CN117535272A - 稳定性提高的蛋白酶变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开利用易错PCR对野生型碱性蛋白酶进行突变，并通过高通量筛选，获得多个碱性蛋白酶变体，其相较于野生型碱性蛋白酶，有增加的耐热性；在洗衣液组分中稳定性显著增加，且具有较好的血渍清除效果，有良好的市场应用前景和工业价值。此外，本公开还提供了含有此类变体的洗涤剂组合物及其在清洁领域的应用。
Description
技术领域
本公开涉及基因工程和酶工程领域，特别是涉及一种稳定性增加的蛋白酶变体、编码基因及其应用。
发明背景
碱性蛋白酶属丝氨酸蛋白水解酶，是工业酶的主要类群之一，其可利用经典的Ser/His/Asp催化三元结构来破坏肽键，广泛存在于动物、植物和微生物中。由于微生物物种的多样性及化学多样性，微生物来源的碱性蛋白酶被广泛应用于丝绸、制革和食品工业、医药配方、银回收、洗涤剂和废物处理中等领域。
碱性蛋白酶是较早在洗涤制品中应用的工业酶，其可将血、奶、蛋、果汁、汗液、咖啡等污渍中的蛋白大分子物质降解，使此类污渍容易被洗去。目前越来越多的清洗剂中开始使用生物酶制剂，如洗衣液、洗衣粉、洗衣凝珠、工业洗涤剂、医疗器械清洗剂等，所用到的生物酶除蛋白酶外，还包括淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等其它酶类。由于蛋白酶在液体水环境中会分解其它酶类蛋白，也会分解自身(或称自溶)，导致洗涤剂整体稳定性降低；虽然添加稳定剂可以提升蛋白酶在洗衣液中的稳定性，但是使用稳定剂不仅会增加洗衣液的生产成本，而且对人体的健康和环境存在潜在的风险；因此，开发在洗衣液中稳定性更好的碱性蛋白酶是行业迫切需要解决的技术问题。
目前，改善蛋白酶酶学性质的方法主要是合理设计和定向进化。与定向进化相比，合理设计是构建小而有效的突变库以改善酶特性的有效方法。然而，使用理性设计也有一些缺点。它依赖于可靠的蛋白质结构和结构-功能关系，这使得它通常不能令人满意地改善酶的性质。与合理设计相比，定向进化是一种更现实的方法，通过使用容易出错的PCR或DNA改组构建包含随机突变的大型突变库来增强酶的酶性质，从而允许在没有详细结构信息的情况下通过有效筛选和选择突变文库来鉴定具有期望性能的突变体。
发明内容
第一方面，本公开涉及的蛋白酶变体与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9所示的序列相比，具有至少97％、至少98％、至少99.0％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或更高的序列一致性。
在一些实施方案中，所述变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施方案中，所述变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在一些实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：3所示的序列相比，具有至少99.0％的序列一致性，并且还包含至少一个选自D160N、T187I、A244N、A324N、N328F氨基酸取代组，其位置编号基于SEQ ID NO：1。
在一些实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：3所示的序列相比，具有至少99.0％的序列一致性，并且还包含A324N的氨基酸取代，其位置编号基于SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，所述变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在一些实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：3所示的序列相比，具有至少99.0％的序列一致性，并且还包含T187I、A244N及N328F的氨基酸取代，其位置编号基于SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，所述变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在一些实施例中，所述变体具有改善的稳定性，其中，改善的稳定性包括但不限于：化学稳定性、氧化稳定性、pH稳定性、蛋白水解稳定性、底物稳定性、底物稳定性、热稳定性、储藏稳定性等。
第二方面，本公开还涉及多核苷酸序列，包含编码上述任一变体的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包含信号肽编码序列，所述信号肽是指可参与成熟蛋白或前体蛋白的分泌或直接转运的氨基酸残基，可选内源性或外源性信号序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包含前导肽编码序列，所述前导肽序列是指位于信号肽与成熟多肽序列间的氨基酸序列，将其切除后能获得有活性的蛋白酶。
在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包含标签肽编码序列，所述的标签序列可用于蛋白质的纯化和示踪等。
在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包括标信号肽序列、前导肽编码序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包括标签肽编码序列、前导肽编码序列及信号肽编码序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO：2、4、6、8、或10有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中所述多核苷酸序列为SEQ ID NO：4、6、8、或10。
第三方面，本公开还涉及基因工程菌，所述基因工程菌包含编码本公开碱性蛋白酶变体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因工程菌可选革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，所述基因工程菌为芽孢杆菌，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞；优选为枯草芽孢杆菌。
第四方面，本公开还涉及制备上述任一碱性蛋白酶变体的方法，包括：(1)培养如本公开所述的基因工程菌；(2)回收变体。
第五方面，本公开还涉及含有本公开至少一种碱性蛋白酶变体的洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，所述组合物中还包含一种或多种其他的酶，包括但不限于淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、单宁酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、卡拉胶酶、过水解酶、氧化酶、氧化还原酶、脂肪酶、不同于本公开的蛋白酶等。
在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种洗涤剂组分，可为本领域中已知的用于洗涤的任意组分，包括但不限于表面活性剂、水溶助剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、污垢释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。
在一些实施方案中，所述组合物中还包含至少一种除本公开蛋白酶外的酶及至少一种洗涤剂组分。
在一些实施方案中，所述组合物中的蛋白酶与野生型酶(SEQ ID NO：1)相比，具有增强的稳定性，特别是在室温条件下储存3天或更多天、4天或更多天、7天或更多天、10天或更多天、12天或更多天、14天或更多天、21天或更多天或28天或更多天时。
第六方面，本公开还涉及上述碱性蛋白酶变体或洗涤剂组合物在清洁过程中的应用。
其他实施方案：
1、碱性蛋白酶变体，与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9所示的序列相比，具有至少99.0％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或更高的序列一致性。
2、如第1项中所述的变体，与SEQ ID NO：3所示序列相比，具有至少99.0％的序列一致性，并且还包含至少一个选自D160N、T187I、A244N、A324N、N328F氨基酸取代组，其位置编号基于SEQ ID NO：1。
3、如第2项中所述的变体，包含任一选自A324N、D160N+T187I+A244N+N328F氨基酸取代组。
4、如第1项中所述的变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：9所示。
5、编码如第1-4项中任一项所述变体的多核苷酸序列。
6、如第5项中所述的多核苷酸序列，还包含前导肽编码序列及信号肽编码序列。
7、如第5项中所述的多核苷酸序列，其如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示。
8、基因工程菌，包含如第5-7项中任一项所述的多核苷酸序列，所述基因工程菌可选革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，更优选为枯草芽孢杆菌。
9、制备如第1-4项中任一项所述变体的方法，包括：(1)培养如第8项中所述的基因工程菌；(2)回收变体。
10、洗涤剂组合物，包含至少一种如第1-4项中任一项所述的碱性蛋白酶变体。
11、如第10项中所述的组合物，组合物中还包含：
1)一种或多种其他的酶；
和/或2)一种或多种洗涤剂组分；
12、如第1-4项中任一项所述的变体或如第10或11项中任一项所述的洗涤剂组合物在清洁过程中的应用。
有益效果
本公开通过构建突变体文库和定向筛选的方法，对源自Aliidiomarina maris的碱性蛋白酶变体进行修饰，筛选得到稳定性提高的变体：AMAPR1、AMAPR2、AMAPR3、AMAPR4，其相较于野生型碱性蛋白酶AMAPR0，具有更高的热稳定性，且在国标洗衣液中储藏稳定性显著提升，并能达到很好的污渍去除效果，在洗涤领域有良好的应用潜力。
附图简述
图1是本公开蛋白酶及其变体的酶活残留情况：图1A是在60℃孵育24h后的酶活残留率；图1B是在常温条件下储存4周后的酶活残留率；
图2是本公开蛋白酶及其变体在30L发酵罐中的发酵数据；
图3是含本公开蛋白酶及其变体的洗涤液对血渍的清除情况：图3A是用测色仪对去污值的检测结果；图3B是对去污效果的目视结果；
其中，图中变体名称与氨基酸序列、核苷酸序列对应关系见下表。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步说明本公开的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本公开的示例，并不代表或限制本公开的保护范围。本公开的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。
LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L。
LB固体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、琼脂粉16g/L。
发酵培养基：蛋白胨20g/L、精致豆粕粉10g/L、葡萄糖40g/L、KH2PO43g/L、Na2HPO46g/L、MgSO40.3 g/L、卡那霉素50mg/L。
本公开实施例中碱性蛋白酶的酶活检测方法如下：
(1)取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL，pH 10.0的50mM硼酸溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的酪蛋白(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)作为底物，混匀后分别于40℃下反应10min；加入200μL，400mM的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温12000r/min，离心2min。取上清200μL，加入1mL 5％(w/v)的Na2CO3和200μL的福林酚试剂，混匀后40℃下显色20min，使用10mm石英比色皿于680nm下测定清液吸光值；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上。
(2)酶活的定义：在40℃，PH 10.5条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为1个酶活单位，以U表示。
实施例1：碱性蛋白酶易错PCR突变体的构建
1、重组质粒pP43NMK-AMAPR0与重组菌的构建
(1)化学合成碱性蛋白酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO：2所示)；并使用Clonexpress IIOne Step Cloning Kit(Vazyme)将获得的基因与pP43NMK质粒(丰晖生物)进行连接，得到连接产物。
(2)将连接产物转化大肠杆菌JM109(Takara)，将转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养12～14h，在LB固体培养基上挑取4个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养12h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-AMAPR0。
2、碱性蛋白酶易错PCR突变体的构建
(1)根据蛋白酶的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示)，分别设计突变引物，对携带蛋白酶基因的重组质粒pP43NMK-AMAPR0进行易错PCR扩增，以扩增带有质粒载体同源臂的碱性蛋白酶成熟肽片段，同时对携带角蛋白酶基因的载体质粒pP43NMK进行扩增，高保真扩增质粒pP43NMK及原始碱性蛋白酶信号肽和前肽。
其中，易错PCR扩增原始碱性蛋白酶成熟肽所用引物如下：
正向引物：
5'-GGAAGAAGATCATAAAGCGGAAGCGTATGCACAAACAGTTCCGTATG GCATTCCG-3'
反向引物：
5'-ATACGCTTCCGCTTTATGATCTTCTTCCACATACGCGATTG-3'
PCR扩增质粒pP43NMK及原始酶信号肽和前肽所用引物如下：
正向引物：5'-TGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGTC-3'
反向引物：5'-CTTTATGATCTTCTTCCACATACGCGATTG-3'
(2)易错PCR反应使用GeneMorph II Random Mutagenesis Kit(Stratagene)，反应体系为：10×Mutazyme II reaction buffer 5μL，Mutazyme II DNA polymerase 1μL，dNTP(40mM)1μL，1ng/μL模板DNA 1μL，10μM正向引物2μL，10μM反向引物2μL，加入双蒸水至50μL；
易错PCR扩增条件为：95℃预变性3min；随后进行95℃30s，61℃30s，72℃90s，30个循环；最后72℃10min；
PCR反应体系为：2×Phanta Max Master Mix 25μL(vazyme)，10μM正向引物2μL，10μM反向引物2μL，1ng/μL模板DNA 1μL，dNTP(40mM)1μL，，加入双蒸水至50μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；随后进行95℃15s，61℃15s，72℃5min，30个循环；最后72℃10min；
PCR扩增产物均用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向50μL扩增产物中加入1μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1h，随后于70℃条件下灭活5min；得到DpnI消化产物。
(3)Dpn I消化产物使用Fast pure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme)进行纯化，向50μL消化产物中加入150μL Buffer GDP，枪头吹吸进行混匀后全部移入吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃去吸附柱下方管内废液，随后向吸附柱中加入700μL Buffer GW，12000rpm离心1min，弃去吸附柱下方管内废液，重复两次，随后用40μL双蒸水洗脱纯化产物；
(4)将原始碱性蛋白酶成熟肽片段的纯化产物与质粒pP43NMK、原始酶信号肽片段和原始碱性蛋白酶前肽片段的纯化产物通过同源多聚PCR反应连接，形成线性多聚体连接产物；
其中同源多聚连接PCR反应体系为：2×Phanta Max Master Mix 25μL(Vazyme)，质粒pP43NMK、原始酶信号肽片段和原始碱性蛋白酶前肽片段2μL(15ng/μL)，2μL原始碱性蛋白酶成熟肽片段(250ng/μL)，加入双蒸水至50μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；随后进行95℃15s，61℃15s，72℃10min，30个循环；最后72℃10min；
(5)将线性多聚反应后的连接产物转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞(详见CN102492645A)，转化产物涂布于卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB固体培养基，于37℃培养8～10h。
实施例2：突变体的筛选
(1)分别将实施例1获得的大量单菌落接种到含有发酵培养基的96深孔板中，在37℃、220rpm培养24h，分别得到含有野生型碱性蛋白酶及其变体的发酵液；
(2)分别将步骤(1)获得的发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min后，分别获得发酵上清液；
(3)分别将步骤(2)得到的发酵上清液于40℃反应条件下，检测碱性蛋白酶酶活，保留酶活高于野生型碱性蛋白酶酶活相近的突变重组菌。
(4)将步骤(3)筛选出的重组菌株分别接种至50mL添加卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB液体培养基中，以含有野生型碱性蛋白酶的重组菌株为对照，37℃、220rpm培养24h，分别得到发酵液。将发酵液于12000rpm条件下离心2min，后于40℃反应条件检测发酵上清液中的碱性蛋白酶酶活。
检测结果见表1。
表1发酵上清液中野生型碱性蛋白酶及其变体的酶活
(5)将步骤(4)收集的发酵上清液用超滤管浓缩到同一酶活(1wU/mL)条件后，分别在国标洗衣液中60℃孵育24h和常温条件下储存4周，然后检测碱性蛋白酶的剩余活性。
检测结果见图1，在洗衣液中60℃孵育24h后，碱性蛋白酶变体的残留活性均高于野生型蛋白酶；其中，AMAPR3变体的残留活性比野生型的AMAPR0高了25％(图1A)。在标准配方洗衣液(GB/13174)中室温条件下储存4周，AMAPR3变体的残留活性比未突变的蛋白高了30.5％(图1B)。
实施例3：蛋白酶变体在30L发酵罐中发酵和制备
将表达上述实施例中的蛋白酶突变体AMAPR0、AMAPR1、AMAPR2、AMAPR3和AMAPR4的基因工程菌分别划线于含有卡那霉素抗性的(终浓度为50μg/mL)LB平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在含有卡那霉素抗性的(终浓度为50μg/mL)LB平板上划线培养，如此活化三代得到的重组枯草芽孢杆菌菌落接种于50mL含有卡那霉素终浓度为50μg/mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养24h。以2％的接种量接种到1L含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD 600为5左右，用作种子液接种发酵罐。
发酵生产工艺：发酵培养基(pH 7.0)、温度37℃、搅拌速率600rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上。发酵过程pH控制在7.0发酵24h后开始测定酶活力，待发酵结束后(一般48h)，发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液经喷塔喷干成粉制剂，用于应用测试。检测结果见图2。
实施例4：蛋白酶对血渍污布的去污实验
(1)在标准配方洗衣液(GB/13174)中添加20000U/mL的AMAPR3，配置成含有碱性蛋白酶的混合洗衣液，并于室温下存放4周时间；
(2)利用步骤(1)中得到的混合洗衣液以及不添加蛋白酶的国标洗衣液对自制的血渍污布进行洗涤实验，处理条件如下：将带有血渍的污布放在含有碱性蛋白酶的混合洗衣液中浸泡4-6h，浸泡结束后放在室温条件下晾干；
(3)利用测色仪对步骤(2)中洗涤的污布进行去污值测试，用来评测血渍污布的洗涤效果。
洗涤结果如图3A所示，添加碱性蛋白酶突变体AMAPR3的国标洗衣液的去污响应值(去污值是洗涤剂去污力数字化表征，以试片洗涤前后的白度差表示)显著增加；图3B显示，含有AMAPR3变体的洗涤剂有明显的血渍去除效果。
Claims (12)
1.碱性蛋白酶变体，与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9所示的序列相比，具有至少99.0％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或更高的序列一致性。
2.如权利要求1所述的变体，与SEQ ID NO：3所示序列相比，具有至少99.0％的序列一致性，并且还包含至少一个选自D160N、T187I、A244N、A324N、N328F氨基酸取代组，其位置编号基于SEQ ID NO：1。
3.如权利要求2所述的变体，包含任一选自A324N、D160N+T187I+A244N+N328F氨基酸取代组。
4.如权利要求1所述的变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示。
5.编码如权利要求1-4中任一项所述变体的多核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的多核苷酸序列，还包含前导肽编码序列及信号肽编码序列。
7.如权利要求5所述的多核苷酸序列，其如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示。
8.基因工程菌，包含如权利要求5-7任一项所述的多核苷酸序列，所述基因工程菌可选革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，更优选为枯草芽孢杆菌。
9.制备如权利要求1-4中任一项所述变体的方法，包括：(1)培养如权利要求8所述的基因工程菌；(2)回收变体。
10.洗涤剂组合物，包含至少一种如权利要求1-4中任一项所述的碱性蛋白酶变体。
11.如权利要求10所述的组合物，组合物中还包含：
1)一种或多种其他的酶；
和/或2)一种或多种洗涤剂组分。
12.如权利要求1-4中任一项所述的变体或如权利要求10或11中任一项所述的洗涤剂组合物在清洁过程中的应用。
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