，所述养殖动物为猪。

本发明枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液的制备方法如下：

取所述枯草芽孢杆菌ANSB060种子液1-5ml，接种到50-100ml培养基中进行摇瓶发酵培养。

其中，所述枯草芽孢杆菌种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培养条件相同，种子液的活菌浓度以10⁹CFU/ml计；

所述摇瓶发酵培养基由如下组分组成：蛋白胨5-10g、葡萄糖5-8g、磷酸氢二钾0.1-0.2g、磷酸二氢钾1.0-2.0g、一水硫酸锰0.5-2.0g、七水硫酸镁0.5-2.0g、蒸馏水800-1200mL，pH值为6.5-7.5；

优选地，所述摇瓶发酵培养基由如下组分组成：蛋白胨10g、葡萄糖5g、磷酸氢二钾0.15g、磷酸二氢钾1.5g、一水硫酸锰1.0g、七水硫酸镁1.5g、蒸馏水1000mL，pH值为7.0；

所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为25-45℃，发酵时间18-36h，pH值6.5-7.5，转速150-225r/min；

优选地，所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为37℃，发酵时间24h，pH值7.0，转速200r/min。

10L发酵罐中试培养基与摇瓶发酵培养基相同。

10L发酵罐中试发酵条件为：装液量为4-7L培养基，接种量为30-100ml摇瓶种子液，发酵温度为25-45℃，发酵时间18-36h，pH值6.5-7.5，搅拌转速200-400r/min。

优选地，所述10L发酵罐中试发酵条件为：装液量为5L培养基，接种量为50ml摇瓶种子液发酵温度为37℃，发酵时间24h，pH值7.0，搅拌转速300r/min。

本发明枯草芽孢杆菌ANSB060益生性的检验方法如下：

采用平板扩散的方法，平板在使用前置于37℃下培养24h，除去部分水分以便于抗菌物质在培养基中扩散。将枯草芽孢杆菌ANSB060用接种棒取少许分别点种到倒好的营养琼脂平板中央，30-45℃培养18-36h，然后将平板倒扣于盛一薄层氯仿的培养皿盖上熏蒸约25-40min，以杀死活细胞并使菌落固定于平板的表面。移去培养皿盖，让平板里的残余氯仿彻底挥发20-40min。在平板表面铺一层刚培养好的指示菌培养液(大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌)，均匀布满后倾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于30-45℃培养18-36h，观察点种的芽孢杆菌周围抗菌圈的大小和清晰程度，判断受试菌对指示菌的抗菌能力。

本发明枯草芽孢杆菌ANSB060抗逆性的检验方法如下：

1、模拟胃液环境的耐受试验：将胃蛋白酶溶解在0.5％-0.85％生理盐水中，使其终浓度为3g/L，用浓盐酸或者10％的NaOH调整pH值到2.0-4.0。对试验前的枯草芽孢杆菌ANSB060活菌菌液进行计数。试验时，取0.5mL活菌菌液加入到4.5mL模拟胃液中(即十倍稀释)，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于30-45℃静置培养2-4h得到培养液，计数残存芽孢的活菌数。

2、模拟胆盐环境的耐受试验：用胰液素制成1g/L-1.5g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为7.0-9.0，配成的胆盐溶液用0.45μm微滤膜过滤除菌。对试验前的枯草芽孢杆菌ANSB060活菌菌液进行计数。试验时，将0.5ml活菌菌液接种到4.5ml模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存芽孢的活菌数。

3、高温环境的耐受试验：取5mL枯草芽孢杆菌ANSB060活菌菌液注入到离心管1中，用无菌生理盐水十倍逐级稀释，选择合适稀释度的稀释液，在营养琼脂培养基平板1上涂布。另取5mL活菌菌液注入到离心管2中，置于75-90℃水浴锅中加热10-20min，取加热后的芽孢杆菌活菌菌液用无菌生理盐水进行十倍逐级稀释，选择与前述相同稀释度的稀释液，在营养琼脂培养基平板2上涂布。将平板1和平板2在30-45℃条件下培养18-36h，计算芽孢杆菌加热前后的数量。

模拟胃液和模拟胆盐耐受试验中的计数方法：

将试验前的活菌菌液或试验得到的培养液用无菌生理盐水十倍梯度稀释，选择合适的稀释度用于计数。采用营养琼脂培养基，取0.5mL稀释液涂布在平板上，30-45℃条件下培养18-36h。

本发明的有益效果在于：

1.本发明的枯草芽孢杆菌ANSB060具有显著的益生性，可显著抑制鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌等致病菌的生长繁殖。

2.本发明的枯草芽孢杆菌ANSB060具有较强的抗逆性，可以耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持较高的芽孢存活率，其芽孢存活率可达到90％以上。由于饲料加工制粒的过程中温度较高，能达到75-90℃，因此菌株需要耐受住这个温度范围才能保证动物吃到的是活菌，活的芽孢杆菌才具有益生性。而耐受胃酸和胆盐是为了使芽孢杆菌在动物消化道内可以发挥其作用。本发明的芽孢杆菌在动物肠道中不仅能抑制有害菌的生长繁殖，还可以产生一些酶、蛋白、维生素等营养物质促进动物生长。

3.本发明的枯草芽孢杆菌ANSB060经过培养和发酵，可作为饲料添加剂添加到养殖动物的饮水或饲料中，为所述菌株开拓了一个新的应用领域。在进入动物肠道后，功能强大的枯草芽孢杆菌迅速活化、增殖并且同时在肠道微生态环境中形成有益优势菌群。

4.只有抗逆性与益生性均较强的芽孢杆菌才能在动物肠道中发挥作用，平衡微生态区系，产生多种酶类、蛋白以及维生素等营养物质，提高动物的生产性能，维护动物机体的健康，本发明的芽孢杆菌能满足上述全部条件。本发明筛选出的芽孢杆菌，可以显著抑制有害菌的生长以及抵抗不利环境，并且通过动物试验验证了其对动物健康、生长的有益作用，而且不存在抗生素类饲料添加剂的耐药性和残留问题。

5.本发明的枯草芽孢杆菌ANSB060具有显著的益生性和抗逆性，不但能减少动物的病害率、减少动物因饮食抗生素类添加剂所致的腹泻率、以及降低死淘率，更重要的是可以增加动物的日采食量、提高饲料转化率、增强动物的生产性能、改善动物体内消化道内环境的稳态，具有促进营养的吸收利用、促进动物生长等功效，从而节约成本、提高经济效益，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌ANSB060对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈；

图2为枯草芽孢杆菌ANSB060对大肠杆菌的抑菌圈；

图3为枯草芽孢杆菌ANSB060对金黄色葡萄球菌的抑菌圈。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液的制备

取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB060 CGMCC No.3440 5ml(活菌浓度为10⁹CFU/ml)，接种于50ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间24h。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾1.0g，一水硫酸锰0.5g，七水硫酸镁1.0g，蒸馏水1000mL；pH值为7.0。

摇瓶发酵结束后进行发酵罐中试试验，取50ml摇瓶发酵种子液接种到10L发酵罐中，装液量为5L，发酵温度为37℃，pH值7.0，搅拌转速300r/min，发酵时间36h。

其中，发酵罐中试培养基组成同摇瓶发酵。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例2枯草芽孢杆菌ANSB060益生性验证

取3个营养琼脂平板，置于37℃下培养24h，除去部分水分以便于抗菌物质在培养基中扩散。用接种棒取少许枯草芽孢杆菌ANSB060，分别点种到倒好的营养琼脂平板中央，37℃培养24h，然后将平板倒扣于盛一薄层氯仿的培养皿盖上熏蒸约30min，以杀死活细胞并使菌落固定于平板的表面。移去培养皿盖，让平板里的残余氯仿彻底挥发20min。分别在3个平板表面各铺一层刚培养好的大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌的培养液，均匀布满后倾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于37℃培养24h。

结果表明，枯草芽孢杆菌ANSB060对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径为1.24cm，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为1.0cm和1.13cm。

实施例3枯草芽孢杆菌ANSB060抗逆性验证

1、模拟胃液环境的耐受试验：将胃蛋白酶溶解在0.5％生理盐水中，使其终浓度为3g/L，用浓盐酸或者10％的NaOH调整pH值到2.0。对试验前的枯草芽孢杆菌ANSB060活菌菌液进行计数。试验时，取0.5mL活菌菌液加入到4.5mL的模拟胃液中，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于37℃静置培养2h得到培养液，计数残存芽孢的活菌数。

结果表明，芽孢存活率达到98.8％。

2、模拟胆盐环境的耐受试验：用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，配成的胆盐溶液用0.45μm微滤膜过滤除菌。对试验前的枯草芽孢杆菌ANSB060活菌菌液进行计数。试验时，将0.5ml活菌菌液接种到4.5ml配好的胆盐溶液中，培养24h后得到培养液，计数残存芽孢的活菌数。

结果表明，芽孢存活率为96％。

3、高温环境的耐受试验：取5mL枯草芽孢杆菌ANSB060活菌菌液注入到离心管1中，用无菌生理盐水十倍逐级稀释，选择合适稀释度的稀释液，在营养琼脂培养基平板1上涂布。另取3份5mL活菌菌液分别注入到离心管2、3、4中，分别置于75℃、80℃和90℃的水浴中加热15min。取加热后的芽孢杆菌活菌菌液用无菌生理盐水进行十倍逐级稀释，选择与前述相同稀释度的稀释液，分别在营养琼脂培养基平板2、3、4上涂布。将4个平板均在37℃条件下培养24h，计算芽孢杆菌加热前后的数量。

结果表明，平均芽孢存活率达到了99％。

实施例4肉鸡生长性能试验

选用120只30日龄健康肉鸡，称重，随机分成4个处理组，每个处理组设5个重复，每个重复6只鸡，公母各占1/2。试验饮水分别为：(1)普通饮水(对照组)；(2)枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液在饮水中的添加量为10⁷CFU/mL饮水；(3)枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液在饮水中的添加量为10⁶CFU/mL饮水；(4)枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液在饮水中的添加量为10⁵CFU/mL饮水。肉鸡自由采食和饮水，饲养管理和免疫程序参照肉鸡饲养管理手册。

表1、枯草芽孢杆菌ANSB060对肉鸡生长性能的影响

注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(p＜0.05)

本试验结果显示，枯草芽孢杆菌ANSB060显著提高了肉鸡平均日增重(p＝0.0123)和饲料转化效率(p＝0.0006)。同时，饮水中枯草芽孢杆菌ANSB060活菌浓度为10⁷CFU/mL时，肉鸡饲料转化率最高。

实施例5蛋鸡生产性能试验

试验为单因子设计，960只罗曼褐商品代蛋鸡随机分为5个处理组，每个处理组设6个重复，每个重复8个笼，每笼4只鸡。处理组1为负对照组，饲喂基础日粮，不含任何药物饲料添加剂；处理组2为正对照组，基础日粮中杆菌肽锌的添加量为20mg/kg饲料，褐硫酸抗敌素的添加量为4mg/kg饲料；处理组3-5为试验组，基础日粮中枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液的添加量分别为10⁸CFU/kg饲料、10⁹CFU/kg饲料和10¹⁰CFU/kg饲料。蛋鸡自由采食和饮水，饲养管理和免疫程序参照蛋鸡饲养管理手册。

表2、枯草芽孢杆菌ANSB060对蛋鸡生产性能的影响

注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(p＜0.05)，ns表示差异不显著

本试验结果显示，枯草芽孢杆菌ANSB060可以显著改善蛋鸡的料蛋比以及提高蛋鸡的产蛋量(p＜0.05)，并且可以降低生产成本，改善蛋鸡的生产性能，提高经济效益，有效替代抗生素添加剂，适合大规模推广使用。

实施例6仔猪生长性能试验

本试验选用35±1日龄、平均体重7.86±0.06kg健康的三元(杜×长×大)杂交断奶仔猪150头，随机分为5个处理组，每个处理组设5个重复，每个重复6头仔猪(公母各半)，各重复组间初始体重无显著性差异(p＞0.05)。

五个处理组分别为：空白对照组(基础日粮)、抗生素对照组(金霉素的添加量为75mg/kg饲料)和试验组(枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液的添加量分别为10⁸CFU/kg饲料、10⁹CFU/kg饲料和10¹⁰CFU/kg饲料)。仔猪自由采食和饮水，饲养管理和免疫程序参照仔猪饲养管理手册。

表3、枯草芽孢杆菌ANSB060对仔猪生长性能的影响

注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(p＜0.05)

本试验结果显示，枯草芽孢杆菌ANSB060可显著提高仔猪的平均日增重(p＜0.05)，改善料肉比，并且显著降低仔猪的腹泻率以及死淘率(p＜0.05)，提高仔猪的生产性能以及经济效益，能有效替代抗生素添加剂，适合大规模推广使用。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB060在抑制鸡白痢沙门氏菌和/或大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌中的应用，其中所述菌株的保藏编号为CGMCC No.3440。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌ANSB060在模拟胃液和/或模拟胆盐和/或75-90℃高温环境中的应用。

3.枯草芽孢杆菌ANSB060作为养殖动物饲料添加剂的应用，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌ANSB060的发酵液添加到养殖动物的饮水和/或饲料中，其中所述菌株的保藏编号为CGMCC No.3440。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌ANSB060的发酵液在养殖动物饮水中的添加量为10⁸-10¹⁰CFU/L饮水。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌ANSB060的发酵液在养殖动物饲料中的添加量为10⁸-10¹⁰CFU/Kg饲料。

6.根据权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于，所述养殖动物包括肉鸡、蛋鸡和猪。

7.根据权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于，所述养殖动物包括鱼、鸭、鹅，以及反刍动物，诸如牛或羊。

8.根据权利要求3-5任一所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌ANSB060的发酵液的制备方法如下：取所述枯草芽孢杆菌ANSB060种子液1-5ml，接种到50-100ml培养基中进行摇瓶发酵培养。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述培养基由如下组分组成：蛋白胨5-10g、葡萄糖5-8g、磷酸氢二钾0.1-0.2g、磷酸二氢钾1.0-2.0g、一水硫酸锰0.5-2.0g、七水硫酸镁0.5-2.0g、蒸馏水800-1200mL，pH值为6.5-7.5；优选地，所述培养基由如下组分组成：蛋白胨10g、葡萄糖5g、磷酸氢二钾0.15g、磷酸二氢钾1.5g、一水硫酸锰1.0g、七水硫酸镁1.5g、蒸馏水1000mL，pH值为7.0；

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为25-45℃，发酵时间18-36h，pH值6.5-7.5，转速150-225r/min；优选地，所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为37℃，发酵时间24h，pH值7.0，转速200r/min。

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