CN112458072A

CN112458072A - 一种碱性蛋白酶突变体及其制备

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Publication number: CN112458072A
Application number: CN202011513333.6A
Authority: CN
Inventors: 路福平; 刘逸寒; 王兴吉; 李玉; 王克芬; 刘文龙; 张元夫; 刘夫锋; 张会图
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112458072B

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其制备。本发明通过提取克劳氏芽孢杆菌基因组DNA，经PCR扩增得到野生型带有酶原区的碱性蛋白酶基因序列，将扩增得到的野生型碱性蛋白酶基因通过易错PCR进行随机突变，通过高通量筛选后获得了十六个高活力碱性蛋白酶基因。将这十六个突变体基因构建重组载体并在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型碱性蛋白酶。

Description

一种碱性蛋白酶突变体及其制备

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其制备。

技术背景：

碱性蛋白酶是指用于水解蛋白质或多肽并且在碱性环境下活力较高、稳定性较好的一类酶，其最适pH一般为9～11，与酸性和中性蛋白酶相比具有作用范围广、水解能力强等优点，是目前工业中用量较多的酶之一。碱性蛋白酶在现代工业中具有极其广泛的用途，是洗涤剂生产、食品工业、医药、饲料、化学工业、废物处理及皮革制造等行业中的重要酶制剂。在洗涤剂中对日常生活中常见的血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢具有广泛的洗涤效果，并且能够大幅度提高洗涤剂的去污能力；在食品行业可有效应用于动植物蛋白的加工，以改善蛋白食品的品质和风味，增强食品的营养和功能，制备生物活性肽等；在生物技术领域，用于核酸纯化过程中蛋白质的去除，如海洋弧菌X4B-7分离的碱性蛋白酶可解聚组蛋白，降解DNA酶；在制革工业中，利用酶法脱毛比传统灰碱法脱毛的污染更小，且反应条件温和、水解效率高，可以有效提高制革工业的生产效率和经济效益。

蛋白酶广泛存在于动物、植物和微生物中，由于微生物具有生长速度快，生长条件简单、代谢过程特殊和分布广等特点，使之成为生物酶的重要来源。碱性蛋白酶多来源于微生物，特别是工业微生物产生的碱性蛋白酶其水解能力与耐碱性具有更加明显的优势，与动植物来源的碱性蛋白酶相比，微生物碱性蛋白酶可分泌到细胞外，具有下游技术处理相对简单，价格低廉、来源广、菌易培养、同时易于实现工业化大批量生产等特点，因此，碱性蛋白酶研究已成为蛋白酶研究的热点。然而，酶活力不高仍是当前碱性蛋白酶工业化生产的一个最主要的限制因素，因此，开发高活力碱性蛋白酶对其实现工业化生产具有重要意义。

酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略。利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的结构酶。易错PCR(Error-prone PCR)是体外定向进化常用方法，是指在扩增目的基因的同时，利用Taq酶不具备3’→5’校对功能，同时改变反应体系中Mn²⁺、Mg²⁺和各种dNTP的浓度，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因发生随机突变。然而，经一次突变的基因一般很难获得满意的结果，由此又发展出连续易错PCR(Sequential Error-prone PCR)策略，即将一次PCR扩增得到的产物作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行易错，使每一次获得的小突变不断进行积累而产生重要的有益突变。

芽孢杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效的分泌各种蛋白质；2、许多芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，芽孢杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。

因此，本发明中，通过易错PCR对来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因进行分子改造，利用枯草芽孢杆菌表达系统进行高通量筛选，得到酶活力提高的碱性蛋白酶突变体基因，并在解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌体系中成功表达。

发明内容：

本发明目的在于提供一种碱性蛋白酶突变体及其制备。

本发明为实现上述目的提供的技术方案之一为：以克劳氏芽孢杆菌CGMCCNO.12953基因组为模板，克隆出野生型碱性蛋白酶酶原区基因apr(SEQ ID NO.3所示)序列后(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，通过连续易错PCR对野生型碱性蛋白酶基因进行随机突变，再利用枯草芽孢杆菌表达系统进行高通量筛选获得十六个碱性蛋白酶高活力突变体基因。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之二为：将上述突变体基因构建重组载体并在解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型碱性蛋白酶，其可应用在洗涤剂、制革、食品、饲料等领域。

在本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、碱性蛋白酶高活力突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。在本发明中，碱性蛋白酶的突变点位置按其成熟肽的氨基酸序列进行编号，位置的编号对应于SEQ ID NO.6中野生型碱性蛋白酶成熟肽的氨基酸序列编号，如Val145表示野生型碱性蛋白酶成熟肽氨基酸序列的第145位氨基酸为Val，Val145Ile表示位置145的氨基酸由野生型碱性蛋白酶的Val替换成Ile，也可用氨基酸单字母简称进行表示，如V145I；同时发生多位点突变的采用“/”连接各突变位点的方式表示，如V11I/G95V/V145I/N212S，表示位置11、95、145和212位的氨基酸依次由野生型碱性蛋白酶的V替换成I、由G替换为V、由V替换为I、由N替换为S；核苷酸表示方法与氨基酸表示方法类似，位置的编号对应于SEQ ID NO.5中野生型碱性蛋白酶成熟肽碱基序列编号，如G400，表示碱性蛋白酶成熟肽碱基序列的第400位碱基为G。

在本发明中，APR表示野生型碱性蛋白酶，即氨基酸原始序列(如SEQ ID NO.4所示)，其编码基因表示为apr(如SEQ ID NO.3所示)。用APRM加数字X的方式表示各个碱性蛋白酶突变体，各突变体的编码基因则以其氨基酸表示形式的小写斜体表示。

本发明中，所述碱性蛋白酶突变体是具有蛋白水解活性，其成熟肽是：

(1)在SEQ ID NO.6所示的野生型碱性蛋白酶成熟肽基础上发生以下突变中的任意一种获得的：

V11I/G95V/V145I/N212S、V11L/G95V/V145I/N212S、

V11I/G95P/V145L/N212S、V11I/G95V/V145L/N212S、

V11L/G95P/V145I/N212S、V11L/G95P/V145L/N212S、

V11L/G95V/V145L/N212S、V11I/G95P/V145I/N212S、

V11I/G95P/V145I/N212T、V11L/G95P/V145I/N212T、

V11I/G95V/V145I/N212T、V11I/G95P/V145L/N212T、

V11L/G95V/V145I/N212T、V11L/G95P/V145L/N212T、

V11I/G95V/V145L/N212T或V11L/G95V/V145L/N212T；或

(2)与(1)同源性75％以上的氨基酸序列；或

(3)在(1)的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有(1)相同功能的氨基酸序列。

优选地，所述突变体为APRM1、APRM2、APRM3、APRM4、APRM5、APRM6、APRM7、APRM8、APRM9、APRM10、APRM11、APRM12、APRM13、APRM14、APRM15、APRM16；

本发明还提供上述突变体的编码基因；

优选地，所述突变体的编码基因如序列表SEQ ID NO.7-22任一所示；

本发明还提供包含上述突变体或其编码基因的重组载体或重组菌；

进一步地，所述重组载体的表达载体为pBSA43；

进一步地，表达所述突变体编码基因的宿主细胞为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或克劳氏芽孢杆菌；

优选地，所述枯草芽孢杆菌为WB600；

优选地，所述解淀粉芽孢杆菌为CGMCC No.11218；

优选地，所述地衣芽孢杆菌为TCCC11965；

优选地，所述克劳氏芽孢杆菌为CGMCC No.12953。

pBSA43是以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Amp^r基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Km^r基因，可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。

本发明实验步骤具体如下：

(1)将来自克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因通过易错PCR进行随机突变，获得随机突变的基因aprmx，将其连接到表达载体后转化至枯草芽孢杆菌WB600中，通过高通量筛选获得若干个碱性蛋白酶高活力突变体基因，再以这些高活力突变体基因为模板进行三轮连续易错PCR，通过高通量筛选后获得十六个碱性蛋白酶高活力突变体基因；

(2)将获得的碱性蛋白酶高活力突变体基因连接到表达载体，将其转化至解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及克劳氏芽孢杆菌中，获得各重组菌株；

(3)表达所述的重组菌株，纯化后获得碱性蛋白酶高活力突变体APRMX。

有益效果：

1、本发明使用连续易错PCR技术对克劳氏芽孢杆菌野生型碱性蛋白酶基因进行突变，得到了十六个碱性蛋白酶高活力突变体。

2、本发明中碱性蛋白酶高活力突变体基因在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌表达系统中进行了表达，并经过纯化制得了高活力碱性蛋白酶酶粉。

附图说明：

图1为野生型碱性蛋白酶酶原基因的PCR扩增电泳图

其中：M为DNA Marker，1为碱性蛋白酶酶原基因apr；

图2为pBAS43-apr质粒酶切验证图

其中：M为DNA Marker，1为pBSA43-apr经BamHI和HindIII双酶切图；

图3为碱性蛋白酶突变体基因易错PCR扩增电泳图。

其中：M为DNA Marker，1、2为碱性蛋白酶突变体基因aprmx易错PCR扩增电泳图；

图4为本发明重组质粒pBSA43-aprmx酶切验证图。

其中：M为DNA Marker，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16分别为重组质粒pBSA43-aprm1、pBSA43-aprm2、pBSA43-aprm3、pBSA43-aprm4、pBSA43-aprm5、pBSA43-aprm6、pBSA43-aprm7、pBSA43-aprm8、pBSA43-aprm9、pBSA43-aprm10、pBSA43-aprm11、pBSA43-aprm12、pBSA43-aprm13、pBSA43-aprm14、pBSA43-aprm15、pBSA43-aprm16经BamHI和HindIII双酶切图。

图5为野生型碱性蛋白酶APR酶学性质曲线图。

其中：

A为野生型碱性蛋白酶APR最适反应温度曲线图；

B为野生型碱性蛋白酶APR最适反应pH曲线图；

C为野生型碱性蛋白酶APR在60℃下的温度稳定性曲线图；

D为野生型碱性蛋白酶APR在pH＝11下的pH稳定性曲线图。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所使用的地衣芽孢杆菌为TCCC11965，公开于：Development andapplication of a CRISPR/Cas9 system for Bacillus licheniformis genome editing[J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,122:329-337，目前保存于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可从该中心获取菌种。

以下将通过具体实施例对本发明做进一步地解释说明。

实施例1野生型碱性蛋白酶基因的获得

1、野生型碱性蛋白酶基因来自实验室保存的克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)菌株(CGMCC NO.12953)，利用试剂盒(OMEGA:Bacterial DNA Kit)提取其基因组DNA，其中克劳氏芽孢杆菌基因组DNA的提取步骤如下：

(1)菌株活化：用接种环从甘油管中蘸取少许菌液接种于LB固体培养基平板上，三区划线，37℃恒温培养12h；

(2)转接：从培养菌体的平板上挑取单菌落接种于含5mL液体LB培养基中，于220rpm，37℃条件下振荡培养12h；

(3)收集菌体：取适量培养菌液分装于已灭菌的1.5mL EP管中，12000rpm离心1min收集菌体，弃上清；

(4)加入100μL ddH₂O重悬菌体，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴10min；

(5)加入100μL BTL Buffer和20μL蛋白酶K，旋涡振荡，55℃水浴40-50min，每隔20-30min，振荡混匀；

(6)加入5μL RNA酶，颠倒混匀数次，室温放置5min；

(7)12000rpm离心2min，去掉未消化部分，将上清部分转移至新的1.5mL EP管中，加入220μL BDL Buffer，振荡混匀，65℃水浴10min；

(8)加入220μL无水乙醇，吹吸混匀；

(9)将EP管中的液体转移至吸附柱中静止2min，12000rpm离心1min，将滤液重新倒入吸附柱中静置、离心，重复两次，弃滤液；

(10)加入500μL HBC Buffer，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(11)加入700μL DNA Wash Buffer，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(12)加入500μL DNA Wash Buffer，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(13)12000rpm空离2min，将吸附柱放到一个新的EP管上，置于55℃金属浴10min，晾干；

(14)加入50μL的55℃分子水，室温静置3-5min，12000rpm离心2min收集基因组。

2、以提取的克劳氏芽孢杆菌的基因组为模板，根据Genbank序列号FJ940727.1登录的碱性蛋白酶序列，在ORF框上下游设计一对引物，分别引入限制性酶切位点BamHI、HindIII，本发明的碱性蛋白酶基因的扩增引物如下：

上游引物P1(SEQ ID NO.1)：

5’-CGCGGATCCGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAAT-3’

下游引物P2(SEQ ID NO.2)：

5’-CCCAAGCTTTTAGCGTGTTGCCGCTTCT-3’

以P1和P2作为上、下游引物，以克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因组为模板进行扩增。

其扩增的反应体系为：

10×PCR Buffer	5.0μL
		dNTPs	5.0μL
上游引物P1	2.0μL
		下游引物P2	2.0μL
DNA模板	2.0μL
		Pyrobest酶	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	33.5μL

扩增程序为：95℃预变性10min；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min20 s，反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1059bp的条带(图1)，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到本发明的野生型碱性蛋白酶酶原区基因apr(SEQ ID NO.3)，将扩增获得的apr与载体pBSA43载体连接，得到重组质粒pBSA43-apr，酶切验证如图2所示，并将其转化至大肠杆菌JM109及枯草芽孢杆菌WB600中。

实施例2构建碱性蛋白酶突变体文库筛选高活力碱性蛋白酶突变体

1、基于易错PCR技术进行随机突变，构建新型碱性蛋白酶，设计引物如下：

上游引物P1(SEQ ID NO.1)：

5’-CGCGGATCCGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAAT-3’

下游引物P2(SEQ ID NO.2)：

5’-CCCAAGCTTTTAGCGTGTTGCCGCTTCT-3’

在易错PCR反应体系中，以P1和P2作为上、下游引物，以野生型碱性蛋白酶基因apr为模板，进行易错PCR。

其扩增的反应体系为：

10×PCR缓冲液(无Mg<sup>2+</sup>)	5μL
		dATP	0.1μL
dGTP	0.1μL
		dCTP	0.5μL
dTTP	0.5μL
		上游引物P1	2μL
下游引物P2	2μL
		野生型碱性蛋白酶基因	2μL
rTaq DNA聚合酶	0.3μL
		25mM MgCl<sub>2</sub>(10mM)	20μL
5mM MnCl<sub>2</sub>(0.3mM)	3μL
		ddH<sub>2</sub>O	14.5μL

扩增程序为：95℃预变性10min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min20 s反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳(图3)，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到带有随机突变的碱性蛋白酶的基因aprmx。

2、将碱性蛋白酶随机突变体基因aprmx与表达载体pBSA43连接后转化至JM109中并提取其质粒即得重组质粒pBSA43-aprmx，再将重组质粒pBSA43-aprmx转化至枯草芽孢杆菌WB600中，获得重组菌株WB600/pBSA43-aprmx，将转化子挑接至装有500μL的LB液体培养基的48孔板中，放入四十八孔板摇床在37℃，750r/min条件下培养48h，培养完成后离心取上清即得碱性蛋白酶粗酶液。

用短肽底物法测定碱性蛋白酶酶活力，从中挑出比酶活力比野生型高的转化子，再以高活力转化子质粒为模板进行连续易错PCR，按上述方式进行筛选，重复三轮，最终筛选获得十六株碱性蛋白酶活力较高的突变体菌株，将所获得的高活力碱性蛋白酶突变体菌株提取质粒并进行测序(北京华大生物工程公司)。

结果表明，获得的16个碱性蛋白酶高活力突变体，信息如下表：

表1碱性蛋白酶突变体信息

3、短肽底物测定碱性蛋白酶酶活力

短肽底物：将N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(AAPF，用氨基酸单字母简称表示，下同)、AAPY、AAPW、AAPA、AAPR、AAPN、AAPD、AAPC、AAPQ、AAPE、AAPG、AAPH、AAPI、AAPL、AAPK、AAPM、AAPP、AAPS、AAPT、AAPV混合，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，使得每种底物的浓度均为6mmol/L(方法参考专利《一种测定蛋白酶活力的新方法》，申请号：201910730238.2)。

测定方法：在96孔板中加入80μL pH 10.5的硼酸缓冲液和20μL短肽底物溶液，在40℃水浴锅中保温1min，再加入100μL稀释后的酶液(阴性对照中加100μL pH 10.5的硼酸缓冲液)，40℃反应10min，用酶标仪在410nm测定其吸光值。在上述条件下，1mL酶液1min水解底物产生1μmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位U。

实施例3碱性蛋白酶高活力突变体比酶活力评估

将上述实施例2步骤2所获得的高活力碱性蛋白酶突变体重组菌株WB600/pBSA43-aprmx(x分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，下同)和野生型重组菌株WB600/pBSA43-apr接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，继续以37℃，220r/min培养48h。

发酵液离心取上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/LTris-HCl(pH 7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度NaCl(0～1mol/L)的0.02mol/L Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH 7.0)缓冲液平衡，上样至sephadex g25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化的酶液。

使用实施例2中的短肽底物法测定其碱性蛋白酶活力；蛋白质浓度由BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，按照其说明书进行操作，碱性蛋白酶比酶活力为酶活力(U/ml)与蛋白质浓度(mg/ml)的比值。将野生型重组菌株比酶活力定为1，突变体重组菌株比酶活力以野生型重组菌株比酶活力倍数进行表示，其结果如下表所示。

碱性蛋白酶比活力

突变体	比酶活(U/mg)	比酶活力倍数
			野生型APR	26.6	1
APRM1	393.7	14.8
			APRM 2	438.9	16.5
APRM 3	508.1	19.1
			APRM 4	391.0	14.7
APRM 5	550.6	20.7
			APRM 6	457.5	17.2
APRM7	361.8	13.6
			APRM 8	521.4	19.6
APRM 9	502.7	18.9
			APRM 10	407.0	15.3
APRM 11	462.8	17.4
			APRM 12	529.3	19.9
APRM 13	470.8	17.7
			APRM 14	478.8	18.0
APRM 15	438.9	16.5
			APRM 16	380.4	14.3

酶学性质测定：对野生型及突变体的酶学性质进行测定，结果如图5所示，野生型碱性蛋白酶最适反应温度为60℃，最适反应pH为10；在pH 10，60℃条件下保温40h其残余酶活在6％左右，在60℃，pH＝11条件下保温70h其残余酶活在21％左右，突变体酶学性质与野生型基本一致。

实施例4碱性蛋白酶高活力突变体在其它芽孢杆菌中的构建

将1μL(50ng/μL)的pBSA43-aprmx和pBSA43-apr重组质粒分别加入到50μL的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218、地衣芽孢杆菌TCCC11965、克劳氏芽孢杆菌CGMCC No.12953感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床，震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行双酶切验证(图4)，确定获得表达突变体基因aprmx和野生型基因apr的解淀粉芽孢杆菌重组菌株、地衣芽孢杆菌重组菌株、克劳氏芽孢杆菌重组菌株，分别命名为CGMCC No.11218/pBSA43-aprmx、CGMCC No.11218/pBSA43-apr；TCCC11965/pBSA43-aprmx、TCCC11965/pBSA43-apr；CGMCC No.12953/pBSA43-aprmx、CGMCCNo.12953/pBSA43-apr。

实施例5碱性蛋白酶突变体在解淀粉芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备

分别将解淀粉芽孢杆菌突变体重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-aprmx和野生型重组菌CGMCC No.11218/pBSA43-apr接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，继续以37℃，220r/min培养48h。

发酵液离心取上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/LTris-HCl(pH 7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度NaCl(0～1mol/L)的0.02mol/L Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH 7.0)缓冲液平衡，上样至sephadex g25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化的酶液，冷冻干燥后制得碱性蛋白酶纯酶酶粉。所制备的碱性蛋白酶突变体酶粉可应用于洗涤剂、制革、食品、饲料等领域。

实施例6碱性蛋白酶突变体在地衣芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备

分别将地衣芽孢杆菌突变体重组菌株TCCC11965/pBSA43-aprmx和野生型重组菌TCCC11965/pBSA43-apr接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，继续以37℃，220r/min培养48h。

发酵液离心取上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/LTris-HCl(pH 7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度NaCl(0～1mol/L)的0.02mol/L Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH 7.0)缓冲液平衡，上样至sephadex g25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化的酶液，冷冻干燥后制得碱性蛋白酶纯酶酶粉。所制备的碱性蛋白酶突变体酶粉可应用于洗涤剂、制革、食品、饲料等领域。

实施例7碱性蛋白酶突变体在克劳氏芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备

分别将克劳氏芽孢杆菌突变体重组菌株CGMCC No.12953/pBSA43-aprmx和野生型重组菌CGMCC No.12953/pBSA43-apr接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，继续以37℃，220r/min培养48h。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东隆科特酶制剂有限公司

<120> 一种碱性蛋白酶突变体及其制备

<130> 1

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcggatccg ctgaagaagc aaaagaaaaa tatttaat 38

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccaagcttt tagcgtgttg ccgcttct 28

<210> 3

<211> 1059

<212> DNA

<213> 克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）

<400> 3

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtgtgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attaggggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggcgttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttaaacgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 4

<211> 353

<212> PRT

<213> 克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）

<400> 4

Ala Glu Glu Ala Lys Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu

1 5 10 15

Ala Val Ser Glu Phe Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala

20 25 30

Ile Leu Ser Glu Glu Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe

35 40 45

Glu Thr Ile Pro Val Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp

50 55 60

Ala Leu Glu Leu Asp Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu

65 70 75 80

Val Thr Thr Met Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln

85 90 95

Ala Pro Ala Ala His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val

100 105 110

Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg

115 120 125

Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn

130 135 140

Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser

145 150 155 160

Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys

165 170 175

Val Leu Gly Ala Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Ala Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu

195 200 205

Gly Ser Pro Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala

210 215 220

Thr Ser Arg Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala

225 230 235 240

Gly Ser Ile Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly

245 250 255

Ala Thr Asp Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala

260 265 270

Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro

275 280 285

Gly Ser Thr Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His

290 295 300

Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser

305 310 315 320

Asn Val Gln Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly

325 330 335

Ser Thr Asn Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr

340 345 350

Arg

<210> 5

<211> 807

<212> DNA

<213> 克劳氏芽孢杆菌（bacillus clausii）

<400> 5

gcgcaatcag tgccatgggg aattagccgt gtgcaagccc cagctgccca taaccgtgga 60

ttgacaggtt ctggtgtaaa agttgctgtc ctcgatacag gtatttccac tcatccagac 120

ttaaatattc gtggtggcgc tagctttgta ccaggggaac catccactca agatgggaat 180

gggcatggca cgcatgtggc cgggacgatt gctgctttaa acaattcgat tggcgttctt 240

ggcgtagcgc cgagcgcgga actatacgct gttaaagtat taggggcgag cggttcaggt 300

tcggtcagct cgattgccca aggattggaa tgggcaggga acaatggcat gcacgttgct 360

aatttgagtt taggaagccc ttcgccaagt gccacacttg agcaagctgt taatagcgcg 420

acttctagag gcgttcttgt tgtagcggca tctgggaatt caggtgcagg ctcaatcagc 480

tatccggccc gttatgcgaa cgcaatggca gtcggagcta ctgaccaaaa caacaaccgc 540

gccagctttt cacagtatgg cgcagggctt gacattgtcg caccaggtgt aaacgtgcag 600

agcacatacc caggttcaac gtatgccagc ttaaacggta catcgatggc tactcctcat 660

gttgcaggtg cagcagccct tgttaaacaa aagaacccat cttggtccaa tgtacaaatc 720

cgcaatcatc taaagaatac ggcaacgagc ttaggaagca cgaacttgta tggaagcgga 780

cttgtcaatg cagaagcggc aacacgc 807

<210> 6

<211> 269

<212> PRT

<213> 克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）

<400> 6

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 7

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtattcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attagtggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggcattctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttatccgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 8

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtttgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attagtggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggcattctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttatccgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 9

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtattcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attaccggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggccttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttatccgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 10

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtattcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attagtggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggccttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttatccgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 11

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtttgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attaccggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggcattctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttatccgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 12

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtttgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attaccggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggccttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttatccgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 13

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtttgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attagtggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggccttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttatccgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 14

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtattcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attaccggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggcattctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttatccgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 15

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

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actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

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gttaatagcg cgacttctag aggcattctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

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aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 16

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

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actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

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aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

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<210> 17

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

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gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

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actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

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agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

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gttaatagcg cgacttctag aggcattctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttaacggg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 18

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

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caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

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gttaatagcg cgacttctag aggccttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttaacggg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 19

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtttgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

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aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 20

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtttgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attaccggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

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aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 21

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

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actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attagtggcg 540

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atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggccttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

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aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

<210> 22

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtttgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attagtggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

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gttaatagcg cgacttctag aggccttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttaacggg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059

Claims

1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶的成熟肽是：

(1)在SEQ ID NO.6所示的碱性蛋白酶的基础上，发生包含以下突变组合中的任意一种获得的：

V11I/G95V/V145I/N212S、V11L/G95V/V145I/N212S、

V11I/G95P/V145L/N212S、V11I/G95V/V145L/N212S、

V11L/G95P/V145I/N212S、V11L/G95P/V145L/N212S、

V11L/G95V/V145L/N212S、V11I/G95P/V145I/N212S、

V11I/G95P/V145I/N212T、V11L/G95P/V145I/N212T、

V11I/G95V/V145I/N212T、V11I/G95P/V145L/N212T、

V11L/G95V/V145I/N212T、V11L/G95P/V145L/N212T、

V11I/G95V/V145L/N212T或V11L/G95V/V145L/N212T；或者

(2)与(1)同源性75％以上的氨基酸序列；或者

2.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID NO.7-22任一所示。

4.包含权利要求2所述基因的重组载体或重组菌株。

5.权利要求4所述的重组载体或重组菌株，其特征在于，表达载体为pBSA43；宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218、地衣芽孢杆菌TCCC11965、或者克劳氏芽孢杆菌CGMCC No.12953。

6.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产碱性蛋白酶中的应用。

7.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的应用。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，应用于洗涤剂、制革、食品或饲料领域。