CN113943677B - 一株降解甲基汞的赫尔曼亚特兰大杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株降解甲基汞的赫尔曼亚特兰大杆菌(Atlantibacter hermannii)L‑1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 20211329。该菌株对甲基汞有较强的降解能力，对终浓度为1ng ml‑1的甲基汞能达到31.99％的降解率，在添加Ca2+的条件下能进一步提高降解率。本发明能应用于环境土壤中甲基汞的降解，对减少农作物中的甲基汞残留，保护人和动物生命健康具有重要意义。

Description

一株降解甲基汞的赫尔曼亚特兰大杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株降解甲基汞的赫尔曼亚特兰大杆菌(Atlantibacter hermannii)及其应用，属于微生物领域。
背景技术
甲基汞是重金属汞毒性最强的有机形态，具有极强的生物富集与生物放大特性，容易随食物链威胁食品安全与生命健康。当今全球人类因甲基汞摄入造成的经济损失总计为1170亿美元，因此，对甲基汞含量的调控至关重要。自然环境中甲基汞的降解主要通过生物和非生物降解两种途径。目前，对甲基汞的非生物降解已有一定的研究进展，然而对于生物降解的了解相对有限。环境中微生物资源丰富，很多微生物既可以对环境中的污染物进行降解，又可以避免引入其它化学试剂而造成二次污染。因此，研究甲基汞的微生物降解具有重要的意义和应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株降解甲基汞的赫尔曼亚特兰大杆菌，本发明的第二个目的是提供该菌株在降解甲基汞中的应用。
申请人从中国农业微生物菌种保藏管理中心获得一株未知分类和功能的菌株，通过全基因组提取及扩增产物测序，鉴定其为赫尔曼亚特兰大杆菌(Atlantibacterhermannii)。将该菌株分类命名为赫尔曼亚特兰大杆菌(Atlantibacter hermannii)L-1，并于2021年10月26日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20211329。
接着，申请人对该菌的功能进行验证，结果发现赫尔曼亚特兰大杆菌L-1对甲基汞具有很高的降解能力，对于浓度为1ng ml-1的甲基汞，菌株L-1能在120h内将其浓度降低至0.49ng ml-1，降解效率达到31.99％。而在5mM Ca2+条件下，L-1的降解能力进一步提高，对甲基汞的降解效率可达到53.69％。
田间应用试验进一步表明，菌株L-1能降低土壤和稻米中的MeHg含量，降解效率分别为66.80％和23.21％。
因此，赫尔曼亚特兰大杆菌L-1可降解甲基汞，从而应用于环境污染治理，对减少环境或农作物中的甲基汞残留，保护人和动物生命健康具有重要意义。
一种降解甲基汞的方法，该方法包括向甲基汞中施加所述赫尔曼亚特兰大杆菌L-1的步骤。
优选地，该方法还包括向甲基汞中施加Ca2+的步骤。
更详尽的技术方案参见具体实施例。
附图说明
图1是菌株L-1对甲基汞的降解效率测定。
图2是菌株L-1在Ca2+存在条件下对甲基汞的降解效率测定。
图3是菌株L-1对稻田土壤和稻米中MeHg含量的影响。
具体实施方式
实施例1.菌种的筛选与鉴定
申请人华中农业大学从中国农业微生物菌种保藏管理中心获得一株未知分类和功能的菌株，将其复苏和扩大培养后送至上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组提取及扩增产物测序。所得基因序列通过GeneBank进行同源性比对，确定其分类地位。
结果表明其基因序列与Atlantibacter hermannii的16S rRNA基因序列相似率达到99％，该菌株属于赫尔曼亚特兰大杆菌(Atlantibacter hermannii)，测序结果见SEQ IDNo.1。
申请人将该菌株分类命名为赫尔曼亚特兰大杆菌(Atlantibacter hermannii)L-1，并于2021年10月26日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20211329。
实施例2菌株的功能验证
1.菌株的复苏与扩大培养
(1)以无菌操作方式开启冻干菌安瓿管，用无菌吸管向该菌冻干粉中加入适量(0.3ml)的YM琼脂液体培养基，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌悬液，移植于斜面培养基(不超过2支)，28℃静止培养，此为第1代培养物；
(2)用接种环取第一代培养物，接种于YM液体培养基，于28℃摇床中震荡24h，即为第2代培养物，依此方法培养至所需代数。
2.菌株的功能验证
试验方法：
菌株L-1在YM琼脂培养基中生长。每0.5h测量OD600以监测菌株生长曲线，在对数增长期收集细胞。
实验中甲基汞储备液为10ng ml-1MeHgCl(溶解在0.5％CH3COOH，0.2％HCl，BrooksRand Labs)，实验最终浓度为1ng ml-1。细胞浓度固定为5×108cell ml-1。实验在4ml棕色玻璃瓶中进行，最终体积为1ml。最后，棕色瓶立即用盖子密封，避光置于振荡器中进行反应。
在实验所需的时间点，从振荡器中取出样品进行甲基汞浓度的测定。甲基汞的测量方法是根据EPA1630修改的，该方法主要用于水样中甲基汞的测定，主要包括蒸馏，乙基化，MERX系统，冷原子荧光光谱CVAFS等分析流程。详细方法如下：取一定体积的样品到蒸馏样品管中，依次加入试剂：KCl(20％),H2SO4(9M),CuSO4(0.2M)，接着使用去离子水定容至45ml，在125℃下蒸馏至冷凝管(预先加入10ml去离子水)中，蒸馏过程在蒸馏装置MDSMethyl Hg Distillation System上完成，并将蒸馏后收集的样品转移至棕色瓶中。
向蒸馏后的样品中加入一定体积的醋酸缓冲溶液和四乙基硼酸钠(NaBEt4，将甲基汞乙基化为甲基乙基汞)，最后在全自动烷基汞分析仪(Brooks Rand ModelⅢ,USA)上进行甲基汞浓度的测定。
试验1：菌株对甲基汞的降解效果测定
取对数生长期的降解菌菌液，细胞浓度为5×108cell ml-1。实验在4ml棕色瓶中进行，甲基汞终浓度为1ng ml-1，最终体系为1ml，置于振荡器中反应(180r·min-1，28℃)。每个处理设3个平行。降解反应0、24、48、72、96、120h，测定不同反应时间溶液中的甲基汞浓度。结果表明：随着反应时间的增加，反应体系中甲基汞的浓度逐渐减少，120h后甲基汞浓度为0.49ng ml-1，对甲基汞的降解效率达到31.99％(图1)。
试验2：Ca2+促进降解菌对甲基汞的降解。
取对数生长期的降解菌菌液，细胞浓度为5×108cell ml-1。实验在4ml棕色瓶中进行，甲基汞终浓度为1ng ml-1，Ca2+最终浓度为5mM,最终体系为1ml，置于振荡器中反应(180r·min-1，28℃)。每个处理设3个平行。降解反应0、24、48、72、96、120h，测定不同反应时间溶液中的甲基汞浓度。结果表明：随着反应时间的增加，反应体系中甲基汞的浓度逐渐减少，120h后甲基汞浓度为0.335ng ml-1，对甲基汞的降解效率达到53.69％(图2)。
试验3：
该菌在贵州省铜仁市万山区茶店街道垢溪村农户田间施用后有效降低了稻田土壤和水稻中MeHg含量。将生长至对数期的赫尔曼亚特兰大杆菌L-1与泥炭土预混制成菌剂，在分蘖期稻苗根部以挖沟掩埋的方式施用，用量为5×1011cell m-2。45天后收获水稻，与未施用菌剂的对照组相比，发现实验组稻田土壤和稻米中MeHg的降解效率分别为66.80％和23.21％(P<0.05)(图3)。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一株降解甲基汞的赫尔曼亚特兰大杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1382
<212> DNA
<213> 赫尔曼亚特兰大杆菌(Atlantibacter hermannii)
<400> 1
aagcagcttg ctgcttcgct gacgagtggc ggacgggtga gtaatgtctg gggatctgcc 60
tgatggaggg ggataactac tggaaacggt agctaatacc gcataacgtc gcaagaccaa 120
agagggggac cttcgggcct cttgccatca gatgaaccca gatgggatta gctagtaggt 180
ggggtaacgg ctcacctagg cgacgatccc tagctggtct gagaggatga ccagccacac 240
tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg 300
ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg tatgaagaag gccttcgggt tgtaaagtac 360
tttcagcggg gaggaaggcg atgcggttaa taaccgcgtc gattgacgtt acccgcagaa 420
gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca agcgttaatc 480
ggaattactg ggcgtaaagc gcacgcaggc ggtctgtcaa gtcggatgtg aaatccccgg 540
gctcaacctg ggaactgcat ccgaaactgg caggcttgag tcttgtagag gggggtagaa 600
ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa taccggtggc gaaggcggcc 660
ccctggacaa agactgacgc tcaggtgcga aagcgtgggg gagcaaacag gattagatac 720
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga cttggaggtt gtgcccttga ggcgtggctt 780
ccggagctaa cgcgttaagt cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa 840
tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa 900
gaaccttacc tggtcttgac atccacagaa ttctgcagag atgcggaagt gccttcggga 960
actgtgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt 1020
cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt ccggccggga actcaaagga 1080
gactgccagt gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg 1140
accagggcta cacacgtgct acaatggcgc atacaaagag aagcgacccc gcgagggcaa 1200
gcggacctca taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac tccatgaagt 1260
cggaatcgct agtaatcgtg gatcagaatg ccacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320
acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag taggtagcta acctccggag 1380
gg 1382

Claims (4)

1.一株降解甲基汞的赫尔曼亚特兰大杆菌(Atlantibacter hermannii)L-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211329。
2.权利要求1所述的赫尔曼亚特兰大杆菌L-1在体外降解甲基汞中的应用。
3.一种体外降解甲基汞的方法，其特征在于：该方法包括向甲基汞中施加权利要求1所述赫尔曼亚特兰大杆菌L-1的步骤。
4.如权利要求3所述体外降解甲基汞的方法，其特征在于：该方法还包括向甲基汞中施加Ca2+的步骤。
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