CN111893052B - 一种红霉素降解菌铜绿假单胞菌rjj-1及其应用 - Google Patents

一种红霉素降解菌铜绿假单胞菌rjj-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及其应用，属于微生物环境修复领域。本发明的铜绿假单胞菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.19234，对红霉素具有极强的降解能力，将其应用于红霉素发酵菌渣无害化处理，水体、土壤修复具有很好的前景。

Description

一种红霉素降解菌铜绿假单胞菌RJJ-1及其应用
技术领域
本发明属于微生物环境修复领域。
背景技术
随着红霉素的需求量日益增大，红霉素药厂在生产过程中产生了越来越多的具有严重污染的菌渣，其主要成分是培养红霉素产生的菌丝体、废弃培养基、发酵过程中产生的代谢产物、降解红霉素菌以及少量的红霉素等。
菌渣中残留的红霉素会进入土壤和水体，影响植物、动物和微生物的生长发育，并且在动物体内蓄积的红霉素也会随食物链逐级积累被人体摄入，引起人体的过敏反应，严重时引起食物中毒，甚至带来致癌、致畸、致突变等危害。另一方面，在被感染土壤中生长的食物会对人体肠道内微生物生态失衡，使致病菌大量繁殖，危害人体健康。
目前红霉素菌渣处理方法大致有:焚烧处理、厌氧消化技术处理、饲料化处理、肥料化处理、菌渣提纯、能源化处理等。但是这些处理方法成本高、操作繁琐费力、能量消耗大。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，又名绿脓杆菌，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。目前文献提及将铜绿假单胞菌与其他菌株组合用于降解红霉素：公布号为CN109609411A的专利申请公开了一种复合菌群，它是由蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌组成，该复合菌群3天内可降解红霉素90％左右。经仔细分析发现，该专利申请有关红霉素降解的试验例有违常识，并不可信：它首先将红霉素粉末用甲醇溶解至浓度100mg/L，再按投菌量4％加入微生物菌群，于第3天检测红霉素剩余量。可见，这降解试验期间，微生物菌群处在96％(v/v)的甲醇溶液中。而本领域公知的，甲醇是一种有毒的有机溶剂，可改变细胞膜的通透性，微生物无法在96％(v/v)的甲醇溶液中生存，更不可能在其中降解红霉素。因此，目前还没有关于铜绿假单胞菌用于降解红霉素的可靠的报道，更没有单独使用铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌作为唯一活性菌种)用于降解红霉素的报道。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一株降解红霉素能力强的铜绿假单胞菌菌株，以及铜绿假单胞菌在降解红霉素中的应用。
本发明的技术方案如下：
一株铜绿假单胞菌，其特征在于，所述铜绿假单胞菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，位于：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNO.19234。
铜绿假单胞菌在降解红霉素中的用途。
如前述的用途，铜绿假单胞菌是用于降解红霉素的唯一活性菌种。
如前述的用途，所述铜绿假单胞菌是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏编号为CGMCC NO.19234的铜绿假单胞菌。
铜绿假单胞菌在制备降解红霉素的菌剂中的用途。
进一步的，所述菌剂中，铜绿假单胞菌是用于降解红霉素的唯一活性菌种；
进一步的，所述铜绿假单胞菌是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏编号为CGMCC NO.19234的铜绿假单胞菌。
一种用于降解红霉素的菌剂，所述菌剂以铜绿假单胞菌为活性成分。
如前述的菌剂，所述菌剂以铜绿假单胞菌为降解红霉素的唯一活性菌种。
如前述的菌剂，所述铜绿假单胞菌是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏编号为CGMCC NO.19234的铜绿假单胞菌。
本发明的铜绿假单胞菌菌株，对红霉素的降解能力强，可广泛应用于水体、土壤中红霉素污染的治理，具有优良的社会效益。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明铜绿假单胞菌RJJ-1单菌落形态图。
图2为本发明铜绿假单胞菌RJJ-1在LB液体中对红霉素的降解曲线。
图3为本发明铜绿假单胞菌RJJ-1在土壤中对红霉素的降解曲线。
图4为本发明铜绿假单胞菌RJJ-1在废水中对红霉素的降解曲线。
具体实施方式
实施例1本发明铜绿假单胞菌RJJ-1的筛选与鉴定
1.筛选
称取一定量菌渣，加入蒸馏水，稀释10倍。取1mL上清液，加入9mL无菌水梯度稀释，稀释至1000倍，取上清液加入含红霉素的MSM无菌培养基，置于37℃、180r/min摇床中培养5天。将上述所得上清液均匀涂布在含红霉素的MSM固体培养基上，然后放入37℃培养箱培养3-5天，在LB平板上划线分离，暂命名为“红霉素降解菌RJJ-1”。
2.菌株鉴定
采用振荡破碎法获得红霉素降解菌RJJ-1基因组DNA，通过PCR方法对菌株16SrRNA基因进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增16S rRNA基因的上游引物序列为：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’(SEQ ID NO.1)，下游引物序列为5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’(SEQ ID NO.2)。
PCR反应体系：Prime STAR Max(2×)15μL，引物(25pmol μL-1)各1μL，模板DNA0.25μL，ddH2O补齐至30μL；
PCR反应条件是：95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，反应31个循环，72℃延伸5min。
测序得到的红霉素降解菌RJJ-1的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.3所示。铜绿假单胞菌的16S rRNA基因序列如GeneBank：MN759462所述。使用NCBI的BLAST功能在GeneBank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
将所述菌株重新命名为“铜绿假单胞菌RJJ-1”，已于2019年12月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.19234。
以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。实验例中涉及的主要材料和方法如下：
(一)主要材料
1、培养基
LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，超纯水1000mL。
MSM无机盐培养基：NH4Cl 0.630g，K2HPO4·3H2O 1.965g，KH2PO4 0.500g，NaNO31.00g，MgSO4 0.100g，超纯水1000mL。
相对应的固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉15g配制成。
2、仪器设备
FlexCycler PCR扩增仪，Tanon-3500凝胶成像系统，北京市六一仪器厂电泳仪，灭菌锅，英衡电子天平，UV1900紫外可见分光光度计，恒温培养箱，eppendorf高速冷冻离心机，摇床，青岛海尔集团的低温冰箱。
(二)红霉素降解测定
(1)红霉素标准曲线的绘制
准确称取10.0mg工业纯红霉素于100mL容量瓶中，用流动相定容至标线，制备成每毫升含有100.0mg的红霉素标准液。加入流动相稀释制备成1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0和80.0mg/L的红霉素标准溶液。
标准曲线为y(峰面积)＝0.2031x(红霉素浓度)-0.2785
液相条件：色谱柱：C18填料，260X4.6(mm)
流动相：V(0.025mol/L的K2HPO4溶液)∶V(乙睛)＝40∶60；
流速：0.75mL/min；进样量100μL。
柱温：50℃
紫外：210nm
(2)红霉素降解率测定方法
将降解菌接种到含有10mg的100mL液体MSM培养基中，pH＝7，与添加50mg的100mL液体MSM培养基中，接种量2％，置于37℃摇床中培养。每24h取一次发酵液，置于-20℃冰箱保存，一共取样4天。
取1mL发酵液用4mL流动相稀释，后取2mL液体，10000rpm离心1min，将上清液通过0.22μm滤膜打入进样瓶中。再以制备标准曲线时相同的液相条件进行测定，得出实验组红霉素的降解率。
实验例1培养基中红霉素的降解实验
将本发明铜绿假单胞菌RJJ-1在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至OD600＝1的悬液，取1mL前述悬液接种到100.0mL含100mg红霉素的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中180r/min，37℃培养72h降解率为68.2％，红霉素降解效率果明显(图2)。
本实验例结果表明，铜绿假单胞菌RJJ-1能有效降解红霉素。
实验例2土壤中红霉素的降解实验
将本发明铜绿假单胞菌RJJ-1在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至OD600＝1的悬液，取1mL前述悬液接种到100克灭菌的土壤中，并加入100mg红霉素，于37℃条件下培养72h，经测定，红霉素降解率为：46.22％(图3)。
本实验例结果表明，本发明铜绿假单胞菌RJJ-1能有效降解土壤中的红霉素，并能用于土壤中红霉素污染治理。
实施例3废水中红霉素的降解实验
将本发明铜绿假单胞菌RJJ-1在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌水重悬，并稀释至OD600＝1的悬液，取1mL前述悬液接种到100mL灭菌的含红霉素的废水中，经测定该废水的红霉素浓度为130mg/L，于37℃、180r/min条件下培养72h，测定红霉素降解率为：53.75％(图4)。
本实验例结果表明，铜绿假单胞菌RJJ-1能有效降解废水中的红霉素，并能用于废水中红霉素污染治理。
综上，本发明的铜绿假单胞菌RJJ-1能有效降解红霉素，只需简单接种，就能在土壤和废水中发挥降解红霉素的作用，简单高效。
附录：
红霉素降解菌RJJ-1 16S rRNA基因序列(SEQ ID NO.3)：
Figure BDA0002507786030000051
Figure BDA0002507786030000061
SEQUENCE LISTING
<110> 常州大学
伊犁川宁生物技术有限公司
<120> 一种红霉素降解菌铜绿假单胞菌RJJ-1及其应用
<130> GY218-2020P019483CC
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1358
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
<400> 3
tcgagcggta tgatacggga gcttgctcct ggattacagc ggcggacggg tgagtaatgc 60
ctaggaatct gcctggtagt gggggataac gtccggaaac gggcgctaat accgcatacg 120
tcctgaggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagc ctaggtcgga 180
ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga 240
tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300
atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg 360
gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac 420
gttaccaaca gaataagcac cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt 480
gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcag caagttggat 540
gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tactgagcta gagtacggta 600
gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt 660
ggcgaaggcg accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 720
aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt 780
gagatcttag tggcgcagct aacgcgataa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840
ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900
aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatgctgag aactttccag agatggattg 960
gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020
gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cctcgggtgg 1080
gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1140
atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgccaag 1200
ccgcgaggtg gagctaatcc cataaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg 1260
actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tgaatcagaa tgtcacggtg aatacgttcc 1320
cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtg 1358

Claims (10)

1.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），其特征在于，所述铜绿假单胞菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.19234。
2.铜绿假单胞菌在降解红霉素中的用途；所述铜绿假单胞菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.19234。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述用途中，铜绿假单胞菌是用于降解红霉素的唯一活性菌种。
4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于：所述铜绿假单胞菌是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）、保藏编号为CGMCC NO.19234的铜绿假单胞菌。
5.铜绿假单胞菌在制备降解红霉素的菌剂中的用途；所述铜绿假单胞菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.19234。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：所述菌剂中，铜绿假单胞菌是用于降解红霉素的唯一活性菌种。
7.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于：所述铜绿假单胞菌是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）、保藏编号为CGMCC NO.19234的铜绿假单胞菌。
8.一种用于降解红霉素的菌剂，其特征在于：所述菌剂以铜绿假单胞菌为活性成分；所述铜绿假单胞菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNO.19234。
9.如权利要求8所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂以铜绿假单胞菌为降解红霉素的唯一活性菌种。
10.如权利要求8或9所述的菌剂，其特征在于：所述铜绿假单胞菌是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）、保藏编号为CGMCC NO.19234的铜绿假单胞菌。
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CN109609411A (zh) * 2019-01-08 2019-04-12 北京科技大学 一种用于降解红霉素的微生物菌群及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

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施凯舜等.铜绿假单胞菌耐药研究进展.《浙江医学》.2008,(第02期),第199-202页. *

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