CN111286470A - 一株可降解红霉素的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明筛选获得一株可降解红霉素的枯草芽孢杆菌BS‑5，并将该菌株应用于红霉素发酵菌渣的无害化处理，有效降解了其中的红霉素残留。本发明属于微生物降解抗生素残留技术领域。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18635。本发明为红霉素发酵废弃物中红霉素残留的降解提供了有效的生物处理方法，适于工业推广应用，有望促进红霉素发酵工业健康和持续发展。

Description

一株可降解红霉素的枯草芽孢杆菌及其应用
所属技术领域
本发明涉及抗生素发酵废弃物的无害化处理，通过筛选获得了可降解红霉素的枯草芽孢杆菌，属于固体废弃物生物技术治理领域。
背景技术
红霉素菌渣是红霉素发酵生产过程中产生的固体废弃物，由于菌渣中含有一定营养物质如粗蛋白、粗脂肪和粗纤维等有机质以及赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等13 种氨基酸，可添加到肥料或饲料中。但是，在未经过安全性消除效价处理的情况下直接将红霉素菌渣用作饲料或其他产品出售，会使菌渣中的红霉素残留在土壤中富集，而饲料化会使残留抗生素不能完全降解从而以动物粪便的形式排出体外，从而对环境造成危害。2008年国家修订了《国家危险废物名录》，其中明确规定抗生素菌渣属于化学药品原料药生产过程中的培养基废物，必须按照危险废物进行管理，并且禁止未经处理添加到肥料或饲料中。为此，红霉素菌渣资源化利用成为大家关注的热点，目前常用的红霉素菌渣处理方法为制备高纯氧化锌、厌氧发酵、肥料法和微生物降解法。但是这些处理方法未能有效降解菌渣中的红霉素，且具有成本高、二次污染等缺点，因此在企业中实际推广效果不佳。
发明内容
本发明的目的是筛选获得可降解红霉素的芽孢杆菌，为红霉素发酵废渣中红霉素残留的有效降解提供一种生物处理的技术方案。本发明首先筛选获得了一株红霉素降解菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-5，其菌落和菌体特征如图1和图2所示。该菌株已于2019年9月 30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 18635，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。其次，提供了该菌降解红霉素发酵废渣中红霉素残留的发酵方法。
本发明所述的可降解红霉素的枯草芽孢杆菌的筛选方法，其技术方案如下：
(1)采集红霉素废渣周围受红霉素污染的土壤样品。
(2)富集芽孢菌：利用芽孢的耐热性，通过在80℃水浴处理10min后进行摇床培养，达到富集芽孢菌的效果。可通过反复富集实现更好的芽孢菌富集效果。
(3)筛选抗红霉素的芽孢菌：通过逐步提高培养基中红霉素的浓度(10-100mg/L)，实现抗红霉素芽孢菌的有效富集，通过涂布含有500mg/L红霉素的固体培养基平板，筛选获得抗红霉素的芽孢菌。
(4)降解红霉素菌株的验证：采用抑菌圈法测定和比较不同菌株对红霉素降解后的残留量，筛选获得降解红霉素效果明显的菌株。
(5)菌种鉴定：通过16s rDNA测序对所筛菌株进行鉴定
本发明所述的应用是指，将所筛选的枯草芽孢杆菌应用于红霉素发酵菌渣中红霉素残留的降解，其技术方案如下：
(1)红霉素发酵菌渣的预处理：在菌渣中加入水，并添加1-5％的葡萄糖，通过80℃水浴进行一定程度的无菌处理。
(2)发酵：按2-10％接种量接种所筛选的枯草芽孢杆菌，37℃发酵培养红霉素菌渣。
(3)红霉素残留的检测：采用LC-MS方法定量检测红霉素残留
本发明的有益效果：
(1)获得了可有效降解红霉素残留的芽孢杆菌，为红霉素发酵废弃物的无害化处理提供了一种生物法处理方案。
(2)该方法，相比化学法和焚烧发，能耗低，二次污染少，并且有利于实现红霉素菌渣的资源化利用，将有望促进红霉素发酵工业的健康和持续发展。
附图说明
图1：菌株CGMCC NO.18635的菌落图
图2：菌株CGMCC NO.18635的菌体图。
图3：抑菌圈法测定不同菌株发酵后的红霉素残留量。
图4：枯草芽孢杆菌CGMCC NO.18635对红霉素发酵菌渣中红霉素残留的降解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：可降解红霉素的枯草芽孢杆菌的筛选
(1)采集红霉素废渣周围受红霉素污染的土壤样品。
(2)富集芽孢菌：称取1g受红霉素污染的土壤样品，加入含有十颗玻璃珠和20mLLB (组成成分：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，和5g/L酵母浸粉，pH 7.2)。培养基的三角瓶中，充分混匀后80℃水浴10分钟，然后37℃、220r/min摇床培养24h，再次80℃水浴10分钟；
(3)筛选抗红霉素的芽孢菌：从富集的芽孢菌菌液中取1ml菌液转接到含有10mg/L红霉素的LB培养基中，37℃、220r/min条件下摇床培养24h，然后从中取1ml菌液转接到含有100 mg/L红霉素的LB培养基中，37℃、220r/min条件下摇床培养24h；取1mL菌液连续涂布含有 500mg/L红霉素的固体LB培养基平板上，培养24h；挑取长势良好的菌落，通过三区划线进行在分离纯化，得到单一纯菌落。
(4)降解红霉素菌株的验证：通过24孔板在含有100mg/L红霉素的LB培养基中培养抗红霉素的芽孢菌，培养24h后取样。离心取上清后，采用抑菌圈法测定红霉素残留量，如图3所示，最终通过比较抑菌圈大小获得一株降解红霉素效果明显的菌株。抑菌圈法测定红霉素残留，挑取枯草芽孢杆菌WB600作为敏感菌用于检测。
(5)菌种鉴定：培养可降解红霉素的芽孢菌，提取基因组，PCR扩增后进行16s rDNA测序，将所测序列提交GenBank进行分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。
实施例2：所述枯草芽孢杆菌对红霉素发酵菌渣中红霉素残留的降解
(1)红霉素发酵菌渣的预处理：取5g红霉素发酵菌渣于250mL锥形瓶中，添加50mL去离子水和2％葡萄糖，混匀后80℃水浴振荡2h。
(2)发酵：按5％接种量接入枯草芽孢杆菌菌液，37℃，220r/min摇床培养4天。
(3)红霉素残留的检测：采用LC-MS方法检测红霉素残留，发酵四天后菌渣中的红霉素残留经检测被完全降解，结果如图4所示。LC-MS仪器为安捷伦公司的1200HPLC和电喷雾四极杆质谱。色谱柱采用Waters C18柱(5μm，2.1x150mm)，流速0.2mL/min，流动相组成：流动相A，含0.1％甲酸的水溶液，流动相B，含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度变化条件：流动相B，0-15min，5％-95％；15-16min，95％-5％。进样量10μL，质谱分析采用SIM模式，选择性检测离子：734.18、157.88、576.13。通过外标法对红霉素进行定量分析。

Claims (1)

1.一株可降解红霉素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-5，其特征在于：其保藏编号为CGMCC NO.18635，保藏日期：2019年9月30日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
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