CN110373367B - 一种具有农药降解活性的植物乳杆菌、其制备方法及应用 - Google Patents

一种具有农药降解活性的植物乳杆菌、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有农药降解活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P9，其保藏号为CGMCC No16401。植物乳杆P9能降解有机磷农药氧化乐果、甲拌磷和乐果，且具备良好的霉菌抑制性、特别对甜瓜疫霉菌表现出明显的抑菌效果。因此，它可作为蔬果清洁剂或农用生物制剂而具备降解有机磷农药、清除有机磷农药残留和抑制霉菌活性的效果。其具有耐酸性、耐胆汁酸性、耐过氧化氢酶和蛋白酶的稳定性使得它能存活于包括人在内的动物的胃肠器官内，因此可作为食品或食品添加剂，是具有益生菌活性的益生菌。

Description

一种具有农药降解活性的植物乳杆菌、其制备方法及应用
本发明请求申请日为2018-11-09、申请号为CN 2018113296312、发明名称为一种具有农药降解活性的植物乳杆菌、其制备方法及应用的中国发明专利申请为优先权。
【技术领域】
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种具有农药降解活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，还涉及这株具有农药降解活性的植物乳杆菌的制备方法，以及所述植物乳杆菌的应用。
【背景技术】
现代农业中，化学农药是农田防治病虫害的最佳选择，因其效果好、作用快、不易失活、易保存和价格低等优点而广受人们的青睐。化学农药主要是一类有机或无机的化学试剂，包括除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀菌剂、植物生长调节剂和土壤熏蒸剂等。2013年，我国年农药用量中有效成分超过31.10万吨，其中70％以上是有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类和除虫菊酯类农药。然而，实际应用过程中只有5％的农药起到作用，其余部分则进入环境中。
近年来，农药污染及农药中毒事件已经成为严重危害人体健康的公共安全问题。食品及其原材料中农药残留检测结果依旧出现很多农残超标案例。2014年，罗赟等对绵阳市城区及其周边六个县的300 份蔬菜、水果和粮食样品进行抽查发现，有机磷农药未检出的合格率仅为74.44％。2015年，Chen等发现810份茶叶样品中有机磷农药的检出率为29％，平均含量达93μg/kg。我国己禁止高毒有机磷农药的生产销售，但农作物和相关食品中农药检出率依然很高。有机磷农药的长期超量使用，致使农作物中的残留量严重超标，成为引起食品安全事件的重要隐患。
长期食用有机磷农药超标食物，逐渐积累造成无明显表象症状的慢性中毒，从而引起的毒副作用不容忽视。有机磷农药进入机体后，其磷酸根与体内乙酰胆碱酯酶活性中心的丝氨酸结合形成磷酸化的胆碱酯酶，使乙酰胆碱酯酶失活，导致乙酰胆碱在体内蓄积。同时，有机磷农药引起细胞损伤和氧化应激，产生过氧离子或自由基(O2-、 HO2·和·OH等)并进入线粒体，从而造成机体代谢和能量转换的紊乱。研究表明，甲拌磷、乐果和乙酰甲胺磷等有机磷农药中毒可造成遗传毒性，影响甲状腺、肝和肾功能，损伤生殖、内分泌和免疫系统。目前，针对有机磷农药慢性中毒，仍没有理想的医疗方案，因此，通过饮食预防和缓解农药慢性中毒症状，已成为食品安全防控领域的研究热点。
微生物可通过矿化作用、酶促、非酶促或共代谢等方式将农药及其有毒、有害副产物转化为二氧化碳、水等无害物质。乳酸菌(Lactic Acid Bacteria,LAB)作为安全的食品级微生物，已被人类食用上千年，而且乳酸菌的免疫调节、抗肿瘤、降血脂等诸多功能已被公认。使用植物乳杆菌(L.plantarum)来降解有机磷农药的污染，已经在体内和体外得到证明。本发明中的植物乳杆菌主要来至于传统发酵乳制品，其安全性是有保证的。
【发明内容】
本发明的目的是基于自然选择的方法提供一株具有农药降解活性的植物乳杆菌。
进一步地，本发明还提供这株植物乳杆菌农药降解活性的评价方法，及其在作为食品或食品添加剂的使用。
为了实现上述目的，本发明提供一种具有农药降解活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P9，该菌株已于2018年8月30日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No16401。
进一步地，本发明还提供具有农药降解活性的植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)P9的选育方法，所述选育方法包括下述步骤：
A、菌株活化培养
取酸粥样品，进行灭菌管分装和液氮冷冻后24h内运输到实验室进行检测，将所述酸粥样品按照10-4、10-5、10-6梯度稀释后涂布于含有0.1wt％放线菌酮和0.1wt％硫酸粘菌素的MRS培养基平板或者 M17培养基平板上，30℃厌氧培养48h～72h，然后挑取单菌落转接于TPY增菌培养液中，30℃培养24h～48h，再划线接种于MRS琼脂培养基中，30℃培养24h～48h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验；挑选革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株作为待试菌株，分别接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h～48h后，做进一步鉴定；
B、分子生物学鉴定
取步骤A的待试菌株分别接种于TPY增菌液体培养基中，30℃恒温培养24h，传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内，4℃下8000×g离心3min收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA；
以菌体DNA为扩增模板，采用通用引物PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定，待试菌株鉴定为植物乳杆菌(L.plantarum)；
所述通用引物包括：
正向引物27f(对应于Escherichia coil 8-27位碱基)：
5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物1495r(对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基)：
5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′；
C、气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定植物乳杆菌对氧化乐果、甲拌磷和乐果的降解率
(1)待试菌株接种到MRS培养基中活化，连续转接三次，每次 37℃培养24h培养，活化三代的待试菌株以接种量1×107cfu/mL接种到含0.5mg/kg氧化乐果、0.5mg/kg甲拌磷和0.5mg/kg乐果的MRS 培养基中，37℃培养24h，取发酵液以4000×g离心10min，上清液经0.22μm微膜过滤得到滤液，-20℃冰箱保存备用；
(2)取20g步骤(1)的待试菌株发酵后0.22μm微膜过滤的 MRS发酵液，置于50mL离心管中，加入15mL的丙酮-乙腈(1：4， v/v)混合液，轻轻摇动均匀，静置20min；然后摇动30s后3600rpm 离心5min，然后上层液体转移到分液漏斗中；向上述分液漏斗中添加25mL的二氯甲烷，震荡10min充分混匀，静置10min；将分液漏斗中的下层液体放出到烧杯中，添加1g无水Na2SO4干燥20min；干燥后的提取液经滤纸过滤后定容至50mL；取上述定容后的提取液过0.22μm的滤膜上气相-质谱联用仪分别测定氧化乐果、甲拌磷和乐果浓度；
气质联用仪条件：Agilent 7890气质联用仪，载气氮气的速率为 3mL/min，进样方式为：自动进样，不分流进样，隔垫扫吹为3mL/min。进样量8μL，升温速率：100℃保持1min；以30℃/min速率升至 195℃，195℃保持8min；然后以1℃/min升至202℃，202℃保持1min；以1℃/min升至205℃；再以15℃/min升至240℃；再以8℃/min升至280℃，280℃保持10min；再以20℃/min升至300℃，300℃保持 10min。质谱条件：电子能量70eV；离子源温度：230℃；质量扫描范围m/z＝40-400；
计算农药降解率，农药降解率计算公式：
降解率(％)＝(C0-C1)/C0×100％
C0——MRS空白组农药浓度；C1——MRS乳酸菌发酵后的残留浓度；
(3)挑选对三种有机磷农药都具有较好降解效果的待试菌株作进一步测试；
D、待试菌株的胃肠液耐受性
模拟胃液准备方法：将PBS灭菌后，用1mol/L HCL调节pH 值至2.5，加入3.0g/L胃蛋白酶，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液；
模拟肠液准备方法：将PBS灭菌后，用0.1mol/LNaOH调节pH 值至8.0，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟胰液
模拟胃肠液耐受性测定：将步骤C得到的待试菌株活化培养两代，连续离心洗菌两次，收集菌体，取0.5ml菌液加入到4.5ml pH 2.5 模拟人工胃液中，37℃消化3h，同时分别于0h和3h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数；
模拟肠液消化：取0.5ml已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5ml 的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数，每个样品做3个平行；
菌株存活率计算公式：
菌株存活率(％)N1/N0×100％
N1——菌株处理后活菌数；
N0——菌株初始活菌数；
E、待试菌株的胆盐耐受性
将步骤C得到的待试菌株按照1％(v/v)接种量接入含牛胆汁 MRS培养基中(0.3％Oxgall+0.2％巯基乙酸钠)，以不加牛胆汁的MRS培养基作为对照；将含菌株的培养基置于37℃水浴培养，每小时取样于620nm测定其OD值，至添加胆盐和不加胆盐MRS培养基的吸光值增加0.3个单位为止；试验菌株耐受胆盐的能力以延滞期的长短为评价标准，其中试验组与空白组菌株吸光值增加0.3个单位所需时间的差值即为延滞期(LT,lag time)；每个菌株每次测定均做三个平行试验；
苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸钾。
E打孔法测定植物乳杆菌L.plantarum P9对甜瓜疫霉的抑制活性
将在PDA培养基上活化好的甜瓜疫霉菌分别用PBS缓冲液洗下来制成105cfu/mL的孢子菌悬液，把菌悬液按1％(v/v)接入PDA 培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板；
在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于 4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小；
疫霉属真菌对农作物、果树、林木、观赏植物、草本植物和灌木都有相当大的危害,可侵染这些植物的根、根颈、叶、花、果实,引起根腐、根颈腐、果腐、溃疡、萎蔫和斑点等症状,给农业生产带来严重的损失。目前对植物卵菌病害依靠化学防治，常用杀菌剂如瑞毒霉、杀毒矾、甲霜灵等药物。这些药剂价格昂贵，长期大量施用对人和环境造成极大危害。因此开发环保、高效的生物农药具有重要意义。本发明的植物乳杆菌L.plantarum P9能够抑制甜瓜疫霉菌活性，为开发生物农药提供了可能。
选择一株胃肠液耐受性高、胆盐耐受性高、对氧化乐果和乐果的降解率>9％、对甲拌磷降解率>28％且对甜瓜疫霉菌表现出抗菌活性的菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P9。
本发明还提供植物乳杆菌P9在食品或食品添加剂中的应用。
其中，所述食品例如发酵食品或菌剂。
本发明还提供植物乳杆菌P9及其发酵液在抑制甜瓜疫霉菌活性中的应用。
利用琼脂扩散法测定，本发明的植物乳杆菌P9对甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小为38.52±1.46mm，在对照测试的347株植物乳杆菌的抑霉菌数据属于较高水品，高于其中125株的抑菌性能，表明该菌株及其发酵上清液在对甜瓜疫霉菌具备抑制性，因而具备生物农药制剂的开发前景。
本发明还提供植物乳杆菌P9在农药去除剂或果蔬清洗剂中的应用。
经试验证实，本发明的植物乳杆菌P9降解有机磷农药、清除有机磷农药残留，具有肠道保护作用。植物乳杆菌P9具有耐酸性、耐胆汁酸性、耐过氧化氢酶和蛋白酶的稳定性，能存活于包括人在内的动物的胃肠器官内，是具有益生菌活性的益生菌，当以干燥的细胞形态或发酵产物形态用于人或动物的情况下，能够对宿主的肠道菌群产生有利的影响。
本发明提供含有本发明植物乳杆菌的用于预防和治疗肠道疾病的组合物及其用途，能够用于预防或治疗包括人在内的哺乳动物的肠道疾病，优选为包括牛、马、猪等家畜。肠道农药毒害、以及由有机磷农药引起的肠道疾病等都包括在上述“肠道疾病”中，例如，包括由有机磷农药(氧化乐果、甲拌磷和乐果等)引起的炎症肠道疾病、肠道通透性增加和血液内毒素增多等，但是并不限于这些。
植物乳杆菌L.plantarum P9在肠道中能够以活菌体或死菌体方式存在，但是优选为以活菌体方式存在。一般活菌体具有治疗并改善由肠道菌群的异常发酵而引起的诸多症状的效果，用于人以及动物时，能够密集、停留在肠内的消化管道壁上，从而起到使有害菌不能够停留的作用，并且产生乳酸来降低肠内的pH值，抑制有害细菌的繁殖。并通过调节肠道内稳态，减低由于外源性有害物质引起的肠道炎症因子和肠道通透性的增加。并且，所用的活菌体生成细菌素和过氧化物，从而能够抑制病原菌的繁殖，对负责吸收营养成分的肠绒毛的活动起到帮助作用。此外，能够生成帮助吸收、利用营养素的物质，对于动物来说改善其饲料转化率，还能够产生一种能够中和病原菌产生的毒性物质的物质。
对于上述本发明的用于预防或治疗肠道疾病的组合物的给药方式没有特别限定，但是优选为经口给药。虽然给药量根据肠道疾病的种类、疾病程度、年龄、性别、人种、治疗或预防目的等有所不同，但是一般情况下以成人为基础。
制备成上述各个剂型时，可以加入各个剂型的制备所需的并在药剂学可接受的载体或添加剂来制备。制备成具有典型的用于经口给药的剂型时，上述载体可以使用选自稀释剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂以及防腐剂中的一种或多种，作为添加剂可以使用选自香料、维生素类以及抗氧化剂。
上述载体以及添加剂只要是药剂学上允许使用的均可，优选地，作为稀释剂具体有乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露醇等，作为润滑剂有硬脂酸镁或滑石粉，作为粘合剂有聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素。此外，优选地，作为崩解剂有羧甲基纤维素钙、羧基乙酸淀粉钠、波拉克林钾或交联聚维酮，作为甜味剂有白糖、果糖、山梨醇或阿斯巴甜，作为稳定剂有羧甲基纤维素钠、环糊精、白蜡或黄原胶，作为防腐剂有对羟基
因此，本发明提供植物乳杆菌L.plantarum P9在开发生物农药中的应用。本发明提供植物乳杆菌L.plantarum P9和包含植物乳杆菌L. plantarum P9的组合物可用于阻止或消除甜瓜疫霉菌引起的植物疾病或危害。
本发明含有植物乳杆菌L.plantarum P9农药组合物可根据施用加工成各种剂型，如粉剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、乳剂、乳油、浓乳剂、乳膏、糊剂、胶体剂、熏烟剂、熏蒸剂、烟雾剂、油剂、颗粒剂、微粒剂等。
通过以上方法验证了植物乳杆菌L.plantarum P9具有较强甜瓜疫霉的植物乳杆菌菌株。
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P9于2018年8 月30日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.16401。
【附图说明】
图1为植物乳杆菌P9的系统发育树状图；
图2为植物乳杆菌P9对氧化乐果、甲拌磷和乐果的降解率；
图3为植物乳杆菌P9的胃肠液耐受性和胆盐耐受性；
图4为植物乳杆菌P9的菌落形态。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
在本发明中如无特殊说明，表示浓度的“％”均为重量百分比，“：”均为重量比，“份”均为重量份。
本发明涉及以下培养基：
大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tweeen 80 1ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02 g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、 15min灭菌。
M17培养基的组成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨 5g、酵母粉2.5g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、二钠甘油19g、琼脂11g、蒸馏水1L。
TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温800.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、15g琼脂、蒸馏水1L，121℃、15min灭菌。
本发明所涉及的待测菌株121株由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室分离、鉴定并保存，它们分别分离自中国 内蒙古、中国 新疆、中国 西藏、中国 四川以及蒙古国地区的传统发酵食品中，121株植物乳杆菌的16S核糖体RNA信息都已上传到NCBI数据库，菌株面向所有的研究者开放。
实施例1：菌株的活化与鉴定
取待试菌株，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验；挑选革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株作为待试菌株，分别接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h～ 48h后，做进一步鉴定。
将待试菌株分别接种于TPY增菌液体培养基中，30℃恒温培养 24h，传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内，4℃下8000×g离心3min收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA；
以菌体DNA为扩增模板，采用通用引物PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定，待试菌株鉴定为植物乳杆菌(L.plantarum)；
所述通用引物包括：
正向引物27f(对应于Escherichia coil 8-27位碱基)：
5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物1495r(对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基)：
5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。
实施例2待试菌株在MRS中发酵降解氧化乐果、甲拌磷和乐果活性测定
(1)待试菌株接种到MRS培养基中活化，连续转接三次，每次 37℃培养24h培养，活化三代的待试菌株以接种量1×107cfu/mL接种到含0.5mg/kg氧化乐果、0.5mg/kg甲拌磷和0.5mg/kg乐果的MRS 培养基中，37℃培养24h，取发酵液以4000×g离心10min，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用；
(2)取20g步骤(1)的待试菌株发酵后的MRS培养基置于50 mL离心管中，加入15mL的丙酮-乙腈(1：4，v/v)混合液，轻轻摇动均匀，静置20min；然后摇动30s后3600rpm离心5min，然后上层液体转移到分液漏斗中；向上述分液漏斗中添加25mL的二氯甲烷，震荡10min充分混匀，静置10min；将分液漏斗中的下层液体放出到烧杯中，添加1g无水Na2SO4干燥20min；干燥后的提取液经滤纸过滤后定容至50mL；取上述定容后的提取液过0.22μm的滤膜上气相-质谱联用仪分别测定氧化乐果、甲拌磷和乐果浓度。
气质联用仪条件：Agilent 7890气质联用仪，载气氮气的速率为 3mL/min，进样方式为：自动进样，不分流进样，隔垫扫吹为3mL/min。进样量8μL，升温速率：100℃保持1min；以30℃/min速率升至 195℃，195℃保持8min；然后以1℃/min升至202℃，202℃保持1min；以1℃/min升至205℃；再以15℃/min升至240℃；再以8℃/min升至280℃，280℃保持10min；再以20℃/min升至300℃，300℃保持 10min。质谱条件：电子能量70eV；离子源温度：230℃；质量扫描范围m/z＝40-400。
计算农药降解率，农药降解率计算公式：
降解率(％)＝(C0-C1)/C0×100％
C0——MRS空白组农药浓度；C1——MRS乳酸菌发酵后的残留浓度。
121株植物乳杆菌的抑菌情况统计如表1，所有菌株对甲拌磷均表现出降解活性，而对氧化乐果和乐果展现出降解效果的菌株分别有 86.37％和86.99％。
其中，P9中对氧化乐果、甲拌磷和乐果的降解率分别为 11.37±1.42％、35.52±0.50％和14.00±2.97％，表现出最强的降解率(见图1)。
表1 121株植物乳杆菌对三种农药降解情况汇总
Figure BDA0002182151240000121
注：植物乳杆菌对氧化乐果和乐果降解率‘高’、‘低’和‘不抑制’分别表示降解率大小为>9％,0-9％和0；而菌株对甲拌磷降解率的‘高’、‘低’和‘不抑制’分别表示甲拌磷降解率大小为>28％, 0-28％和0。
实施例3P9的胃肠液耐受性
模拟胃液准备方法：将PBS灭菌后，用1mol/L HCL调节pH 值至2.5，加入3.0g/L胃蛋白酶，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液；
模拟肠液准备方法：将PBS灭菌后，用0.1mol/LNaOH调节pH 值至8.0，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟胰液
模拟胃肠液耐受性测定：将步骤C得到的待试菌株活化培养两代，连续离心洗菌两次，收集菌体，取0.5ml菌液加入到4.5ml pH 2.5 模拟人工胃液中，37℃消化3h，同时分别于0h和3h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数；
模拟肠液消化：取0.5ml已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5ml 的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数，每个样品做3个平行；
菌株存活率计算公式：
菌株存活率(％)N1/N0×100％
N1——菌株处理后活菌数；
N0——菌株初始活菌数；
E、待试菌株的胆盐耐受性
将P9中按照1％(v/v)接种量接入含牛胆汁MRS培养基中(0.3％ Oxgall+0.2％巯基乙酸钠)，以不加牛胆汁的MRS培养基作为对照；将含有菌株的培养基置于37℃水浴培养，每小时取样于620nm测定其OD值，至添加胆盐和不加胆盐MRS培养基的吸光值增加0.3个单位为止；P9中耐受胆盐的能力以延滞期的长短为评价标准，其中试验组与空白组菌株吸光值增加0.3个单位所需时间的差值即为延滞期(LT,lagtime)。
植物乳杆菌P9对胃肠液中的存活率见表2。
表2 植物乳杆菌P9的胃肠液耐受性和胆盐耐受性 (n＝3)
Figure BDA0002182151240000131
1数据均表示为平均值±标准偏差的形式。
在模拟胃液(pH 2.5)条件下存活3h后的活菌数呈现下降的趋势，在3h时的存活率为62.74±0.82％，对模拟胃液有一定的耐受性且耐受性优于益生菌植物乳杆菌P-8。P9菌株从pH 2.5人工胃液中 37℃保持3h后，转入pH 8.0的人工肠液中保持8h，其结果如图2 所示。
从图中看出在pH 8.0的人工肠液中该菌株活菌数变化不大，4h 时的存活率为93.16±7.85％，保持至8h时该菌株存活率为 89.08±4.94％，且差异不显著(P>0.05)。
证明植物乳杆菌P9有较好的胃肠液耐受性，且胆盐延迟时间较益生菌植物乳杆菌P-8长。整体看来，植物乳杆菌P9具有优良的益生特性。
实施例4：植物乳杆菌L.plantarum P9的MRS发酵上清液的抗甜瓜疫霉菌的活性测定
将在PDA培养基上活化好的甜瓜疫霉菌用PBS缓冲液分别洗下来制成105cfu/mL的孢子菌悬液，把菌悬液按1％(V/V)的量接入 PDA培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。
在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL植物乳杆菌P9的MRS发酵上清液，于 4℃冰箱中扩散12h后28℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小，用游标卡尺测量菌株的抑菌圈大小。
利用琼脂扩散法检测到植物乳杆菌L.plantarum P9对甜瓜疫霉菌的抑菌圈，直径为38.52±1.46mm，在对照测试的另外347株植物乳杆菌的抑霉菌数据中表现良好，高于其中125株菌对甜瓜疫霉的抑菌性能，表明菌株P9及其发酵上清液在抑制甜瓜疫霉菌的生长的方面具有积极作用。
综上所述，植物乳杆菌L.plantarum P9能降解三种有机磷农药 (氧化乐果、甲拌磷和乐果)，且具备良好的霉菌抑制性、特别对甜瓜疫霉菌表现出明显的抑菌效果；且在模拟胃肠液中有较高的存活率；且具备胆盐耐受性。因此，它可蔬果清洁剂或农用生物制剂而具备降解有机磷农药、清除有机磷农药残留和抑制霉菌活性的效果。其具有耐酸性、耐胆汁酸性、耐过氧化氢酶和蛋白酶的稳定性使得它能存活于包括人在内的动物的胃肠器官内，因此可作为食品或食品添加剂，是具有益生菌活性的益生菌。

Claims (6)

1.一株具有农药降解活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P9，该菌株已于2018年8月30日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.16401。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌P9，其特征在于所述农药包括氧化乐果、甲拌磷和乐果。
3.权利要求1或2所述的具有农药降解活性的植物乳杆菌P9在食品或食品添加剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述食品是发酵食品或菌剂。
5.权利要求1或2所述的具有农药降解活性的植物乳杆菌P9在抗甜瓜疫霉菌中的应用。
6.权利要求1所述的具有农药降解活性的植物乳杆菌P9在农药去除剂或果蔬清洗剂中的应用，所述农药是氧化乐果、甲拌磷或乐果。
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