CN105176951A - 一种新型碱性蛋白酶突变体 - Google Patents

一种新型碱性蛋白酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新型的碱性蛋白酶突变体，以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE为基础，通过易错PCR技术获得了三个碱性蛋白酶突变体aprE-M1、aprE-M2和aprE-M3，并分别构建了表达上述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌BS-4，BS-5和BS-10，其发酵上清液在pH7.0条件下的酶活分别为4549U/mL、9073U/mL和7333U/mL，比重组表达野生型碱性蛋白酶aprE的枯草芽孢杆菌BS分别提高了42％、180％和130％。此外，所述野生型碱性蛋白酶aprE的最适pH为11.5，而本发明获得的碱性蛋白酶突变体aprE-M1、aprE-M2和aprE-M3的最适pH分别为10.5，9.0和10.0，且在pH7.0-9.0的范围内相对酶活显著高于野生型碱性蛋白酶，其中又以碱性蛋白酶突变体aprE-M2的相对酶活最高，取得了意料不到的技术效果。

Description

一种新型碱性蛋白酶突变体
技术领域
本发明属于蛋白质工程改造领域，具体涉及一种新型的碱性蛋白酶突变体。
背景技术
碱性蛋白酶(alkalineprotease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27kDa。国内工业生产蛋白酶的菌株多是经地衣芽孢杆菌2709选育而来，是通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶。碱性蛋白酶广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业，是工业用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的60％左右(MalaB.R.等，1998，MicrobiologyandMolecularBiologyReviews)。
酶分子的定向进化，是模拟自然进化过程的人工策略，属于蛋白质的非合理设计方式，通过利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，迅速获得理想的突变体。近几年酶的定向进化主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、提高热稳定性、对映立体选择等方面(JohannesTWetal.Curr.Microbiol,2006,9:261-267)。酶的定向进化技术为酶的结构和功能开辟了崭新的途径，在工业、农业、食品业、环境等领域取得巨大成功。
碱性蛋白酶是目前市场上畅销的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤剂的去污效果，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢具有独特的洗涤效果。市场上现有的碱性蛋白酶产品普遍在碱性(pH9-12)条件下的活力较高，洗涤效果好，而在中性(pH7-9)条件下的活力较低。但是碱性洗涤剂对皮肤、衣物等的损伤较大，因此目前急需开发一种在中性条件下仍能保持高酶活力的碱性蛋白酶产品。
发明内容
本发明为解决现有技术问题提供了一种在中性pH范围内酶活力得到显著提高的碱性蛋白酶突变体。所述突变体是由克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)碱性蛋白酶基因aprE的成熟肽出发，运用易错PCR分子生物学技术获得的。
本发明一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO:1的碱性蛋白酶的第103位氨基酸由Ser变为Glu。
上述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:3，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO:4。
本发明还包括携带有编码序列为SEQIDNO:4的碱性蛋白酶突变体基因的质粒。
本发明另一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO:3的碱性蛋白酶的第132位氨基酸由Thr突变为Asp。
上述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:5，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO:6。
本发明还包括携带有编码序列为SEQIDNO:6的碱性蛋白酶突变体基因的质粒。
本发明还提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO:3的碱性蛋白酶的第207位氨基酸由Thr突变为Arg。
上述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:7，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO:8。
本发明还包括携带有编码序列为SEQIDNO:8的碱性蛋白酶突变体基因的质粒。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
本发明以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE为基础，通过易错PCR技术获得了三个碱性蛋白酶突变体aprE-M1、aprE-M2和aprE-M3，并分别构建了表达上述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌BS-4，BS-5和BS-10，其发酵上清液在pH7.0条件下的酶活分别为4549U/mL、9073U/mL和7333U/mL，比重组表达野生型碱性蛋白酶aprE的枯草芽孢杆菌BS分别提高了42％、180％和130％。此外，所述野生型碱性蛋白酶aprE的最适pH为11.5，而本发明获得的碱性蛋白酶突变体aprE-M1、aprE-M2和aprE-M3的最适pH分别为10.5，9.0和10.0，且在pH7.0-9.0的范围内相对酶活显著高于野生型碱性蛋白酶，其中又以碱性蛋白酶突变体aprE-M2的相对酶活最高，取得了意料不到的技术效果。本发明所述碱性蛋白酶突变体可广泛应用于中性洗涤剂中，有利于减少洗涤剂对皮肤、衣物等的损伤，市场前景广泛。
附图说明
图1：pQC67质粒的遗传图谱；
图2：碱性蛋白酶突变体pH-相对酶活曲线图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：
1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T25327-2009)。
2、酶活单位的定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液(一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液(42.4g/L)，三氯乙酸(65.4g/L)，梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液(10.0g/L)。反应过程如下：试管中加入1mL酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1mL，摇匀后40℃温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1mL滤液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。
4、定义：
氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
5、碱性蛋白酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如Ser103Glu，表示位置103的氨基酸由亲本碱性蛋白酶的Ser替换成Glu，位置的编号对应于附件序列表SEQIDNO:1中的编号。如Ser103Glu/Arg164Glu，表示位置103和位置164的氨基酸都发生了突变。
实施例1野生型碱性蛋白酶aprE重组菌株的构建
TIANGEN公司的TIANrepRapidMiniPlasmidKit制备载体pUB110，其制备过程参照试剂盒的操作手册。
实验中所用引物如下:
引物1：5’-tgcagaagcggcaacacgctaaattaagcatgcaagctagttgc-3’；
引物2：5’-ttttccccaacggtttcttcatcgttcatgtctccttttttatg-3’
引物3：5’-cataaaaaaggagacatgaacgatgaagaaaccgttggggaaaa-3’
引物4：5’-gcaactagcttgcatgcttaatttagcgtgttgccgctcctgca-3’
以pUB110质粒为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增，获得载体基因序列。扩增条件为：98℃10min；98℃10s，55℃20s，72℃3min，30个循环；72℃10min。利用E.Z.N.A.GelExtractionKit回收PCR扩增产物。
以克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)基因组为模板，利用引物3和引物4进行PCR扩增，获得克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因aprE及信号肽序列。所述碱性蛋白酶基因aprE基因序列为SEQIDNO:2，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:1。扩增条件为：94℃10min；94℃60s，58℃60s，72℃2min，30个循环；72℃10min。利用E.Z.N.A.GelExtractionKit回收PCR扩增产物。
将目标片段(aprE)和载体片段通过重叠延伸PCR形成多聚体，扩增体系如下：5×PhusionHFBuffer10μL，2.5mMdNTPs8μL，Insertgene(aprE片段)4μL，Linearizedvector(pQC67)6μL，PhusionDNAPolymerase1μL，ddH2O21μL。扩增条件为98℃10min；98℃10s，72℃3min，20个循环；98℃10s，72℃6min，15个循环；72℃10min。将多聚体转化Bacillussubtilis1A751宿主菌，筛选阳性转化子，得到表达野生型碱性蛋白酶aprE的重组菌株，命名为枯草芽孢杆菌BS(BacillussubtilisBS)。提取枯草芽孢杆菌BS里的质粒，将其命名为pQC67(含有野生型aprE基因)，其质粒图谱如附图1所示。
上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1A751是利用感受态方法进行转化，具体转化过程如下：将新鲜活化的B.subtilis1A751由LB(胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl1％)平板接种到5mlGMⅠ(GMI配制方法为：1*最低盐溶液95.6ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.4ml，10％酵母粉汁1ml；其中1*最低盐溶液的配制方法为：K2HPO414g/L，KH2PO46g/L，(NH4)2SO42g/L，柠檬酸三钠1g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，在蒸馏水中依次溶解溶液，在30℃、125rpm振荡培养过夜。第二天取2ml转接到18mlGMⅠ中，37℃、250rpm培养3.5h。再取10ml上一步骤的培养液转接到90mlGMⅡ(GMII配制方法为：1*最低盐溶液96.98ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.08ml，10％酵母粉汁0.04ml，1MMgCl20.25ml，1MCaCl20.05ml中，37℃、125rpm培养90min后，5000g、10min离心收集菌体。用10ml原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后在0.5ml感受态中加入适量DNA于37℃、200rpm振荡培养30min后涂板，再在37℃培养过夜，次日检查和验证转化子。
实施例2利用易错PCR方法构建碱性蛋白酶突变体文库
2.1易错PCR
利用易错PCR的技术在体外向克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)的碱性蛋白酶aprE基因中引入核苷酸突变，易错PCR的反应条件为：10×PCRBuffer(不含MgCI2)5μL，dCTP(25mmol/L)2μL，dTTP(25mmol/L)2μL，dGTP(10mmol/L)1μL，dATP(10mmol/L)1μL，F(10pmol/μL)1μL，R(10pmol/μL)1μL，Mg2+(20mM)14μL，Mn2+(3mM)1.5μL，pQC670.5μL，TaqDNApolymerase(2.5U)1μL，ddH2O20μL。
引物5：5’-tagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaat-3’
引物6：5’-atttttcttttgcttcttcagcagccgatgcgatcgatgaacta-3’
以引物5及引物6分别为上游引物和下游引物，扩增条件为：94℃10min；94℃60s，58℃60s，72℃2min，30个循环；72℃10min。利用E.Z.N.A.GelExtractionKit回收PCR扩增产物。
2.2含突变体表达载体构建
以pQC67质粒为模板，利用引物1和引物6进行PCR扩增，获得载体基因序列。扩增条件为：98℃10min；98℃10s，55℃20s，72℃3min，30个循环；72℃10min。利用E.Z.N.A.GelExtractionKit回收PCR扩增产物。
将aprE基因片段和载体片段通过重叠延伸PCR形成多聚体，扩增体系如下：5×PhusionHFBuffer10μL，2.5mMdNTPs8μL，Insertgene(aprE片段)4μL，Linearizedvector(pQC67)6μL，PhusionDNAPolymerase1μL，ddH2O21μL。扩增条件为98℃10min；98℃10s，72℃3min，20个循环；98℃10s，72℃6min，15个循环；72℃10min。
将多聚体转化Bacillussubtilis1A751宿主菌，得到阳性转化子，即为能表达碱性蛋白酶突变体的重组菌株。同时再以突变体为模板，进行多轮易错PCR，构建更多碱性蛋白酶突变体文库。
实施例3碱性蛋白酶突变体的筛选
3.196孔板初筛
将实施例2获得的表达碱性蛋白酶突变体的重组菌株分别接种于若干2mL圆底96孔板加入600μL种子培养基(酵母浸粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，K2HPO41.8％，卡纳霉素25μg/mL)中，34℃、210rpm振荡培养8h；以5％转接量接种至96孔板产酶培养基(酵母粉1～2％，豆饼粉2～5％，麦芽糊精5～10％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl20.1～0.5％，MgSO40.1～0.5％，K2HPO40.5～2％)中，34℃、250rpm振荡培养36h；采用FreedomEVO200-8MCA96高通量微生物筛选工作站(购自瑞士Tecan公司)进行酶活测定，同时，接种枯草芽孢杆菌BS作为对照。最终申请人共筛选到12株在中性pH范围(即pH7-9)内发酵液酶活力显著高于枯草芽孢杆菌BS的菌株，并将其分别命名为枯草芽孢杆菌BS-1，BS-2，……，BS-12。
3.2摇瓶发酵
将上述筛选到的12株菌株(BS-1，BS-2，……，BS-12)和对照菌枯草芽孢杆菌BS，分别接种于50mL种子培养基(酵母浸粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，K2HPO41.8％，卡纳霉素25μg/mL)中，34℃、210rpm振荡培养8h。然后分别取2.5mL发酵液接种到50mL发酵培养基(酵母粉1～2％，豆饼粉2～5％，麦芽糊精5～10％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl20.1～0.5％，MgSO40.1～0.5％，K2HPO40.5～2％)中，34℃、250rpm振荡培养72h；离心取上清液。
3.3酶活测定
采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T25327-2009)，在pH7.0条件下，分别检测上述12株菌株(BS-1，BS-2，……，BS-12)和对照菌枯草芽孢杆菌BS发酵上清液的碱性蛋白酶酶活，其中酶活水平最高的菌株分别为枯草芽孢杆菌BS-4，BS-5，BS-10，其发酵上清液酶活分别为4549U/mL、9073U/mL和7333U/mL，与对照菌枯草芽孢杆菌BS相比，分别提高了42％、180％和130％。
实施例4碱性蛋白酶突变体序列的确定
利用TIANGEN公司的TIANrepRapidMiniPlasmidKit试剂盒，分别提取枯草芽孢杆菌BS-4，BS-5，BS-10中的质粒；然后利用实施例1中所述引物3和引物4，由华大基因公司对上述质粒分别进行基因测序。
测序结果显示：枯草芽孢杆菌BS-4中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO:4，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:3，申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M1；枯草芽孢杆菌BS-5中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO:6，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:5，申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M2；枯草芽孢杆菌BS-10中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO:8，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:7，申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M3。
进一步，申请人将上述获得的碱性蛋白酶aprE-M1、aprE-M2和aprE-M3的氨基酸序列分别与野生型碱性蛋白酶aprE的氨基酸序列SEQIDNO:1进行对比分析。结果显示：与野生型碱性蛋白酶aprE相比，碱性蛋白酶aprE-M1的第103位氨基酸由Ser突变为Glu；碱性蛋白酶aprE-M2的第103位氨基酸由Ser突变为Glu，第132位氨基酸由Thr突变为Asp；碱性蛋白酶aprE-M3的第103位氨基酸由Ser突变为Glu，第207位氨基酸由Thr突变为Arg。
实施例5碱性蛋白酶突变体酶学性质分析
采用pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0的缓冲液稀释上述枯草芽孢杆菌BS-4(重组表达碱性蛋白酶突变体aprE-M1)，BS-5(重组表达碱性蛋白酶突变体aprE-M2)、BS-10(重组表达碱性蛋白酶突变体aprE-M3)和对照菌枯草芽孢杆菌BS(重组表达野生型碱性蛋白酶aprE)的发酵上清液，在30℃条件下分别检测其碱性蛋白酶酶活，以每株菌发酵上清液的最高酶活计100％，分别计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图2所示，野生型碱性蛋白酶aprE的最适pH为11.5，而本发明获得的碱性蛋白酶突变体aprE-M1、aprE-M2和aprE-M3的最适pH分别为10.5，9.0和10.0，且在pH7.0-9.0的范围内相对酶活显著高于野生型碱性蛋白酶，其中又以碱性蛋白酶突变体aprE-M2的相对酶活最高，取得了意料不到的技术效果。
综上，本发明运用易错PCR技术获得了三个碱性蛋白酶突变体，与野生型相比，突变体的最适pH普遍向中性条件偏移，且在pH7.0-9.0的范围酶活得到显著提高，可广泛应用于中性洗涤剂中，有利于减少洗涤剂对皮肤、衣物等的损伤，市场前景广泛。

Claims (10)

1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:3。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQIDNO:4。
4.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体是权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体的第132位氨基酸由Thr突变为Asp，其氨基酸序列为SEQIDNO:5。
5.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体是权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体的第207位氨基酸由Thr突变为Arg，其氨基酸序列为SEQIDNO:7。
6.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求4或5所述的碱性蛋白酶突变体。
7.如权利要求6所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQIDNO:6或SEQIDNO:8。
8.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有编码权利要求1、4或5所述的碱性蛋白酶突变体的基因。
9.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为转化/转染有权利要求8所述的重组表达载体的宿主细胞。
10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
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