CN109517759A

CN109517759A - 一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN109517759A
Application number: CN201811473790.XA
Authority: CN
Inventors: 王景雪; 陈雅茜
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-03-26

Abstract

本发明属禽畜养殖饲料添加剂技术领域，提供一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂。既可定植于动物肠道，改善宿主肠道内微生物菌群平衡，具有抗菌、防病抗病的作用，又可在动物肠道内产生多种淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶，提高动物饲料利用率。由枯草芽孢杆菌菌泥与吸附剂以质量比为1:9混合，喷雾干燥制成菌粉；所述吸附剂为以吸附剂总重量为计算基准，由可溶性淀粉、菊芋粉、蔗糖、半乳糖按比例混合而成。可提高饲料利用率，对肠道致病菌具有抗菌作用。有较强的耐酸耐胆盐能力，在肠道中稳定定植。为禽畜业提供新的育种技术，为其他难以进行正常有性繁殖的植物种提供可借鉴得育种技术。

Description

一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于禽畜养殖饲料添加剂技术领域，具体涉及一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法，所制备的微生物饲料添加剂既可以定植于动物肠道，改善宿主肠道内微生物菌群平衡，具有抗菌、防病抗病的作用，又可以在动物肠道内产生多种淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶，提高动物饲料利用率。

背景技术

禽畜生产上常常会发生很多疾病，尤其是现在大规模饲养地高密度饲养，为了防止传染病流行，常常会大量使用抗生素和接种疫苗来预防疾病的发生，致使禽畜业抗生素使用严重超标，蛋鸡从雏鸡开始就接种十几种疫苗，如随之带来的是禽畜产品严重的抗生素残留，给我们的食品安全带来严重的隐患。

益生菌（Probiotics）又称活菌制剂，是一类能够定植于人或动物肠道，通过改善宿主肠道内微生物菌群平衡，发挥有利于宿主健康功效的活性微生物的总称。

人们对益生菌的定义经历了一个漫长的历史过程。关于益生菌的研究最早由俄国科学家Metchnikoff(1845一1919年)提出，他认为肠道乳酸菌能够抑制腐败菌的生长，从而增加了机体的寿命。1965年，Lilley和Stillwell将益生素(Probiotics)定义为“由一种微生物分泌，刺激另一种微生物生长的物质”。1974年美国学者Parker认为“益生素是维持肠道内微生物平衡的微生物或物质”。1989年Fuller将益生素的定义修订为“一种活的、可通过改善肠道微生态平衡而对动物产生有利影响的微生物饲料添加剂”。2001年，联合国粮农组织／世界卫生组织(FAO／WHO)将益生菌定义为“摄入量足够时对机体产生有益作用的活性微生物”。

发明内容

本发明为了解决目前禽畜饲料中抗生素的过度使用，导致禽畜产品残留大量抗生素，带来严重的食品安全隐患，提供了一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法。既可以定植于动物肠道，改善宿主肠道内微生物菌群平衡，具有抗菌、防病抗病的作用，又可以在动物肠道内产生多种淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶，提高动物饲料利用率。

本发明由如下技术方案实现的：一种改善禽畜肠道功能的枯草芽孢杆菌饲料添加剂，该饲料添加剂由枯草芽孢杆菌菌泥与吸附剂以质量比为1:9混合，喷雾干燥制成菌粉；所述吸附剂为以吸附剂总重量为计算基准，由70-80%可溶性淀粉、10-15%菊芋粉、1-5%蔗糖、1-5%半乳糖混合而成。

所述饲料添加剂中有效活菌数为1×10⁷cfu/kg。

所述枯草芽孢杆菌的分离方法为：（1）收集菌体：取来自发酵植物的混合菌液1ml,在离心机上3500 r/min离心10 min,收集上清液于另一干净的离心管中，弃去沉淀；将收集的上清液在高速离心机上10000 r/min离心10 min，收集沉淀的菌体，弃去上清液；

（2）收集芽孢：向收集菌体的离心管中加入1 ml无菌水，在漩涡振荡器上混匀，置于80℃恒温水浴锅中热处理15 min，杀死营养细胞和其他细菌细胞，收集芽孢；

（3）芽孢复苏：在超净工作台中取芽孢收集液接种到LB液体培养基中，37 ℃，180 r/min置于恒温摇床富集培养24-36 h，然后取1 ml富集后的菌液用无菌生理盐水作梯度稀释，用移液枪吸取100μl 10^-6浓度菌液均匀涂布在LB固体培养基上，将平板倒置于37 ℃恒温培养箱，培养24 h；

（4）菌种纯化：挑取生长状况良好、不同菌落形态的单菌落平板划线分离培养，重复3-4次，即可得到纯化的菌株。

所述枯草芽孢杆菌菌泥的制备方法为：接种量2%、发酵温度37℃、发酵时间24h-36h、转速180 r/min。基础发酵培养基：葡萄糖1%、玉米粉0.5%、NaCl 1%、MgSO₄0.05%、K₂HPO₄ 0.2%、KH₂PO₄ 0.2%、5mol/L NaOH 98ml、pH 7.0；发酵后的菌液经冷冻离心机8000r/min离心处理后得到菌泥。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

1）与目前常规的饲料添加剂相比，本发明的菌种不仅可以提高饲料利用率，而且对肠道致病菌具有抗菌作用。

2）与目前常规的以益生菌为主饲料添加剂相比，本发明的菌种不仅具有较强的耐酸耐胆盐能力，可以在肠道中稳定定植。而且具有产生多种消化酶和抗菌肽的能力。因此是一个环境友好的菌种，对于减少和替代禽畜业抗生素的使用具有重要的意义。

3)本发明不仅为禽畜业提供了一种可用于饲料添加剂的、可定植于禽畜肠道的、可防病抗病、提高饲料利用率的新菌株，同时该研究方法也适用于其他用途的微生物菌株分离和筛选。

本发明所述枯草芽孢杆菌，该菌株有良好的耐酸耐胆盐性，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、猪霍乱沙门氏菌和乙型副伤寒杆菌均具有良好的抑菌活性；对常见抗生素无耐药性；具有产纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的能力，且均为胞外酶；在果蝇培养基中添加适当剂量的该菌株的复合制剂，可提高果蝇体内抗氧化能力。以该菌株制剂作添加剂饲喂雏鸡35天后，可明显促进雏鸡免疫器官的发育，提高雏鸡的饲料利用率。

该枯草芽孢杆菌具有能产生厚壁、含水量低、抗逆性强的芽孢的特性，使得该菌具有突出的抗极端恶劣条件的能力，如耐酸碱、高温和挤压等。将来自发酵大豆的混合菌液通过水浴80℃加热处理，通过杀死大多营养细胞从而获得芽孢，再通过芽孢复苏的方式获得该枯草芽孢杆菌菌株。

附图说明

图1为菌株N显微镜（1000X）观察照片；

图2为菌株的平板菌落形态图；

图3为基于16S rRNA基因序列比对结果以Marinococcus halophilus DSM 20408（X90835.1）为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树；

图4为枯草芽孢杆菌发酵上清液对常见致病菌抑菌实验结果，图中：a：指示菌为大肠埃希氏菌(E.coli)；b：指示菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；c：指示菌为福氏志贺菌(Sh.flexneri)；d：指示菌为猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae)；e：指示菌为乙型副伤寒杆菌(Bacillus paratyphi B)；f：枯草芽孢杆菌对五种致病菌的抑菌圈直径大小。

具体实施方式

实施例1：该枯草芽孢杆菌的分离、鉴定：

收集菌体：取来自发酵植物的混合菌液1 ml,在离心机上3500 r/min离心10 min,收集上清液于另一干净的离心管中，弃去沉淀；将收集的上清液在高速离心机上10000 r/min离心10 min，收集沉淀的菌体，弃去上清液。

收集芽孢：向收集菌体的离心管中加入1 ml无菌水，在漩涡振荡器上混匀，置于80℃恒温水浴锅中热处理15 min，杀死营养细胞和其他细菌细胞，收集芽孢。

芽孢复苏：在超净工作台中取适量芽孢收集液接种到LB液体培养基中，37 ℃，180r/min置于恒温摇床富集培养24-36 h，然后取1 ml富集后的菌液用无菌生理盐水作梯度稀释，用移液枪吸取100μl 的1×10^-6cfu/ml浓度的菌液均匀涂布在LB固体培养基上，将平板倒置于37 ℃恒温培养箱，培养24 h。

菌种纯化：挑取生长状况良好、不同菌落形态的单菌落平板划线分离培养，重复3-4次，即可得到纯化的菌株并编号。

形态学特征观察：如图1、图2所示，该微生物制剂的菌种属于革兰氏阳性菌，呈直杆菌，芽孢近中生或端生，均为芽孢杆菌，该菌株菌落直径可达到5毫米，菌落形态为表面光滑干燥，菌落边缘整齐，菌落呈不透明状，菌落颜色为乳白色或淡黄色。

该菌种具有较强的耐酸能力，细菌培养物经pH2.0 HCl处理1 h后，细菌存活率高达90%左右，处理2h后，其存活率也在60%以上；该菌种也具有较强的耐胆盐能力，细菌培养物经0.3%胆盐处理1h后，细菌的存活率在接近80%，处理2h后细菌的存活率在55%左右；该菌株对大肠埃希氏菌，金黄色葡萄球菌，福氏志贺菌，猪霍乱沙门氏菌和乙型副伤寒杆菌具有显著抗性。该菌株发酵液上清也对上述致病菌具有良好的抗性。同时该菌株还具有产淀粉酶，纤维素酶和蛋白酶的能力。该菌株对青霉素、利福平、链霉素、卡那霉素和诺氟沙星敏感。

该芽孢杆菌的耐酸性试验：动物胃内的pH值会在2.0~5.8之间浮动，用向LB液体培养基中加入HCl调节pH值至2.0的方法来模拟胃酸环境，然后按0.5%接菌量分别接入上述种子液，培养条件为37 ℃，180 r/min；未加HCl处理的LB液体培养基在同样的条件下培养，作为对照。分别取酸处理1 h、2 h的菌液以及对照组菌液用无菌生理盐水稀释至1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7cfu/ml浓度，每个浓度吸取100 μl菌液均匀涂布于提前已倒好的平板上，每个浓度重复三个平板，37 ℃倒置培养24 h，最后进行平板菌落计数算出平均数，计算存活率。

芽孢杆菌存活率计算公式：K（%）=C₁/C₀×100% ，其中：C₁ ：不同浓度菌液在酸处理不同时间的活菌平均数；C₀ ：未做酸处理的菌液在对应浓度、对应时间的活菌平均数。结论：枯草芽孢杆菌在pH 2.0 HCl处理1 h的存活率高达88%左右，处理2 h的存活率也在60%以上。

芽孢杆菌的耐胆盐试验：胆盐是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐，它是胆汁中参与脂肪消化和吸收的主要成分，具有杀菌作用。在LB液体培养基中加入猪胆盐至浓度为0.3%来模拟动物十二指肠环境，同样按0.5% 接菌量分别接入上述种子液，培养条件为37 ℃，180 r/min；未加猪胆盐的LB液体培养基在同样的条件下培养，作为对照。分别取胆盐处理1 h、2 h的菌液以及对照组菌液用无菌生理盐水稀释至1×10-5、1×10-6、1×10-7cfu/ml浓度，每个浓度吸取100 μl菌液均匀涂布于已备好的平板上，每个浓度重复三个平板，37 ℃倒置培养24 h，最后进行平板菌落计数算出平均数，计算存活率。

芽孢杆菌存活率计算公式：K（%）=D₁/D₀×100% ；其中：D₁ ：不同浓度菌液在胆盐处理不同时间的活菌平均数；D₀ ：未做胆盐处理菌液在对应浓度及时间的活菌平均数。

结论：枯草芽孢杆菌在0.3%胆盐处理1 h的存活率在接近80%，处理2 h的存活率在55%左右。

芽孢杆菌的体外抑菌试验：将筛选出的芽孢杆菌按2%接种量接种于100 ml LB液体培养基内，37 ℃，180 r/min培养24 h，将培养好的菌液离心，8000 r/min，10 min，取上清液浓缩至5 ml，作为待测液。将5种病源指示菌（猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、乙型副伤寒杆菌）分别接种于LB液体培养基中，37 ℃，140 r/min培养12h，调整菌液浓度至1×10⁶ cfu/ml，分别吸取100 μl病源指示菌菌液于LB固体平板上，用已灭菌的涂布棒均匀涂开，再用打孔器（直径9 mm）在平板上打孔，孔内注入100 μl浓缩后的芽孢杆菌发酵上清液，37 ℃培养12 h，观察是否有抑菌圈的出现。按照上述方法将枯草芽孢杆菌发酵上清液对常见致病菌进行抑菌实验，试验结果见图4。由图4中的a、b、c、d、e、图可知，枯草芽孢杆菌对五种常见致病菌均有抑菌作用，由图4.f图可知，枯草芽孢杆菌对福氏志贺菌抑菌作用最强，其次为大肠埃希氏菌、乙型副伤寒杆菌和猪霍乱沙门氏菌，抑菌作用较弱的为金黄色葡萄球菌。

该菌株V3V4区核酸序列为SEQ ID NO:1，16S rRNA基因序列为SEQ ID NO:2。基于16S rRNA基因序列比对结果以Marinococcus halophilus DSM 20408 （X90835.1）为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树如图3，表1为菌株生理生化特性、酶活、碳源同化检测结果；表2为菌株利用碳源产酸检测结果；经检测显示，该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Subsp.Stercoris D7XPN1 CJHCA 01000027）。

表1 菌株N生理生化特性–酶活、碳源同化

+：阳性反应； -：阴性反应; W：弱阳性反应

表2 菌株N生理生化特性—利用碳源产酸

+：阳性反应； -：阴性反应;W:弱阳性反应

实施例2：枯草芽孢杆菌的培养富集：将纯化后的菌株按1:100加入LB液体培养基（每升水中：胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g pH 7.0）中。37℃，180 r/min置于恒温摇床富集培养24-36 h。

实施例3：枯草芽孢杆菌对果蝇体内抗氧化活性检测

1.试验材料：w1118 野生型果蝇；本发明的枯草芽孢杆菌菌株，本实验室保存的短小芽孢杆菌（513-A）和Bacillus gobiensis （513-O）的复合菌液。

2.果蝇基础培养基的配制：A液：称取琼脂粉10g，食用白砂糖70g，加入到500ml蒸馏水中煮沸。B液：称取玉米粉85g，加入到500ml蒸馏水中煮沸。

将B液缓慢倒入A液中，边加热边搅拌，成糊状后稍微冷却加18g酵母粉于混合液中，然后搅拌均匀，再加入5ml丙酸，混合均匀，分装至已灭菌的果蝇培养管（3×10 cm）内，每管中加培养基5 ml，棉塞封口，存放于4 ℃保存备用。

3.含枯草芽孢杆菌的果蝇培养基的配制：在配制好的果蝇基础培养基中加入由本发明的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌（513-A）和Bacillus gobiensis （513-O）的复合菌液，使培养基中含芽孢杆菌量分别为5×10⁶cfu/kg（低剂量组）、1×10⁷cfu/kg（高剂量组），混合均匀后分装至已灭菌的果蝇培养管内，每管中加培养基5 ml，棉塞封口，现配现用。

4.果蝇的繁殖：挑选体型大小相近的野生型果蝇雌雄一组，每瓶果蝇基础培养基中放入6组，进行扩大繁殖，挑选无性状分离的后代进一步扩大培养，以确保试验果蝇无遗传背景差异。果蝇培养于条件为光照12 h/d，温度25 ℃，湿度30%~50%的组培室中。培养一段时间后用乙醚麻醉并收集12 h之内羽化未交配的果蝇，挑取形态大小相似的果蝇分雌雄，各培养5管，每个培养管30只。移入果蝇后先将培养瓶横放，待果蝇苏醒后再将培养瓶正置，防止果蝇被粘在培养基上；在含不同芽孢杆菌剂量的培养基中培养28d，以基础培养基培养的果蝇为对照，培养条件同上。

5.果蝇抗氧化酶活测定：将每个处理组和对照组雌雄果蝇用乙醚深度麻醉后，分别取大小相近的各100只放入离心管并称重，在液氮中快速磨匀，加入预冷的生理盐水制成10%组织匀浆，4℃，4000 r/min 离心10 min，取上清；分别按照试剂盒的操作要求分别测定雌性和雄性果蝇各个处理组和对照组的SOD、CAT活力及MDA含量，并测其蛋白含量。每组设置3个平行试验。

6.芽孢杆菌对雌果蝇体内抗氧化活性的影响：不同添加量枯草芽孢杆菌对雌性果蝇体内SOD、CAT活性和MDA含量的影响，结果见表3。由表3可知，在培养基中添加芽孢杆菌喂养雌性果蝇28d后，实验组SOD和CAT活性与对照组相比均提高，MDA含量降低。方差分析可知：低剂量组雌性果蝇体内抗氧化活性与对照组相比没有显著性差异；高剂量组的SOD、CAT活性与对照组相比分别提高了11.71%（p<0.05）和48.65%（p<0.01），MDA含量降低了29.34%（p<0.05）。

表3 不同剂量混合菌对雌性果蝇体内抗氧化酶活性的影响

注：与对照组相比：*，p<0.05，差异显著；**，p<0.01，差异极显著。括号中的数值为各实验组与对照组相比增加或降低的百分比（%）；“+”代表增加，“-”代表降低。

由表3可知，在培养基中添加不同剂量混合芽孢杆菌喂养雌性果蝇28d后，低剂量组和中剂量组SOD和CAT活性与对照组相比均有所提高，MDA含量均有所降低。方差分析可知：低剂量组雌性果蝇体内抗氧化活性与对照组相比没有显著性差异；中剂量组的SOD、CAT活性与对照组相比分别提高了11.71%（p<0.05）和48.65%（p<0.01），MDA含量降低了29.34%（p<0.05）；高剂量组的SOD、CAT活性与对照组相比均有所下降，分别下降了5.34%（p<0.05）和17.88%（p<0.05），而MDA含量比对照组升高了16.70%（p<0.05）。

7．芽孢杆菌对雄性果蝇体内抗氧化活性的影响

不同添加量的513-A、513-O和513-N混合芽孢杆菌对雄性果蝇体内SOD、CAT活性和MDA含量的影响，结果见表4。

表4 不同剂量混合菌对雄性果蝇体内抗氧化酶活性的影响

由表4可知，在培养基中添加不同剂量混合芽孢杆菌喂养雄性果蝇28d后，低剂量组和中剂量组SOD活性和CAT活性与对照组相比均有所提高，MDA含量均有所降低。方差分析可知：低剂量组雄性果蝇体内抗氧化活性与对照组相比没有显著性差异；中剂量组的SOD、CAT活性比对照组分别提高了9.29%（p<0.05）和46.71%（p<0.01），MDA含量降低了23.91%（p<0.05）。

实施例4：利用所述的改善禽畜肠道功能的枯草芽孢杆菌制备的包含该菌株的微生物饲料添加剂，该饲料添加剂由枯草芽孢杆菌菌泥与吸附剂以质量比为1:9混合，喷雾干燥制成菌粉；所述吸附剂为以吸附剂总重量为计算基准，由70-80%可溶性淀粉、10-15%菊芋粉、1-5%蔗糖、1-5%半乳糖混合而成。所述饲料添加剂中有效活菌数为1×10⁷cfu/kg。

枯草芽孢杆菌的发酵条件为：接种量2%、发酵温度37℃、发酵时间24h-36h、转速180 r/min。基础发酵培养基：葡萄糖1%、玉米粉0.5%、NaCl 1%、MgSO₄0.05%、K₂HPO₄ 0.2%、KH₂PO₄ 0.2%、5mol/L NaOH 98ml、pH 7.0。发酵后的菌液经冷冻离心机（转速8000r/min）离心处理后得到菌泥。

实施例5：枯草芽孢杆菌对蛋鸡生长性能的影响实验材料为1周龄海兰褐蛋鸡。选取300只健康海兰褐雏鸡随机分成5组,每组3个重复,每个重复20只。采用笼养方式，自由采食和饮水。对照组：按照鸡场正常饲料饲喂；实验组：在正常饲料中分别添加0.02%、0.06%、0.1%、0.3%芽孢杆菌。

实验结果：

1.芽孢杆菌对8-42日龄蛋鸡生长性能的影响：将按上述剂量饲喂的雏鸡35天后，称重，每个处理宰杀3只，做生理生化指标测定。结果见表5。

表5：芽孢杆菌饲喂雏鸡35天后对雏鸡生产性能的影响

由表5 可知，雏鸡饲喂芽孢杆菌后，料重比有一定程度的下降，说明芽孢杆菌具有提高饲料消化率的作用。

2.芽孢杆菌对8-42日龄蛋鸡免疫器官增重的影响

在蛋鸡42日龄时，每组取3只解剖，取出脾脏、法氏囊、胸腺等免疫器官，进行称重，计算芽孢杆菌对各处理组42日龄蛋鸡免疫器官增重量，结果见表6. 由表6可知，与对照组相比，添加芽孢杆菌的实验组都在不同程度上增加了免疫器官的发育，尤其是添加0.3%的实验组，免疫器官全部优于对照组。说明该芽孢杆菌可以明显增强免疫器官的发育，有助于畜禽免疫力的提高。

表6. 芽孢杆菌对42日龄蛋鸡免疫器官增重的影响（g/kg）

3.芽孢杆菌对42日龄蛋鸡血清生化指标的影响

在蛋鸡42日龄时，每组取3只采血，三次重复，对血清中生化指标平均值、法氏囊T-SOD酶平均酶活性进行了测定，结果见表7、表8。

由表7结果可知，当添加量为添加0.1%，添加0.3%时，该芽孢杆菌可以明显提高血清中球蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白、总蛋白含量等，有助于增强畜禽免疫力。

由表8结果可知，该芽孢杆菌可以明显提高法氏囊T-SOD酶酶活，增加细胞对超氧阴离子自由基的清除能力，提高机体防御生物体氧化损伤的能力，从而增强机体的免疫力。

表7. 芽孢杆菌对42日龄蛋鸡血清生化指标平均值的影响

表8. 芽孢杆菌对42日龄蛋鸡对法氏囊T-SOD平均酶活（U/mgprot）的影响

序列表

<110> 山西大学

<120> 一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1411

<212> DNA

<213> V3V4区(Artificial Sequence)

<400> 1

ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc 60

ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga 120

ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga 180

ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac gtgtgtagcc 240

caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300

cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg 360

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ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct 600

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gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg c 1411

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<211> 1432

<212> DNA

<213> 16S rDNA(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtgctatac atgcagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga 60

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Claims

1.一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于：该制剂由枯草芽孢杆菌菌泥与吸附剂以质量比为1:9混合，喷雾干燥制成菌粉；所述吸附剂为以吸附剂总重量为计算基准，由70-80%可溶性淀粉、10-15%菊芋粉、1-5%蔗糖、1-5%半乳糖混合而成。

2.根据权利要求1所述的一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于：所述饲料添加剂中有效活菌数为1×10⁷cfu/kg。

3.根据权利要求1或2所述的一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的分离方法为：

（1）收集菌体：取来自发酵植物的混合菌液1 ml,在离心机上3500 r/min离心10 min,收集上清液于另一干净的离心管中，弃去沉淀；将收集的上清液在高速离心机上10000 r/min离心10 min，收集沉淀的菌体，弃去上清液；

4.根据权利要求1所述的一种适于肠道定植、提高消化率和免疫力的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌菌泥的制备方法为：接种量2%、发酵温度37℃、发酵时间24h-36h、转速180 r/min；基础发酵培养基：葡萄糖1%、玉米粉0.5%、NaCl 1%、MgSO₄0.05%、K₂HPO₄ 0.2%、KH₂PO₄ 0.2%、5mol/L NaOH 98ml、pH 7.0；发酵后的菌液经冷冻离心机8000r/min离心处理后得到菌泥。