CN111304098B - 一种红霉素降解菌rjj-5及其应用 - Google Patents

一种红霉素降解菌rjj-5及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红霉素降解菌RJJ‑5及其应用，降解红霉素的方法和红霉素降解菌干粉剂。本发明的有益效果为：本发明提供的红霉素降解菌及其应用，是通过微生物技术手段，根据红霉素的特性，从特定环境条件中或者通过改造，得到能够降解红霉素的微生物，通过大环内酯酶，转移酶，裂解酶等对红霉素结构进行催化降解，得到无污染的代谢产物。实验证明，本发明的红霉素降解菌RJJ‑5可以在红霉素为唯一碳源的环境中存活，具有很高的红霉素降解活性，红霉素降解率可达到50％‑75％。本发明所提供的红霉素降解菌RJJ‑5可以应用于污染环境中的红霉素降解，在水处理和土壤修复方面具有很好的应用价值。

Description

一种红霉素降解菌RJJ-5及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种红霉素降解菌RJJ-5及其应用。
背景技术
我国是抗生素生产和使用大国，红霉素是常用抗生素的一种。红霉素过程中产生大量的固体废弃物，其主要成分包括了菌体、未被完全利用的培养基、培养基的降解物、生产菌代谢产生的次级代谢物以及在产品提取过程中添加的无机盐等添加物等。红霉素菌渣内含有大量的营养成分，例如粗蛋等，但是这些营养元素不能被直接使用。菌渣废弃物被国家部门认定为危险废弃物。不当的处理方法极易造成环境污染和生态危害。因此，需要开发新的清洁高效的方法来对其加以合理利用如果加以合理利用，不仅解决了环境污染问题，还能作为资源和能源进行开发。
红霉素菌渣进入水体或者土壤后，会诱导和传播大量耐药菌，特别是致病菌和条件致病菌中的抗药性在不断增加，这极大的阻碍对于疾病的治疗。由于抗生素的大规模使用使其在各种环境中均能进行迁移和转化，其所诱导生成的抗性基因也具有很高的活性和迁移转化特性，可能导致产生超级细菌等问题。
目前对红霉素菌渣的处理理论上有三个途径，焚烧、安全填埋和资源化。但是这些处理方法都存在着许多缺点，还不能满足所有的生产需求、环境要求且商业成本较大，例如：危险废物焚烧炉焚烧处置抗生素菌渣运行成本太高，且对环境有一定破坏，并且无法有效利用其中可回收成分造成部分浪费，不符合可持续发展；处理产生量巨大、有机质含量高的抗生素菌渣对环境影响巨大，因此不适用于危险废物填埋的技术。相对比较而言，利用微生物降解红霉素菌渣中有危害的抗生素，使其能通过生物安全性评价，利用微生物将红霉素作为其生长所需的碳源和能源，并在大环内酯酶，转移酶，裂解酶等作用下水解将红霉素结构进行破坏，最终降解为无毒害的简单化合物，且具有成本低，无二次污染优点，极大减少了环境的负担，同时为抗生素菌渣的无害化、减量化、可持续利用的提供新理念。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种红霉素降解菌，即墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5及其应用，以及降解红霉素的方法、红霉素降解菌干粉剂。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一株墨西哥弯孢菌，该墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5，已于2019年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC NO.19151。
本发明的第二个目的是提供了上述墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5在制备用于红霉素降解的制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供了上述墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5在制备用于红霉素环境污染后修复的制剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供了上述墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5在制备用于红霉素残留污染后土壤修复的制剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供了上述墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5在制备用于红霉素残留污染后水体修复的制剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供了一种降解红霉素的方法，将上述的墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5接种于含有红霉素的体系中培养，即可实现降解红霉素。
进一步的，上述的一种降解红霉素的方法，所述培养温度为37℃，培养时间为72h。
本发明的第七个目的是提供了一种红霉素降解菌干粉剂，所述干粉剂中含有上述的墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5。
本发明的第八个目的是提供了上述一种红霉素降解菌干粉剂的制备方法，是将墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5扩大培养后，经过常规方法干燥制得。
本发明的有益效果为：本发明提供的红霉素降解菌及其应用，以及降解红霉素的方法、红霉素降解菌干粉剂，是通过微生物技术法，即根据红霉素的特性，从特定环境条件中或者通过改造，得到能够降解红霉素的微生物，通过大环内酯酶，转移酶，裂解酶等对红霉素结构进行破坏，得到无污染的代谢产物。实验证明，本发明的红霉素降解菌RJJ-5可以在红霉素为唯一碳源的环境中存活，具有很高的红霉素降解活性，红霉素降解率可达到50％-75％。本发明所提供的红霉素降解菌RJJ-5可以应用于污染环境中的红霉素降解，在水处理和土壤修复方面具有很好的应用价值。
附图说明
图1显示为红霉素降解菌(墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5)的单菌落形态图。
图2显示为实施例2的红霉素降解曲线。
图3显示为实施例3的红霉素降解曲线。
图4显示为实施例4的红霉素降解曲线。
具体实施方式
实施例1：
红霉素降解菌(墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5)的筛选方法，步骤如下：
称取一定量菌渣，加入蒸馏水，稀释10倍。取1mL上清液，加入9mL无菌水梯度稀释，稀释至1000倍，取上清液加入含红霉素的MSM无菌培养基，置于37℃、180rpm摇床中培养5天。将上述所得上清液均匀涂布在含红霉素的MSM固体培养基上，然后放入37℃培养箱培养3-5天，在LB平板上划线分离，得到红霉素降解菌RJJ-5，其单菌落形态图如图1所示。
菌株鉴定
采用振荡破碎法获得红霉素降解菌RJJ-5基因组DNA，通过PCR方法对菌株ITS基因进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增ITS基因的上游引物序列为：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’，下游引物序列为5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’。
PCR反应条件是：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，反应31个循环，72℃延伸5min。使用NCBI的BLAST功能在GeneBank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：Curvularia mebaldsii。
红霉素降解菌RJJ-5的ITS基因序列见序列表中序列1。菌株的ITS基因序列如GeneBank：MN759651所述。
(一)主要材料
1、培养基
LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，超纯水1000mL。
MSM无机盐培养基：NH4Cl 0.630g，K2HPO4·3H2O 1.965g，KH2PO4 0.500g，NaNO31.00g，MgSO4 0.100g，超纯水1000mL。
相对应的固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。
2、仪器设备
FlexCycler PCR扩增仪，Tanon-3500凝胶成像系统，北京市六一仪器厂电泳仪，灭菌锅，英衡电子天平，UV1900紫外可见分光光度计，恒温培养箱，eppendorf高速冷冻离心机，摇床，青岛海尔集团的低温冰箱。
(二)红霉素降解测定
(1)红霉素标准曲线的绘制
准确称取10.0mg工业纯红霉素于100mL容量瓶中，用流动相定容至标线，制备成每毫升含有100.0mg的红霉素标准液。加入流动相稀释制备成1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0和80.0mg/L的红霉素标准溶液。
标准曲线为y(峰面积)＝0.2031x(红霉素浓度)-0.2785
液相条件：色谱柱：C18填料，260X4.6(mm)
流动相：V(0.025mol/L的K2HPO4溶液)∶V(乙睛)＝40∶60；
流速：0.75mL/min；进样量10μL。
柱温：50℃
紫外：210nm
(2)红霉素降解率测定方法
将降解菌接种到含有10mg的100mL液体MSM培养基中，与添加50mg的100mL液体MSM培养基中，接种量2％，置于37℃，pH＝7摇床中培养。每24h取一次发酵液，置于-20℃冰箱保存，待测。
取1mL待测发酵液用4mL流动相稀释，后取2mL液体，10000rpm离心1min，将上清液通过0.22μm滤膜后利用液相进行检测分析，再以制备标准曲线得到的方程计算出红霉素含量，得出实验组红霉素的降解率。
实施例2
将红霉素降解菌RJJ-5在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至OD600＝1，将所选菌株接种1mL到100.0mL含100mg红霉素的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180r/min，37℃培养72h降解率为71.2％，红霉素降解效率果明显(图2)。
实施例3
将红霉素降解菌RJJ-5按1％的接种量接种于100克灭菌的土壤中，并加入100mg红霉素，于37℃条件下培养72h，经测定，测定降解率为：51.22％(图3)。
实施例4
将红霉素降解菌RJJ-5按1％的接种量接种于100mL灭菌的含红霉素的废水中，经测定该废水的红霉素浓度为130mg/L，于37℃、180r/min条件下培养72h，测定红霉素降解率为：59.75％(图4)。
实施例5
红霉素降解菌RJJ-5干粉剂的制备，红霉素降解菌RJJ-5扩大培养后，经过常规方法干燥制得。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 常州大学
江苏碧奥环保科技有限公司
河北慈心环保科技有限公司
<120> 一种红霉素降解菌RJJ-5及其应用
<130> 5
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 572
<212> DNA
<213> Curvularia mebaldsii
<400> 1
tccgtagggt gaacctgcgg agggatcatt acacaataaa atacgaaggc cgttcgcggc 60
tggactattt attacccttg tcttttgcgc acttgttgtt tcctgggcgg gttcgctcgc 120
caccaggacc acaatataaa ccttttttat gcagttgcaa tcagcgtcag tataacaaat 180
gtaaatcatt tacaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca 240
gcgaaatgcg atacgtagtg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 300
acattgcgcc ctttggtatt ccaaagggca tgcctgttcg agcgtcattt gtaccctcaa 360
gctttgcttg gtgttgggcg tttttgtctt tggcccgcca aagactcgcc ttaaaatgat 420
tggcagccgg cctactggtt tcgcagcgca gcacattttt gcgcttgcaa tcagcaaaag 480
aggacggcaa tccatcaaga ctccttctca cgtttgacct cggatcaggt agggataccc 540
gctgaactta agcatatcaa taagcggagg aa 572

Claims (9)

1.一株墨西哥弯孢菌，其特征在于，该墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5，保藏号为CGMCC NO.19151。
2.根据权利要求1所述的墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5在制备用于红霉素降解的制剂中的应用。
3.根据权利要求1所述的墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5在制备用于红霉素环境污染后修复的制剂中的应用。
4.根据权利要求1所述的墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5在制备用于红霉素残留污染后土壤修复的制剂中的应用。
5.根据权利要求1所述的墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5在制备用于红霉素残留污染后水体修复的制剂中的应用。
6.一种降解红霉素的方法，其特征在于，将权利要求1所述的墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5接种于含有红霉素的体系中培养，即可实现降解红霉素。
7.根据权利要求6所述的一种降解红霉素的方法，其特征在于，培养温度为37℃，培养时间为72h。
8.一种红霉素降解菌干粉剂，其特征在于，所述干粉剂中含有权利要求1所述的墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5。
9.根据权利要求8所述的一种红霉素降解菌干粉剂的制备方法，其特征在于，是将墨西哥弯孢菌(Curvularia mebaldsii)RJJ-5扩大培养后，经过常规方法干燥制得。
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