CN110373343B - 一株可快速高效降解亚硝酸盐、抑菌的植物乳杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株可快速高效降解亚硝酸盐、抑菌的植物乳杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CGMCC16937。具有快速、高效降解亚硝酸盐的优势。

Description

一株可快速高效降解亚硝酸盐、抑菌的植物乳杆菌
技术领域
本发明属于微生物生物工程技术领域，具体涉及一株可快速高效降解亚硝酸盐、抑菌的植物乳杆菌。
背景技术
亚硝酸钠(NaNO2)属于一种无机盐，其易溶于水而不易溶于有机溶剂。亚硝酸钠有淡淡的咸味，经常被不法商人用来制作假盐。亚硝酸钠是浅黄色固体粉末，易吸水受潮，使用前需干燥。但是亚硝酸钠是有毒物质，我们人类一次性摄入0.4g左右就会中毒身亡。由于亚硝酸钠会转化成亚硝铵，后者对于人类来说属于致癌类物质。但是在工业方面，亚硝酸盐就比较受欢迎了，其可以作为防腐剂，漂白粉等，所以其属于工业用盐。
在我们市场以及居民在酸菜的腌制过程中会产生一部分亚硝酸盐，但是一周以后亚硝酸盐的含量会显著降低，这可能与酸菜中生活的微生物乳酸菌有关，这为我们寻找降解亚硝酸盐的微生乳酸菌物提供了一种来源。
同时乳酸菌降解亚硝酸盐的能力逐渐受到人们的关注，如何高效的筛选可以降解亚硝酸盐的乳酸菌也十分必要。目前采用的方法如下：原子吸收光谱法虽然可以方便快速的检测亚硝酸盐的含量，但是使用的仪器设备比较昂贵，其复杂性也限制了不能现场检测。色谱法也涉及到大型、复杂的仪器使用，消耗成本较高，不利于大批量样品的筛选，容易造成误差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一株可快速高效降解亚硝酸盐、抑菌的植物乳杆菌。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一株可快速高效降解亚硝酸盐、抑菌的植物乳杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101；其保藏编号为CGMCC No.16937，分类命名是：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
本发明还公开了上述植物乳杆菌在降解亚硝酸盐中的用途。
本发明还公开了植物乳杆菌的高通量筛选方法，该筛选方法如下：步骤一、将从浆水菜中分离纯化的80株不同种类的乳酸菌在多孔板中进行扩大培养，离心得乳酸菌上清；
步骤二、将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌三种病原菌分别以10％的接种量接种到LB培养基中进行扩大培养，获得三种病原菌的菌液；分别取20ul三种菌液，对应分别加入含有170ul新鲜LB培养基的三个多孔板中待用；
步骤三、在步骤二中的所述三个多孔板中分别加入10ul步骤一种所述的乳酸菌上清进行培养，然后检测菌液吸光值OD600；将测得的吸光值分别与空白值相比对，得对应的抑菌率；得出抑菌率最高的植物乳酸菌，即完成了植物乳杆菌的高通量筛选。
本发明中的植物乳杆菌能够快速高效降解亚硝酸盐，且具有抑菌的作用。该植物乳杆菌具有快速、高效降解亚硝酸盐的优势，且适用于高浓度的亚硝酸盐的环境。
附图说明
图1为测定亚硝酸盐浓度的标准曲线；
图2为该菌株在含有不同亚硝酸盐浓度的培养基培养24h后的亚硝酸盐残余量；
图3为该菌株在对不同浓度亚硝酸盐的去除率。
具体实施方式
本发明一株可快速高效降解亚硝酸盐、抑菌的植物乳杆菌，保藏于中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC No.16937，分类命名为植物乳杆菌。中国科学院微生物研究所于2018年12月13日收到该乳杆菌，并登记入册。保存地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还公开了上述的植物乳杆菌在降解亚硝酸盐中的用途。
本发明还公开了上述的植物乳杆菌的高通量筛选方法，采用分光光度法，采用分光光度法，利用亚硝酸盐与对氨基苯磺酸偶氮化，与盐酸萘乙二胺发成的颜色反应在550nm处的最大吸收峰测定亚硝酸盐含量，快速、方便。并且可以在96孔板进行微量亚硝酸盐含量测定，同时造成的毒性小。
该筛选方法如下：将分离纯化的80株不同种类的乳酸菌在多孔板中进行扩大培养，离心得乳酸菌上清；具体如下：在1.2mL MRS培养基中接入 20μL保种液于96孔板中，培养条件是：温度：30℃；时间：24h；每孔加样量为1.2mL；保种液的组成为100μL的甘油中加入50μL的菌液；
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌三种病原菌分别以10％的接种量接种到LB培养基中进行扩大培养，获得三种病原菌的菌液；分别取 20ul三种菌液，对应分别加入含有170ul新鲜LB培养基的三个多孔板中待用；扩大培养的条件如下：温度：37℃；时间：12h；转速：284rpm。
在所述三个多孔板中分别加入10ul所述的乳酸菌上清进行培养，然后检测菌液吸光值OD600；将测得的吸光值分别与空白对照相比对，得对应的抑菌率；得出抑菌率最高的植物乳酸菌，完成了植物乳杆菌的高通量筛选。
上述培养条件是：温度：37℃；时间：12h；转速：284rpm。以不加入乳酸菌上清为空白对照。每种菌的吸光值OD600测3个平行，取平均值。
抑菌率的计算如下：(C-N)*100/C
其中，C—没有加乳酸上清的病原菌OD600；
N—加入不同的乳酸菌上清的病原菌OD600。
实施例1
在验证乳酸菌降解亚硝酸盐的试验中，降解后，测得菌液的OD600值后，根据吸光度值与亚硝酸盐含量间的回归方程计算乳酸菌降解后的菌液中的亚硝酸盐的含量。所以需要配制亚硝酸盐标准溶液，并进行亚硝酸盐含量曲线的测定，具体如下：
(1)配制200μg/mL的亚硝酸盐标准溶液：准确称取0.1000g的于 37℃干燥1h的亚硝酸钠粉末，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀后置于棕色瓶避光保存。
(2)配制10g/L对氨基苯磺酸：称取1g对氨基苯磺酸溶于100mL的 24.825％(v/v)盐酸中，混匀以后置于白瓶中，用锡纸包裹住，避光保存。
(3)配制2g/L盐酸萘乙二胺：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL 的超纯水中，混匀后置于棕色瓶中，避光保存。
(4)先分别吸取250μL、246μL、242μL、238μL、234μL、 230μL、220μL、210μL、200μL的去离子水于酶标板中，然后将200 μg/mL的亚硝酸钠标准溶液稀释20倍，然后分别准确吸取4μL、8μL、 12μL、16μL、20μL、30μL、40μL、50μL的亚硝酸钠的稀释液于超纯水中吹吸混匀，以在去离子水中不加入亚硝酸钠稀释液为空白对照，即第一个酶标仪孔，紧接着加入10μL的10μg/mL的对氨基苯磺酸，室温下静止5min，然后加入5μL的2g/L的盐酸萘乙二胺，待反应10min 以后在550nm处测定吸光值。以亚硝酸钠浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标做标准曲线如图1，计算出其线性回归方程为y＝1.7693x+0.0264，相关系数R2＝0.9946。可通过该方程，利用OD值换算得到亚硝酸盐的浓度，OD值相当于方程中的y，亚硝酸盐的浓度相当于方程中的x。
实施例2
用96孔板酶标法测乳酸上清亚硝酸盐的含量：
(1)扩大培养：将灭菌以后的MRS培养基吸取1.2mL于96孔板中，然后每个96孔板接种划线提纯以后的保种菌液，接种率是1.67％。其在培养温度为30℃下培养活化24h。
(2)在培养基中加入实施例1中配制的亚硝酸盐标准溶液，使其浓度为80μg/mL，然后在加有亚硝酸盐的培养基中接种已活化24h的乳酸菌菌液，接种率为3.75％，在30℃的培养条件培养24h。
(3)将培养24h后的乳酸菌，用离心机在4000rpm离心10min后，配合排枪将乳酸菌培养液上清吸取250μL于酶标板中，然后加入10μL 的对氨基苯磺酸反应5min，然后加入5μL的盐酸萘乙二胺，反应10min 后用酶标仪在550nm处测OD值。每个样品做3个平行，测其平均值。得到了接种乳酸菌菌株培养24h后，培养基内含有的亚硝酸盐含量。
根据亚硝酸盐含量值，其亚硝酸盐去除率最高的即是本发明中的植物乳杆菌，定义为植物乳酸菌G11。然后使用植物乳酸菌G11进行更高浓度亚硝酸盐去除率的检测，如实施例3。
实施例3
(1)扩大培养：将实施例2中筛选得到的植物乳杆菌G11接种到MRS 培养基中培养活化24h，培养温度为30℃；
(2)将已活化的植物乳杆菌G11分别接入含有50μg/mL、100μ g/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的MRS培养基，每种浓度做3个平行，在30℃培养24h，以不同浓度的培养基中不加入菌液为空白对照。
(3)将培养24h后的乳酸菌G11用离心机在4000rpm离心10min后，然后对不同浓度进行稀释：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μ g/mL、400μg/mL、500μg/mL的MRS培养基分别稀释25倍、50倍、100 倍、150倍、200倍、250倍，然后用排枪将乳酸上清的稀释液分别吸取250 μL于96孔酶标板中，然后加入10μL的对氨基苯磺酸反应5min后加入5 μL的盐酸萘乙二胺，待反应10min后用酶标仪在550nm处测OD值。每个样品做3个平行，取其平均值。通过OD值换算出植物乳杆菌G11接种不同浓度亚硝酸盐MRS培养基24h后其中的亚硝酸盐含量，如图2所示。
(4)测定结果是该菌株在降解50μg/mL的亚硝酸钠时的降解率是 99.93％，在降解100μg/mL的亚硝酸钠时的降解率是99.97％，在降解200 μg/mL的亚硝酸钠时的降解率是99.90％，在300μg/mL的亚硝酸钠的降解率达到了99.32％，在降解400μg/mL的亚硝酸钠的降解率为96.45％，在降解500μg/mL的亚硝酸钠的降解率为89.86％，如图2和3所示。相对于在豆豉中分离出可降解亚硝酸盐的芽孢杆菌，其初始培养基中亚硝酸盐浓度仅为157.52μgmL-1。本发明中的植物乳杆菌可降解高浓度的亚硝酸钠，亚硝酸钠的初始浓度高达500μg/mL，在24h内的降解率89.86％，具有快速、高效降解亚硝酸盐的优势。
(5)对该菌株进行16sRNA序列的鉴定，得知本发明中的菌株最近似的菌株为植物乳杆菌BP103，16S全长相似度为100％。

Claims (2)

1.一株可降解亚硝酸盐、抑菌的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CGMCC16937。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在降解亚硝酸盐中的用途。
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海带源降亚硝酸盐和胆固醇益生乳酸菌的筛选与鉴定;储炫等;《食品工业科技》;20140722(第03期);第163-167,177页 *
腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定;蒋欣茵等;《中国酿造》;20080130(第01期);第13-16页 *
雪里蕻腌菜优良菌株分离、筛选;谢国芳等;《食品科技》;20131020(第10期);第25-29页 *

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