CN116286565A - 一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents
一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种蛋白的生产方法，以及高效表达碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌工程菌株。申请人首先将人工合成的碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌宿主中过表达，构建得到重组表达菌株；然后以该菌株为出发菌进行紫外诱变，筛选获得一株能大幅度提高碱性蛋白酶表达量的突变菌，保藏编号为CCTCC NO：M20221029。所述突变菌株可以广泛应用于碱性蛋白酶的生产，有利于降低该酶的生产成本，加快碱性蛋白酶的推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
碱性蛋白酶（Alkaline Protease）属丝氨酸蛋白水解酶类，丝氨酸蛋白水解酶类是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶（EC3.4.21），主要有枯草杆菌蛋白酶类（EC3.4.21.62），这类酶属于MEROPS分类方案的S8肽酶家族，肽酶S8家族的成员在其氨基酸序列中具有酶催化活性位点为Asp、His和Ser 的催化三联体。碱性蛋白酶在中性至碱性条件下水解蛋白质肽键、酯键和酰胺键，其最适作用pH一般为8~11。该酶种最早在猪的胰脏中发现。碱性蛋白酶广泛存在于微生物、植物和动物中。碱性蛋白酶，由于具有较强的分解能力，因此被广泛应用包括洗涤剂、饲料、药物、皮革、丝绸、大豆加工、酿酒厂、肉类嫩化、废物管理、摄影和诊断等轻工业领域。
碱性蛋白酶的年产量占全球酶生产量的50%，到2020年年底预估产值为63亿美元。超过三分之二的碱性蛋白酶应用于洗涤工业，在液体洗涤剂中的碱性蛋白酶几乎都是由天然的芽孢杆菌类微生物及其变体生产的具有耐碱、耐表面活性剂等性质且有广泛肽键水解选择性的一类丝氨酸蛋白酶。碱性蛋白酶能够水解各类蛋白质污垢，如血液、汗渍、牛奶污渍等，并且能够释放因蛋白质包裹的污垢或因蛋白质加强对基底粘附力的污渍，能够与表面活性剂起到良好的协同去污能力。
1945年瑞士DrJaag等在地衣芽胞杆菌(Bacilus licheniformis)中发现了碱性蛋白酶。不同来源及特性的碱性蛋白酶，呈现出不同的三维结构特征，其中芽孢杆菌属碱性蛋白酶KP-43具有反平行β-桶和α/β折叠结构域以及3钙离子结合位点，且平行β-桶结构域是特异的。此外还具有抗氧化性。而克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶具有α/β单折叠结构域，其催化中心的3个氨基酸残基形成了其特有的盐桥结构。大多数芽孢杆菌产碱性蛋白酶的活性中心含有丝氨酸，属于丝氨酸蛋白酶。当遇到作用于丝氨酸的试剂二异丙基氟磷酸（DFP）便失活，这是碱性蛋白酶的一个特征。碱性蛋白酶需要有金属离子的激活，必须的金属离子有Mg2+、Zn2+ 、Fe2+等，此外Ca2+对芽孢杆菌产碱性蛋白酶有稳定作用。
目前。主要产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌及研究对象有：地衣芽孢杆菌（Bacilus licheniformis）、短小芽孢杆菌（Bacilus pumilus）、枯草芽孢杆菌（Bacilus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacilus amyloliquedfaciens）、嗜碱性芽孢杆菌（Bacilus Sp）和克劳氏芽孢杆菌（Bacilus clausii）。但由于菌株自身产酶能力有有限，导致发酵酶活水平不高，产品成本较高，限制了其大规模应用。构建或者筛选碱性蛋白酶高产菌株，成为了目前研究的热点之一。
Degering等研究了220种来源于地衣芽孢杆菌的信号肽和173种来源于枯草芽孢杆菌的信号肽，来源于地衣芽孢杆菌几丁质酶的信号肽dBli00338可以使碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌TEB1020中提高6-7倍，在地衣芽孢杆菌H402中的分泌表达量提高7-8倍；此外，来源于枯草芽孢杆菌的信号肽sYbdN也可大幅度提高碱性蛋白酶的分泌表达量。产碱性蛋白酶的短小芽孢杆菌DL12经过紫外诱变后，产酶能力有了明显的增加。王雨婷利用透明圈法从玉米蛋白粉平板筛选到一株枯草芽孢杆菌X1-1菌株，其在玉米蛋白粉基础发酵培养基中能够同时分泌3种蛋白酶，其中碱性蛋白酶活力为105 U/ml，且X1-1发酵玉米蛋白粉粗酶液水解的玉米蛋白粉的味道得到了明显的改善。苏悟等筛选得到的产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌接种到水酶法提取油茶籽油的工艺中，使其发酵产碱性蛋白酶，并通过产酶条件优化提高蛋白酶产量，枯草芽孢杆菌利用上述工艺产碱性蛋白酶活力可达34.8 U/ml。
由于目前从自然界分离到的天然菌株，分泌碱性蛋白酶的能力很低，不能满足工业生产的需求。因此目前主要通过基因工程的手段克隆性能优良的碱性蛋白酶基因并将其导入到合适的宿主体内得到优良的重组菌。例如，2007年，Wei-Hua Chu 在Bacillus sp.APP1中成功表达了碱性蛋白酶，其活性为2,560 U/ ml。Qingshan Mo等在Bacillusalcalophilus在表达碱性蛋白酶，活性达到了61900 ± 0.3400 U/ml。虽然目前有一些报道，使用基因工程的方法进行异源表达，碱性蛋白酶的没有大幅度提升，但是与国外巨头碱性蛋白酶生产厂家相比，表达的碱性蛋白酶产量还是存在很大差距。因此构建具有自主知识产权的碱性蛋白酶高产菌株，减低生产成本，实现工业化生产，迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，并提供了其在碱性蛋白酶生产中的应用。申请人首先构建得到重组表达碱性蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌菌株，然后进一步对其进行紫外诱变，筛选获得碱性蛋白酶产量显著提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进碱性蛋白酶的广泛应用。
本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其携带有表达碱性蛋白酶的重组质粒。
所述碱性蛋白酶基因序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明一方面提供了一种突变菌株枯草芽孢杆菌JKX202（Bacillus subtilis JKX202），已于2022年7月5日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M20221029。
本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在生产碱性蛋白酶中的应用。
本发明还提供了一种生产碱性蛋白酶的方法，是以所述枯草芽孢杆菌为发酵菌株。
本发明还提供了一种碱性蛋白酶，是由所述枯草芽孢杆菌发酵获得的。
有益效果
本发明首先将碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌宿主中表达，构建得到重组表达该酶的工程菌株枯草芽孢杆菌JKX201。该菌株摇瓶发酵和15L罐发酵上清液中碱性蛋白酶活分别达到10618 U/mL和96882 U/mL。
为了提高碱性蛋白酶的产量，申请人以枯草芽孢杆菌JKX201为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌枯草芽孢杆菌JKX202。该突变菌株摇瓶发酵上清液中碱性蛋白酶活高达16431 U/mL，比出发菌提高的54.73%；其15 L罐发酵粗酶液中碱性蛋白酶酶活高达158661 U/mL，比出发菌提高了63.9%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于碱性蛋白酶的生产，有利于降低碱性蛋白酶的生产成本，促进该酶的应用。
附图说明
图1为pJKX201质粒图谱；
图2为枯草芽孢杆菌JKX201发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图；
生物材料保藏信息
突变菌株枯草芽孢杆菌JKX202（Bacillus subtilis JKX202），保藏编号为CCTCCNO: M20221029，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏时间为2022年7月5日。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
本发明实施例中所涉及的培养基的配方如下：
GM I配制方法为：1×最低盐溶液96 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母粉汁1 mL；其中1×最低盐溶液的配制方法为：K2HPO4 14 g/L，KH2PO4 6 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，柠檬酸三钠1 g/L，MgSO4•7H2O 0.2 g/L，在蒸馏水中依次溶解；
GM II配制方法为：1×最低盐溶液97 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.08mL，10%酵母粉汁0.04 mL，1 M MgCl2 0.25 mL，1 M CaCl2 0.05 mL；
LB平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，琼脂粉1.5%；
脱脂奶粉平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，脱脂奶粉1%，琼脂粉1.5%；
种子培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4 1.8%，氯霉素5 μg/mL；
发酵培养基：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl20.1~0.5%，MgSO4 0.1~0.5%，K2HPO4 0.5~2%。
实施例1 碱性蛋白酶整合表达质粒pJKX201构建
碱性蛋白酶整合表达质粒pJKX201图谱如图1所示，序列由合成公司合成，具体操作如下：
合成片段1（F1）、片段2（F2）、片段3（F3），其中片段1包含P43启动子、SacB信号肽序列、碱性蛋白酶基因以及氨苄青霉素抗性基因表达盒等组成元件，大小为2.6kb，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3；片段2包含氨苄青霉素抗性基因表达盒卡、大肠杆菌复制子（ColE1rep）等组成元件，大小为2.5kb，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4；片段3包含氯霉素抗性基因（cm），大小为1.8kb，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5。其中碱性蛋白酶核苷酸序列为为SEQ IDNO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
利用NEB phusion 聚合酶，以F1为模板，用引物assf1-F/assf1-Rv进行扩增，PCR条件为：98℃ 2min；98℃ 10s；58℃ 20s，72℃ 70s，30个循环；72℃ 5min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为f1。
利用NEB phusion 聚合酶，以F2为模板，用引物assf2-F/assf21-Rv进行扩增，PCR条件为：98℃ 2min；98℃ 10s；58℃ 20s，72℃ 70s，30个循环；72℃ 5min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为f2。
利用NEB phusion 聚合酶，以F3为模板，用引物assf3-F/assf3-Rv进行扩增，PCR条件为：98℃ 2min；984℃ 10s；58℃ 20s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为f3。
所用引物引物名称及引物序列如下：
assf1-F：ACGAGCACGAGAGCAAAACCCCCCTTTGCTGAGG
assf1-Rv：ATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATA
assf2-F：ATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTA
assf2-Rv：CGCCTTCTTCTGTGTCATCAAGGTTTAATTTTTTA
assf3-F：AATTAAACCTTGATGACACAGAAGAAGGCGATTTG
assf3-Rv：GCAAAGGGGGGTTTTGCTCTCGTGCTCGTTTAAAAT
利用NEB Gbison assembly试剂盒，20uL反应体系中f1、f2、f3的摩尔数比为1:1:1， 50℃，反应60min；取10uL反应液转化大肠杆菌，然后将大肠杆菌均匀涂布于含50 ug/ml氨苄青霉素的LB转化平板，37℃过夜培养。
从上述的转化平板上挑选10个转化子，采用omega公司的质粒提取试剂盒分别提取质粒，送往金唯智生物科技有限公司进行测序分析。将得到的符合预期序列的质粒，将其命名为pJKX201。
实施例2 重组表达碱性蛋白酶的基因工程菌株的构建及发酵验证
2.1 宿主菌感受态细胞制备
（1）将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）宿主划线LB平板，37℃培养过夜；
（2）第二天挑取1个单菌落接种到5 mL GMⅠ溶液，在30℃、125 rpm振荡培养过夜；
（3）第三天取1 mL过夜培养液转接到9 mL GMⅠ中，37℃、250 rpm培养3.5 h；
（4）再取5 mL上一步骤的培养液转接到45 mL GMⅡ中，37℃、125 rpm培养90 min后，5000 g、10 min离心收集菌体。用5 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。
2.2 碱性蛋白酶整合菌株构建
（1）在0.2 mL枯草芽孢杆菌感受态细胞中加入约1 μg pJKX201重组质粒，37℃、200 rpm振荡培养1 h后涂布含5 μg/mL氯霉素的脱脂奶粉平板，37℃培养过夜；
（2）次日选取10个透明圈显著的单菌落在含5 μg/mL氯霉素的脱脂奶粉平板上划线纯化，然后每个平板选取透明圈显著的单菌落接种于20 mL种子培养基中，37℃、220 rpm振荡培养8~9 h。然后分别取2.5 mL种子培养物接种到50 mL发酵培养基中，34℃、250rpm振荡培养72 h；4000 rpm离心10 min取上清液；采用中华人民共和国国家标准碱性蛋白酶活力的测定方法（GB 1886.174-2016）分别测定上述菌株发酵上清液的碱性蛋白酶酶活。
结果显示：其中一株重组菌发酵上清液中碱性蛋白酶酶活高达10618 U/mL，显著高于另外9株重组菌。申请人将该菌株命名为枯草芽孢杆菌JKX201（Bacillus subtilisJKX201）。将该菌株发酵上清液进行SDS-PAGE电泳分析结果，如图2所,，可以看到明显的碱性蛋白酶表达条带。
2.3 枯草芽孢杆菌JKX201 15L罐发酵验证
将枯草芽孢杆菌JKX201接种于含500 mL种子培养基中，37℃、220 rpm振荡培养约12h。
将种子液全部转入15 L发酵罐（发酵罐培养基成分：玉米淀粉3%，葡萄糖1%，豆饼粉3%，麸皮3%，Na2HPO4 0.78%，KH2PO4 0.05%，发酵罐消后体积8 L）；温度控制37℃，发酵初始pH 7.2，发酵过程中氨水控制pH不低于7.0；风量1~1.5 vvm，转速300~1000 rpm，控制发酵过程中DO不低于10%；3~4 h后开始流加50%葡萄糖，流加速度3 g/L·h；发酵25~30 h，DO、pH均回升后停止培养。收集发酵液上清，采用中华人民共和国国家标准碱性蛋白酶活力的测定方法（GB 1886.174-2016）测定发酵上清液的碱性蛋白酶酶活。
结果显示，枯草芽孢杆菌JKX201菌株发酵上清液酶活高达96882 U/mL。从而说明本发明构建的重组工程菌株枯草芽孢杆菌JKX201能高效表达外源碱性蛋白酶基因ap。
实施例3 碱性蛋白酶高产菌株的诱变筛选
紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。
申请人以实施例2构建得到的枯草芽孢杆菌JKX201为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其碱性蛋白酶的产量。
4.1菌悬液制备
将出发菌枯草芽孢杆菌JKX201在LB斜面上划线接种，37℃培养24 h；加入5 mL0.85%的无菌生理盐水，将斜面上的菌体全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中，涡旋震荡10 min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15 mL离心管，6000 rpm离心3min收集菌体，取上清，用10 mL生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至108个/mL。
4.2 紫外诱变处理及诱变剂量确定
打开9 W紫外灯开关，预热约30 min；取直径9 cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为108个/mL的菌悬液10 mL，加入一根无菌磁力搅拌转子，打开磁力搅拌器，打开皿盖，在垂直距离为15 cm处，分别搅拌照射0.5 min、1 min、1.5 min、2 min、2.5 min、3 min；盖上平皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30 min。
将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水梯度稀释至10-1~10-6；取10-4、10-5、10-6三个稀释度的菌悬液各100 μL，涂布LB平板，每个稀释度涂布三个平板；以同样的操作，取未经紫外线照射处理的菌液稀释涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置于37℃过夜培养。
统计不同照射时间下每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下长出的单菌落数在30~300个之间，则认为改稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：
菌悬液浓度（CFU/mL）=某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10
按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：
致死率（%）=（1－某剂量处理后的菌悬液浓度/处理前菌悬液浓度）×100%
经计算，不同紫外诱变剂量下枯草芽孢杆菌 JKX201的致死率如表1所示。
表1 枯草芽孢杆菌JKX201紫外诱变致死率
| 时间/min | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 |
| 致死率/% | 85.3 | 95.7 | 98.6 | 99.8 | 99.9 | 99.9 |
从表1可以看出，菌悬液经紫外照射1 min后致死率达到95%以上，因此确定最终诱变时间为1 min。
4.3 脱脂奶粉平板透明圈大小初筛
从紫外诱变1 min的LB平板上挑取菌落，划线培养获得单菌落后点种于脱脂奶粉平板，每组设3个平行，同时以出发菌株作为对照。37℃培养24 h后，选择透明圈直径与菌落直径的比值大于出发菌的单菌落再次纯化，选择纯化后透明圈直径与菌落直径的比值大于出发菌30%以上的单菌落共20个进行摇瓶复筛。
4.4 摇瓶复筛
将上述筛选得到的20株突变菌分别接种于50 mL摇瓶发酵培养基中，37℃，220rpm发酵培养72 h后，离心取上清液，分别测定发酵上清液中的碱性蛋白酶酶活，同时以出发菌株作为对照，选择摇瓶发酵酶活较出发菌株提高15%以上的突变株进行第二轮紫外诱变筛选。
申请人按照上述方法继续进行了8轮紫外诱变筛选，最终获得1株碱性蛋白酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为枯草芽孢杆菌JKX202（Bacillus subtilis JKX202）。该菌株在50 mL摇瓶发酵培养基中，37℃，220 rpm发酵培养72 h后，离心取上清液，上清液碱性蛋白酶酶活高达16431 U/mL，比出发菌提高的54.7%；15 L罐发酵粗酶液中碱性蛋白酶酶活高达158661 U/mL，比出发菌提高了63.9%，取得了意料不到的技术效果。
申请人已于2022年7月5日将所述突变菌株枯草芽孢杆菌JKX202（Bacillus subtilis JKX202）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M20221029。
Claims (5)
1.一种枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌工程菌携带有重组表达碱性蛋白酶基因的表达载体。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO:1，所述碱性蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种枯草芽孢杆菌突变株，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌突变株是以权利要求2所述的枯草芽孢杆菌工程菌为出发菌，通过紫外诱变获得的。
4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌突变株，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌突变株的保藏编号为CCTCC NO: M20221029。
5.权利要求3或4所述的枯草芽孢杆菌突变株在生产碱性蛋白酶中的应用。
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