CN117551638A - 碱性蛋白酶变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种具有热稳定性的碱性蛋白酶变体及其制备方法，所述变体在85℃，处理10min后仍具有至少60％的初始蛋白酶活性，能更好的适用于工业领域；本公开还涉及含有上述变体的洗涤剂组合物，其中，蛋白酶在洗涤剂组分中的稳定性显著提升，在不含蛋白酶抑制剂的洗涤剂中，37℃处理4周后仍然保持至少80％的初始蛋白酶活性。此外，本公开还涉及上述蛋白酶及其含酶组合物在洗涤或清洁领域的用途。
Description
技术领域
本公开涉及基因工程和酶工程领域，特别是涉及一种新型的碱性蛋白酶变体及其应用。
发明背景
在进入20世纪80年代后，随着科学技术的发展和环保意识的进一步增强，洗涤剂工业领域除了积极开发各种高效、温和的表面活性剂和助剂外，还会通过加入酶制剂来提高去污能力，根据酶制剂的不同一般可提高30％-60％，同时还能降低表面活性剂及三聚磷酸盐的用量。洗涤剂中的酶多为水解酶，其中，碱性蛋白酶是洗涤剂领域中应用最早，数量最多的一类水解酶。
碱性蛋白酶(Alkaline protease)属于丝氨酸蛋白水解酶家族，具备典型的Ser-His-Asp催化三联体结构，可以在碱性条件下(pH为7～11)保持酶活力，并催化水解蛋白质。由于细菌碱性蛋白酶具有重要的工业应用价值，在商品酶的生产中占有相当大的份额，所以目前工业化生产的碱性蛋白酶多来自于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。
虽然在洗涤剂中添加碱性蛋白酶能显著提升洗涤效果，但是洗涤剂中的多种组分都会影响到碱性蛋白酶的活性，例如，漂白剂组分会氧化蛋白酶中蛋氨酸残基导致酶失活；洗涤剂中的无机盐(如三聚磷酸钠、碳酸钠、硼酸钠等)、烷基苯磺酸钠等活性物质的存在都会对酶活性产生不利影响。而细菌来源的野生型碱性蛋白酶在耐热性、耐表面活性剂、储藏稳定性等方面难以满足实际应用需求。目前商用的碱性蛋白酶，如诺维信公司的ProgressUNO 100/100L、美国杜邦公司的P300等都是野生型蛋白酶的变体。虽然商品酶的稳定性有了很大提升，但有些蛋白酶制剂中仍需添加一定量价格高昂的蛋白酶抑制剂来维持稳定性。因此，还需要继续采用先进的蛋白工程和基因技术，如酶分子定向进化、理性设计等手段来提升酶的关键性能，获得稳定性高且更具实际应用价值的碱性蛋白酶。
发明内容
第一方面，本公开提供碱性蛋白酶变体，其氨基酸序列与SEQ ID NO：29所示序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％但小于100％的序列一致性，并且包含a)X9E、X42R、X199I、X256E、X69I、X139Y、X141Y、X206N和X134Q的氨基酸取代；和b)选自X143Q或X142N的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述变体还包含选自X15C、X16C、X102I、X209N、X218A、X250P、X258C或X264C中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸的取代。
在一些实施方案中，所述变体还包含选自X15C、X16C、X102I、X209N、X218A、X250P、X258C或X264C中一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代。
在一些实施方案中，所述变体包含a)S9E、N42R、V199I、L256E、T69I、S139Y、T141Y、S206N和E134Q的氨基酸取代；和b)选自R143Q或S142N的氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述变体还包含选自A15C、A16C、V102I、A209N、T218A、S250P、G258C或A264C中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸的取代。
在一些实施方案中，所述变体还包含选自A15C、A16C、V102I、A209N、T218A、S250P、G258C或A264C中一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代。
在一些实施方案中，所述变体包含a)S9E、N42R、V199I、L256E、T69I、S139Y、T141Y、S206N、和E134Q的取代；和b)选自R143Q或S142N的氨基酸取代；和任选地c)选自下述任一的氨基酸取代组：
1)T218A；
2)A16C+A264C；
3)T218A+S250P；
4)A15C+T218A+G258C；
5)V102I+T218A+S250P；
6)V102I+A209N+T218A+S250P；
7)A16C+V102I+T218A+S250P+A264C；或
8)A15C+V102I+A209N+T218A+S250P+G258C。
其中，本公开所述的“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
在一些实施方案中，所述变体的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1-14中任一所示。在一些实施方案中，所述变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1-14中任一所示。本公开还提供一种变体，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示序列相比具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中，所述变体序列包含SEQ ID NO：1或由其组成。
在一些实施方案中，进一步的，所述变体还包含选自A15C、A16C、V102I、A209N、T218A、S250P、G258C或A264C中至少一个、至少两个、至少三个或至少四个氨基酸的取代。在一些实施方案中，进一步的，所述变体还包含选自A15C、A16C、V102I、A209N、T218A、S250P、G258C或A264C中的一个、两个、三个或四个氨基酸的取代。
在一些实施方案中，所述变体序列相对于SEQ ID NO：1，包含T218A的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：2或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体序列相对于SEQ ID NO：1，包含T218A和S250P的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：3或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体序列相对于SEQ ID NO：1，包含V102I、T218A和S250P的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：4或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体序列相对于SEQ ID NO：1，包含V102I、A209N、T218A和S250P的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：5或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体序列相对于SEQ ID NO：1，包含A16C和A264C的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：11或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体序列相对于SEQ ID NO：1，包含A15C、T218A和G258C的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：12或由其组成。
本公开还提供一种变体，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：6所示序列相比具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中，所述变体序列包含SEQ ID NO：6或由其组成。
在一些实施方案中，进一步的，所述变体还包含选自A15C、A16C、V102I、A209N、T218A、S250P、G258C或A264C中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸的取代。在一些实施方案中，进一步的，所述变体还包含选自A15C、A16C、V102I、A209N、T218A、S250P、G258C或A264C中的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代。
在一些实施方案中，所述变体序列相对于SEQ ID NO：6，包含T218A的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：7或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体相对于SEQ ID NO：6，包含T218A和S250P的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：8或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体相对于SEQ ID NO：6，包含V102I、T218A和S250P的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：9或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体相对于SEQ ID NO：6，包含V102I、A209N、T218A和S250P的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：10或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体相对于SEQ ID NO：6，包含A16C、V102I、T218A、S250P和A264C的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：13或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体相对于SEQ ID NO：6，包含A15C、V102I、A209N、T218A、S250P和G258C的氨基酸取代；优选的，所述变体序列包含SEQ ID NO：14或由其组成。
在一些实施方案中，所述变体与野生型蛋白酶(SEQ ID NO：29)相比，具有一种或多种改善的特性。该特性包括但不限于：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、聚酯降解活性、聚酯特异性、蛋白水解稳定性、溶解度、比活性、在储存条件下的稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性和热稳定性等。
在一些实施方案中，所述蛋白酶变体具有改善的热稳定性，该变体在85℃，10min孵育处理后仍具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％的初始蛋白酶活性。
第二方面，本公开还提供编码上述任一碱性蛋白酶变体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包含信号肽编码序列、和/或前导肽编码序列、和/或标签肽编码序列；其中所述信号肽是指可参与成熟蛋白或前体蛋白的分泌或直接转运的氨基酸残基；所述前导肽序列是指位于信号肽与成熟多肽序列间的氨基酸序列，将其切除后能获得有活性的蛋白酶；所述标签肽可用于蛋白质的纯化和示踪等。
在一些实施方案中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：15-28中任一所示。
第三方面，本公开还提供重组表达载体，包含本公开所述的多核苷酸序列，其中所述重组表达载体可为直链或环状DNA分子。在一些实施方案中，所述重组表达载体上还具有可操作的连接至DNA序列以驱动在宿主细胞中表达的启动子序列。在一些实施方案中，所述重组表达载体上还包含转录终止序列。
第四方面，本公开还提供制备上述变体的方法，包括：(1)用上述表达载体转化宿主细胞，并诱导宿主细胞表达蛋白酶变体；(2)回收蛋白酶变体。
第五方面，本公开还提供一种包含至少一种本公开所述的蛋白酶变体的清洁或洗涤剂组合物。
在一些实施方案中，所述组合物中还包含一种或多种辅助成分，包括但不限于表面活性剂、水溶助剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、污垢释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂等。
在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种另外的酶，可任选自中性金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、过水解酶、氧化酶和过氧化物酶等。
在一些实施方案中，所述组合物中的蛋白酶变体相对于野生型蛋白酶(SEQ IDNO：29)具有增强的储藏稳定性。在一些实施方案中，所述组合物在60℃储存一段时间后(例如，至少6h、至少8h、至少12h、至少16h、至少24h、或至少36h后)，其中的蛋白酶变体仍具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、或至少70％的初始蛋白酶活性。在一些实施方案中，所述组合物在37℃储存一段时间后(例如，至少1周后、至少2周后、至少3周后、至少4周后、或至少5周后)，其中的蛋白酶变体仍具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的初始蛋白酶活性。
第六方面，本公开还提供如本公开所述碱性蛋白酶变体或包含如本公开所述碱性蛋白酶变体的组合物在清洁或洗涤中的用途。
第七方面，本公开提供用于清洁或洗涤物品的方法，包括利用本公开所述的蛋白酶变体或组合物与物品接触。
本公开所述的碱性蛋白酶及其变体对应的氨基酸序列如表1所示：
表1
有益效果
1、本公开通过对源自Alkalihalobacillus alcalophilus的碱性蛋白酶进行改良，筛选获得热稳定性能优势的突变体，有助于拓展碱性蛋白酶的使用范围，为其更好的适应工业化生产奠定了基础，对降低蛋白酶的使用成本具有重要意义；
2、本公开提供的蛋白酶变体能够在不含有蛋白酶抑制剂的洗涤剂中长时间稳定存在，在满足产品保质期的同时降低了产品成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步说明本公开的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本公开的示例，并不代表或限制本公开的保护范围。本公开的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。
LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L。
LB固体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、琼脂粉16g/L。
发酵培养基：蛋白胨20g/L、精制豆粕粉10g/L、葡萄糖40g/L、KH2PO4 3g/L、Na2HPO46g/L、MgSO4 0.3g/L、卡那霉素50mg/L。
本公开实施例中碱性蛋白酶的酶活检测方法除特殊说明参照如下进行：
(1)碱性蛋白酶酶活的测定(参照国标GB 1886.174-2016)：取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL，pH 10.5的50mM硼酸溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的酪蛋白(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)作为底物，混匀后于40℃下反应10min；加入200μL，400mM的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温，12000r/min离心2min。取上清200μL，加入1mL，5％(w/v)的Na2CO3和200μL的福林酚试剂，混匀后40℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于660nm下测定清液吸光值；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上。
(2)酶活的定义：在40℃，pH 10.5的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为1个酶活单位，以U表示。
实施例1野生型碱性蛋白酶及其变体重组质粒的构建
1、重组质粒pP43NMK-BPAPR0的构建
(1)根据B.subtilis表达系统的密码子偏好性，对野生型碱性蛋白酶BPAPR0(氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示)的编码基因序列进行优化，化学合成核苷酸序列(如SEQ IDNO：30所示)并使用Clonexpress IIOne Step Cloning Kit(Vazyme)将获得的核苷酸序列与pP43NMK质粒(丰晖生物)进行连接，得到连接产物。
(2)连接产物转化大肠杆菌JM109(Takara)，将转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养12～14h，在LB固体培养基上挑取4个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养12h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证及测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-BPAPR0。
2、碱性蛋白酶变体重组质粒的构建
以重组质粒pP43NMK-BPAPR0为模板，采用多位点突变试剂盒Mut Express MultiSFast Mutagenesis Kit V2(Vazyme)进行变体质粒构建。突变引物的设计及构建过程按照试剂盒说明书进行，突变位点如表2所示：
表2
实施例2野生型碱性蛋白酶及其变体重组菌的构建
采用常规枯草芽孢杆菌化学转化方法将实施例1中的野生型碱性蛋白酶及其变体重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600(淼灵生物)中，涂布于含有50ug/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基，37℃过夜培养。筛选平板长出的克隆采用菌落PCR的方法进一步鉴定阳性转化子，从而获得野生型碱性蛋白酶及其变体重组菌。将不同的重组菌接种到含有50ug/mL卡那霉素抗性发酵培养基中，摇瓶置于37℃，220rpm的摇床中震荡培养2-5天。收集发酵液，12000rpm离心10min收集上清液，0.22um滤膜过滤除菌并储存于4℃备用。
实施例3碱性蛋白酶热稳定性测试
将野生型碱性蛋白酶及其变体用pH 10.5的硼酸缓冲液稀释至相同的酶活水平(2000U/mL)，然后置于85℃条件下热处理10min，热处理结束后立刻置于冰上冷却。以未进行热处理的实验组为对照，测定实验组与对照组的酶活。检测结果见表3，其中，热处理后样品酶活与处理前样品酶活的比值即为酶活的残留率。
表3野生型碱性蛋白酶及其变体热稳定性测试
表3中的数据显示，相较于野生型，碱性蛋白酶变体的耐热性大幅提升；在85℃条件下处理10min后，野生型碱性蛋白酶BPAPR0已失活，而变体BPAPRS1-10的酶活残留率均在65％以上，显示出优异的热稳定性。且上述变体在85℃的热稳定性优于市售产品ProgressUNO 101L(诺维信)和Preferenz P300(杜邦)。
实施例4碱性蛋白酶在LASA洗涤剂中稳定性测试
配制模型洗衣液Model LASA(LAS15％，柠檬酸钠2％，DTPA0.5％，TEA3％，BIT0.5％，pH 9.0-9.5)。其中LAS代表十二烷基苯磺酸钠，DTPA代表二乙基三胺五乙酸，TEA代表三乙醇胺，BIT代表1-2苯并异噻唑啉-3-酮，以重量计进行配制。在Model LASA中添加终浓度3000U/g的蛋白酶样品，混合均匀。放置在60℃，保温24h，检测残余活力。检测结果见表2，其中以酶活残留率表示酶的稳定性。
表4野生型碱性蛋白酶及其变体在LASA洗涤剂中的稳定性测试
表4中的结果显示，60℃、LASA液体洗涤剂环境中储存24h后，碱性蛋白酶变体BPAPRS1-10仍具有至少44％的酶活残留率，稳定性均显著高于BPAPR0蛋白酶；且上述变体在LASA碱性洗衣液中的稳定性均优于市售产品Progress UNO 101L(诺维信)和PreferenzP300(杜邦)。
实施例5碱性蛋白酶在蓝月亮洗衣液中的稳定性测试
将蓝月亮(深层洁净护衣护色)洗衣液于121℃灭酶30min。分别添加终浓度为500U/g的蛋白酶样品，混合均匀。取样冷冻保存作初始样，其余放置在37℃保温4周。使用ProtazymeAKTablets(Megazyme，货号T-PRAK-1000T)检测初始和残余活力，检测结果见表3，其中以酶活残留率表示酶稳定性。
表5野生型碱性蛋白酶及其变体在蓝月亮洗衣液中的稳定性测试
表5中的结果显示，在蓝月亮洗衣液中，变体BPAPRS1-10的稳定性较野生型碱性蛋白酶BPAPR0均显著提升。同时，所有变体与市售产品progress UNO 101L(不含蛋白酶抑制剂)和Preferenz P300(不含蛋白酶抑制剂)相比储存稳定性显著提高。
Claims (10)
1.一种蛋白酶变体，其氨基酸序列与SEQ ID NO：29所示的序列具有至少90％但小于100％的序列一致性，并且该变体包含：
a)S9E、N42R、V199I、L256E、T69I、S139Y、T141Y、S206N和E134Q的氨基酸取代；和
b)选自R143Q或S142N的氨基酸取代；和
任选地c)选自A15C、A16C、V102I、A209N、T218A、S250P、G258C或A264C中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸的取代。
2.如权利要求1所述的变体，该变体包含：
a)S9E、N42R、V199I、L256E、T69I、S139Y、T141Y、S206N和E134Q的氨基酸取代；和
b)选自R143Q或S142N的氨基酸取代；和
任选地c)选自下述任一的氨基酸取代组：
1)T218A；
2)A16C+A264C；
3)T218A+S250P；
4)A15C+T218A+G258C；
5)V102I+T218A+S250P；
6)V102I+A209N+T218A+S250P；
7)A16C+V102I+T218A+S250P+A264C；或
8)A15C+V102I+A209N+T218A+S250P+G258C。
3.如权利要求1或2所述的变体，该变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-14中任一所示。
4.编码如权利要求1-3任一所述的蛋白酶变体的多核苷酸序列。
5.包含如权利要求1-3任一所述的蛋白酶变体多核苷酸序列的重组表达载体。
6.制备如权利要求1-3任一所述的蛋白酶变体的方法，包括：1)用如权利要求5所述的表达载体转化宿主细胞，并诱导宿主细胞表达蛋白酶变体；2)回收蛋白酶变体。
7.清洁或洗涤剂组合物，该组合物中包含至少一种如权利要求1-3中任一所述的蛋白酶变体。
8.如权利要求7所述的组合物，该组合物中还包含一种或多种辅助成分，和/或至少一种另外的酶。
9.如权利要求1-3中任一所述的蛋白酶变体或如权利要求7或8中所述的组合物在清洁或洗涤中的用途。
10.一种用于清洁或洗涤物品的方法，包括利用如权利要求1-3中任一所述的蛋白酶变体或如权利要求7或8中的组合物与物品接触。
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