CN111676211B - 一种抗自切和高比活力胰蛋白酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗自切和高比活力胰蛋白酶突变体，具体涉及通过分子改造和筛选获得胰蛋白酶的抗自切和高比活力突变体及其编码基因与应用，属于蛋白质和基因工程技术领域。本发明提供的胰蛋白酶突变体是在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基础上发生至少一个以下位点的突变获得的：R107H、R107L、R115S、R115T、K133A、K133A、K147D、K157E、K208P、K210A。比原始酶相比，具有更好的抗自切性能及更高的比活力，相对于野生型胰蛋白酶，抗自切性能提高0.67‑2.88倍，比酶活提高0.07‑2.98倍，改善了胰蛋白酶储存和使用过程中容易自切降低活力的问题。

Description

一种抗自切和高比活力胰蛋白酶突变体
技术领域：
本发明涉及通过分子改造和筛选获得胰蛋白酶的抗自切和高比活力突变体及其编码基因与应用，属于蛋白质和基因工程技术领域。
背景技术：
胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)是一种碱性丝氨酸蛋白水解酶，广泛应用于食品加工、医药及科研等领域。胰蛋白酶作为消化酶，能补充动物内源酶的不足，促进动物吸收营养成分；胰蛋白酶可以在不损伤其他组织的情况下稀释血块、脓液，加快伤口愈合，并能降解细胞间基质及黏附蛋白，具有重要医学价值；胰蛋白酶能使酒类及饮料澄清，可以提高皮革的弹性及柔软度；因其较强的氨基酸位点切割特异性，在科学研究领域被作为重要工具酶使用。
传统上胰蛋白酶主要从动物的胰脏中提取，原料受限且分离纯化困难，混有的糜蛋白酶等杂酶会严重影响酶的特异性水解效果。采用基因工程技术通过微生物重组表达和制备胰蛋白酶，可以提高其产量和纯度，降低分离难度和生产成本。动物来源蛋白可通过原核表达系统或真核表达系统表达。原核表达系统常用的宿主菌是大肠杆菌，其优势在于周期短、成本低以及表达载体选择多样化等，但同时也存在包涵体变性与蛋白复性难度大、纯化困难、目的蛋白难以大量和持续表达等缺点。动物源的胰蛋白酶更适合于采用真核表达系统进行制备和生产，而毕赤酵母是目前真核表达系统最常用的和最完善的宿主。
胰蛋白酶专一水解羧基端为精氨酸和赖氨酸的肽键，具有很强的氨基酸位点特异性。胰蛋白酶不仅能够水解其他蛋白质分子，同时也能攻击自身表面的赖氨酸和精氨酸位点，导致其酶活力在存储或使用过程中快速下降，进而影响其应用效能和水平。通过分子改造提高胰蛋白酶的抗自切能力，有助于提高其稳定性和水解效能。
鉴于天然胰蛋白酶容易自切失活、纯化困难和生产成本高等问题，通过微生物重组表达和分子突变改造研究获得性能更加优异的新型酶分子，对于促进其在科研、医药和食品等领域的应用具有重大意义。
发明内容：
为了解决胰蛋白酶容易自切失活的技术问题，本发明对猪源胰蛋白酶序列中的精氨酸和赖氨酸位点进行定点突变改造(野生猪源胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，研究证实所获得的胰蛋白酶突变体显著提高了抗自切能力，同时还具有了更高的比活力，这些优异性使之能更好地应用于医药、科研等领域。
本发明的目的是获得抗自切能力和活性皆有提高的胰蛋白酶突变体。本发明在野生胰蛋白酶序列SEQ ID NO.2的基础上，选定其精氨酸或赖氨酸位点作为目标突变位点，通过反向PCR技术进行定点突变。首先，针对目标突变位点进行单点突变，并重组毕赤酵母进行异源表达，通过测定突变酶的抗自切能力和比活力筛选获得10个可以有效提高抗自切能力和比活力的单点突变体，分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10，突变位点见表1。然后，采纳这些有效的单点突变进行组合突变，进一步得到10个可以有效提高胰蛋白酶抗自切能力和比活力的多点组合突变体，分别命名为P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19及P20，突变组合见表1。
表1突变位点对照表
Figure BDA0002494400440000021
所构建的突变体工程菌株，发酵合成胰蛋白酶原。酶原经肠激酶激活之后，通过超滤浓缩合和纯化制备胰蛋白酶。本发明以N-苯甲酰L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-arginine-ethyl-ester，BAEE)为底物，通过紫外分光光度计测定波长253nm下吸光度的变化率来测量酶活力。以37℃，pH 8.0条件下孵育120h后的酶活残留率作为胰蛋白酶抗自切性能的评估指标。
单点突变体P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10的初始比活力分别达到了野生型胰蛋白酶的3.02倍、1.67倍、1.91倍、2.49倍、2.67倍、2.06倍、1.54倍、2.79倍、1.18倍和1.14倍，120h酶活残留率分别达到了野生型胰蛋白酶的1.67倍、1.69倍、2.03倍、2.27倍、2.70倍、1.36倍、2.14倍、1.61倍、1.09倍和1.07倍，表明这些单点突变体相比野生型酶分子在比活力和抗自切能力有了不同程度的提高。
多点组合突变体P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19和P20比活力分别达到了野生型重组胰蛋白酶比活力的1.73倍、1.46倍、2.42倍、3.37倍、2.37倍、3.88倍、3.71倍、3.69倍、3.56倍和3.62倍，其孵育120h时的酶活残留率依次是野生型胰蛋白酶酶活残留率的2.62倍、2.43倍、2.24倍、2.34倍、3.2倍、3.09倍、3.32倍、3.50倍、3.69倍和3.98倍，表明这些组合突变体的抗自切能力相比单点突变体有了进一步的提高。
本发明还提供一种包含上述提高抗自切能力及比活力的胰蛋白酶突变体编码基因的重组载体；
进一步地，所述重组载体采用的表达载体可以为pHBM905A，pPIC9K，pPIC9K-His，pPIC3.5K，pPIC9，pPICZαA，pAO815，pPIC9k-His，pHIL-S1，pPink hc；pGADT7，pGBKT7，pWB980，pT3等；
优选地，所述表达载体为pPIC9K；
本发明还提供一种包含上述提高抗自切能力及比活力的胰蛋白酶突变体编码基因的重组菌株；
进一步地，所述重组菌株所采用的宿主细胞可以是毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115；酿酒酵母菌株YM4271，AH109，Y187，Y190；E.coli BL 21，E.coli X90；枯草杆菌B.subtilis SCK6等；
优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。
本发明还提供上述提高抗自切能力及比活力胰蛋白酶突变体的制备方法：
(1)重组毕赤酵母摇瓶发酵
接种菌株在YPD液体培养基，28℃，200rpm培养24h；以2％的接种量接种YPD液体培养基培养好的种子液至BMGY培养基，28℃，200rpm培养至菌液OD600为2-6，然后收集菌体；转移至BMMY培养基，添加甲醇至终浓度为0.5％；随后每12h添加终浓度为0.5％的甲醇诱导培养96h；
(2)胰蛋白酶原的激活
12000rpm离心10min收集发酵液上清，使用1M HCL或者NaOH调节pH至7.5，添加终浓度为2.5U/ml的肠激酶，25℃孵育30h以激活胰蛋白酶原；
(3)胰蛋白酶的纯化
酶原激活30h后，12000rpm离心15min，收集上清液，转移至4℃预冷的15ml规格的10kDa超滤离心管，2800rpm离心浓缩，然后向截留液中添加50mM醋酸溶液再次离心浓缩，重复一次实现截留液的溶液置换、浓缩和纯化。
所述胰蛋白酶还可以是与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列同源性80％以上具有相同功能的序列；
所述胰蛋白酶还可以是含有P1-P20相同突变位点的猪、牛、羊和兔等动物来源的胰蛋白酶序列。
本发明还提供上述抗自切高比活力胰蛋白酶突变体在饲料加工、食品加工、皮革加工、医药、科研领域的应用。
有益效果：
本发明获得的突变体比原始酶具有更好的抗自切性能及更高的比活力，相对于野生型胰蛋白酶，抗自切性能提高0.67-2.88倍，比酶活提高0.07-2.98倍，改善了胰蛋白酶储存和使用过程中容易自切降低活力的问题。
附图说明：
图1：载体pPIC9K-M-try的构建；
图2：野生胰蛋白酶和点突变体P1至P10的比活力以及孵育120h后的酶活残留率
a：野生胰蛋白酶和单点突变体的比活力；b：孵育120h后的酶活残留率；
图3：野生胰蛋白酶和组合突变体P11至P20的比活力及孵育120h的酶活残留率
a：野生胰蛋白酶和组合突变体的比活力；b：孵育120h后的酶活残留率。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
在以下的实施例中，未详细描述的过程和方法为本领域中通用的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用单字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2.胰蛋白酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示胰蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如R107H，表示位置107的氨基酸由野生型的R替换成H。位置的编号对应于SEQ ID NO：2中野生型胰蛋白酶的氨基酸序列编号。
实验材料和试剂：
1)菌株和载体
Escherichia coli JM109、Pichia pastoris GS115由本实验室保存，可通过商业途径购买获取；pMD19(T-simple)载体购自Invitrogen公司；pPIC9K载体购自TaKaRa公司。
2)酶与试剂盒
质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶购自TaKaRa公司。
3)培养基
大肠杆菌培养基为LB，酵母种子液培养基为YPD，酵母富集培养基为BMGY，酵母诱导培养基为BMMY。
本发明所采用的胰蛋白酶酶活力测定方法：
本发明以N-苯甲酰L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物，通过紫外分光光度计测定波长253nm下吸光度的变化率来测量酶活力。具体方法为：以0.25mM的BAEE为底物，在pH 7.6温度25℃条件下，反应体系3.0mL(光径1cm)，胰蛋白酶样品溶液加入量为75μL，测定253nm下吸光度的变化值Δ253nm，每分钟使吸光度值增加0.001的酶量为一个BAEE酶活单位。分别由以下公式计算胰蛋白酶酶活力、比活力：
Figure BDA0002494400440000051
Figure BDA0002494400440000052
本发明通过Uniprot数据库获得野生猪胰蛋白酶原的氨基酸序列(Entry number:P00761，SEQ ID NO.22)，将氨基酸序列送至金唯智生物科技有限公司，选择以毕赤酵母为表达宿主进行密码子优化，获得胰蛋白酶原毕赤酵母优化基因(SEQ ID NO.1)。通过PCR技术扩增胰蛋白酶原基因。将扩增的产物纯化回收，连接到pMD19T克隆载体，化转转入大肠杆菌JM109感受态细胞，通过反向PCR技术突变第107位、115位、133位、147位、157位、208位和210位氨基酸，获得所述的提高抗自切能力及比活力的胰蛋白酶的突变体。
其中定点突变具体包括如下步骤：以构建好的pMD19T-try(将野生型猪源型胰蛋白酶连接至pMD19T所得)为模板，以相应的突变引物进行反向PCR扩增，用限制性内切酶DpnI将原始模板分解，将扩增好的产物进行琼脂糖电泳验证并纯化回收产物，对构建好的重组质粒pMD19T-M-try(M代表对应突变体)和表达载体pPIC9K分别用Ecol I和Not I同时进行双酶切处理，回收目的基因片段以及载体片段并将其通过T4连接酶连接，得到表达载体pPIC9K-M-try；将构建好的表达载体用热激法转入大肠杆菌，通过菌液验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。提取测序正确的突变体质粒，将pPIC9K-M-try用Sac I线性化，并电转至毕赤酵母GS115的感受态，挑选转化子涂布于MD平板进行高拷贝筛选，将测序正确的转化子-80℃保菌。
以下将通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例1、猪源胰蛋白酶原基因的克隆。
根据野生猪胰蛋白酶原的氨基酸序列，选择以毕赤酵母为表达宿主进行密码子优化，获得胰蛋白酶原毕赤酵母优化基因(SEQ ID NO.1)，合成野生型胰蛋白酶原基因(SEQID NO.1)，设计引物并通过PCR技术扩增该基因，使用T4连接酶将扩增得到的基因片段连接到载体pMD19T，得到重组克隆载体pMD19T-try。化转转入大肠杆菌JM109感受态细胞。
实施例2、定点突变
定点突变的过程如下：以构建好的PMD19T-try为模板，设计相应引物进行反向PCR，在对应的第107位、115位、133位、147位、157位、208位和210位氨基酸位点引入单点或组合突变，引物序列如表2所示。使用Dpn I限制性内切酶去除原始模板，将扩增好的产物进行琼脂糖电泳验证并纯化回收产物，将回收质粒化转转入大肠杆菌，对构建好的菌株提质粒，进行单酶切和双酶切验证并测序，并提取重组质粒pMD19T-M-try(M代表对应突变体)；对构建好的重组质粒pMD19T-M-try(M代表对应突变体)和表达载体pPIC9K分别用Ecol I和Not I同时进行双酶切处理，回收目的基因片段以及载体片段，并将其通过T4连接酶连接，得到表达载体pPIC9K-M-try；将pPIC9K-M-try用Sac I线性化，并电转至毕赤酵母GS115的感受态，挑选转化子涂布于MD平板进行高拷贝筛选，将测序正确的转化子保存。
表2引物对照表
Figure BDA0002494400440000061
Figure BDA0002494400440000071
实施例3、重组毕赤酵母摇瓶发酵
接种菌株至YPD固体培养基进行三区划线，28℃培养2天；从YPD固体平板挑取单菌落至YPD液体培养基，28℃，200rpm培养24h；以2％的接种量接种YPD液体培养基培养好的种子液至BMGY培养基，28℃，200rpm培养至菌液OD600为2-6，然后将其转移至无菌离心管5000rpm离心10min，保留菌体；加入适量BMMY重复离心，去除残留甘油；转移至BMMY培养基，添加甲醇至终浓度为0.5％；随后每12h添加终浓度为0.5％的甲醇诱导培养96h。
实施例4、胰蛋白酶原的激活
12000rpm离心10min收集实施例3的发酵液上清，使用1M HCL或者NaOH调节pH至7.5，添加终浓度为2.5U/ml的肠激酶，25℃孵育30h以激活胰蛋白酶原。
实施例5、胰蛋白酶的纯化
酶原激活30h后，12000rpm离心15min，收集上清液，转移至4℃预冷的15ml规格的10kDa超滤离心管，2800rpm离心浓缩，然后向截留液中添加50mM醋酸溶液再次离心浓缩，重复一次实现截留液的溶液置换、浓缩和纯化。
实施例6、单突变体的初始比活力及抗自切性能分析
以实施例3-5方法制备的浓缩纯化后的野生型胰蛋白酶和突变体为实验对象，采用前述方法测定初始比活力，测定结果如图2(a)所示：单点突变体P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10的初试比活力分别达到了4.98*104U/mg、2.75*104U/mg、3.15*104U/mg、4.12*104U/mg、4.41*104U/mg、3.41*104U/mg、2.54*104U/mg、4.60*104U/mg、1.95*104U/mg和1.89*104U/mg，依次是野生型胰蛋白酶比活力(1.65*104U/mg)的3.02倍、1.67倍、1.91倍、2.49倍、2.67倍、2.06倍、1.54倍、2.79倍、1.18倍和1.14倍，表明这些单点突变体相比野生型酶分子在比活力性能上获得了不同程度的提高。
使用含1mM钙离子的50mM碳酸氢铵溶液将纯化浓缩的胰蛋白酶溶液稀释10倍，于37℃孵育120h后，测定酶活残留率，以此作为抗自切性能评价指标，实验结果如图2(b)所示，P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10的120h酶活残留率分别达到了35.44％、35.83％、42.96％、47.98％、57.08％、28.78％、45.32％、34.01％、23.02％和22.55％，依次是野生型胰蛋白酶酶活残留率(21.16％)的1.67倍、1.69倍、2.03倍、2.27倍、2.70倍、1.36倍、2.14倍、1.61倍、1.09倍和1.07倍，表明这些单点突变体相比野生型酶分子在抗自切稳定性上有了不同程度的提高。
实施例7、组合突变体的初始比活力及抗自切性能分析
选择效果改善明显的单突变体，进行多点组合突变，通过筛选获得10种效果较好的突变组合，分别命名为P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19及P20。其中，P11包含的突变位点为R107L和R115S；P12包含的突变位点为R107L和R115T；P13包含的突变位点为R107L和K133A；P14包含的突变位点为R115S和K133A；P15包含的突变位点为R115T和K133A；P16包含的突变位点为R107L、R115S及K133A；P17包含的突变位点为R107L、R115T和K133A；P18包含的突变位点为R107L、R115S、K133A及K147D；P19包含的突变位点为R107L、R115S、K133A、K147D及K157E；P20包含的突变位点为R107L、R115S、K133A、K147D、K157E、K208P及K210A。
以实施例3-5方法制备的浓缩纯化后的野生型胰蛋白酶和胰蛋白酶组合突变体为实验对象，采用前述方法测定初始比活力，初始比活力测定的实验结果如图3(a)所示，多点组合突变体P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19和P20的初始比活力分别达到了2.85*104U/mg、2.41*104U/mg、3.99*104U/mg、5.56*104U/mg、3.90*104U/mg、6.40*104U/mg、6.12*104U/mg、6.08*104U/mg、5.87*104U/mg和5.97*104U/mg，依次是野生型重组胰蛋白酶初始比活力(1.65*104U/mg)的1.73倍、1.46倍、2.42倍、3.37倍、2.37倍、3.88倍、3.71倍、3.69倍、3.56倍和3.62倍，表明这些多点突变体的初始比活力相比野生型胰蛋白酶也有进一步的提高。
使用含1mM钙离子的50mM碳酸氢铵溶液将纯化浓缩的胰蛋白酶溶液稀释10倍，于37℃孵育120h后，测定酶活残留率，以此作为抗自切性能评价指标，结果如图3(b)所示，多点组合突变体P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19和P20的120h酶活残留率分别达到了55.43％、51.44％、47.49％、49.51％、68.38％、65.43％、70.19％、74.10％、77.98％和84.16％，依次是野生型胰蛋白酶酶活残留率(21.16％)的2.62倍、2.43倍、2.24倍、2.34倍、3.23倍、3.09倍、3.32倍、3.50倍、3.69倍和3.98倍，表明这些多点突变体的抗自切能力相比单点突变体有了进一步的提高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种抗自切和高比活力胰蛋白酶突变体
<130> 1
<141> 2020-05-15
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 699
<212> DNA
<213> 猪()
<400> 1
atgttcccaa ctgacgatga cgacaagatt gtcggtggtt acacctgtgc cgccaactcc 60
atcccatacc aggtttcctt gaactccggt tcccacttct gtggtggttc cttgatcaac 120
tcccagtggg ttgtttccgc tgcccactgt tacaagtcca gaatccaggt cagattggga 180
gagcacaaca tcgacgtttt ggagggtaac gaacagttca ttaacgctgc taagattatt 240
actcatccaa attttaacgg taacactttg gataacgata ttatgttgat caagttgtcc 300
tccccagcta ccttgaactc cagagtcgct accgtttcct tgcctagatc ttgtgctgct 360
gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacacca agtcctccgg ttcctcctac 420
ccatccttgt tgcagtgctt gaaggctcca gtcttgtctg actcctcctg caagtcttcc 480
tacccaggtc agatcactgg taacatgatc tgcgtcggtt tcttggaggg tggaaaggac 540
tcctgtcaag gtgattccgg tggtccagtc gtttgcaacg gtcaattgca gggtatcgtc 600
tcttggggtt acggatgtgc tcagaagaac aagccaggtg tctacaccaa ggtctgcaac 660
tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 2
<211> 231
<212> PRT
<213> 猪()
<400> 2
Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala
1 5 10 15
Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe
20 25 30
Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His
35 40 45
Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp
50 55 60
Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr
65 70 75 80
His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile
85 90 95
Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser
100 105 110
Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly
115 120 125
Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln
130 135 140
Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly
165 170 175
Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn
180 185 190
Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys
195 200 205
Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile
210 215 220
Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn
225 230
<210> 3
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
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gagcacaaca tcgacgtttt ggagggtaac gaacagttca ttaacgctgc taagattatt 240
actcatccaa attttaacgg taacactttg gataacgata ttatgttgat caagttgtcc 300
tccccagcta ccttgaactc ccatgtcgct accgtttcct tgcctagatc ttgtgctgct 360
gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacacca agtcctccgg ttcctcctac 420
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tacccaggtc agatcactgg taacatgatc tgcgtcggtt tcttggaggg tggaaaggac 540
tcctgtcaag gtgattccgg tggtccagtc gtttgcaacg gtcaattgca gggtatcgtc 600
tcttggggtt acggatgtgc tcagaagaac aagccaggtg tctacaccaa ggtctgcaac 660
tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 4
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
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actcatccaa attttaacgg taacactttg gataacgata ttatgttgat caagttgtcc 300
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tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 5
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
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tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 6
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
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tccccagcta ccttgaactc cagagtcgct accgtttcct tgcctacctc ttgtgctgct 360
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tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 7
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
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gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacaccg cttcctccgg ttcctcctac 420
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tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 8
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
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tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 9
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
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tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 10
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
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<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
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<213> 人工序列()
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<210> 13
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
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gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacacca agtcctccgg ttcctcctac 420
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<210> 14
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
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tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
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<211> 699
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<400> 16
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actcatccaa attttaacgg taacactttg gataacgata ttatgttgat caagttgtcc 300
tccccagcta ccttgaactc cagagtcgct accgtttcct tgccttcttc ttgtgctgct 360
gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacaccg cttcctccgg ttcctcctac 420
ccatccttgt tgcagtgctt gaaggctcca gtcttgtctg actcctcctg caagtcttcc 480
tacccaggtc agatcactgg taacatgatc tgcgtcggtt tcttggaggg tggaaaggac 540
tcctgtcaag gtgattccgg tggtccagtc gtttgcaacg gtcaattgca gggtatcgtc 600
tcttggggtt acggatgtgc tcagaagaac aagccaggtg tctacaccaa ggtctgcaac 660
tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 17
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
atgttcccaa ctgacgatga cgacaagatt gtcggtggtt acacctgtgc cgccaactcc 60
atcccatacc aggtttcctt gaactccggt tcccacttct gtggtggttc cttgatcaac 120
tcccagtggg ttgtttccgc tgcccactgt tacaagtcca gaatccaggt cagattggga 180
gagcacaaca tcgacgtttt ggagggtaac gaacagttca ttaacgctgc taagattatt 240
actcatccaa attttaacgg taacactttg gataacgata ttatgttgat caagttgtcc 300
tccccagcta ccttgaactc cagagtcgct accgtttcct tgcctacctc ttgtgctgct 360
gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacaccg cttcctccgg ttcctcctac 420
ccatccttgt tgcagtgctt gaaggctcca gtcttgtctg actcctcctg caagtcttcc 480
tacccaggtc agatcactgg taacatgatc tgcgtcggtt tcttggaggg tggaaaggac 540
tcctgtcaag gtgattccgg tggtccagtc gtttgcaacg gtcaattgca gggtatcgtc 600
tcttggggtt acggatgtgc tcagaagaac aagccaggtg tctacaccaa ggtctgcaac 660
tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 18
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
atgttcccaa ctgacgatga cgacaagatt gtcggtggtt acacctgtgc cgccaactcc 60
atcccatacc aggtttcctt gaactccggt tcccacttct gtggtggttc cttgatcaac 120
tcccagtggg ttgtttccgc tgcccactgt tacaagtcca gaatccaggt cagattggga 180
gagcacaaca tcgacgtttt ggagggtaac gaacagttca ttaacgctgc taagattatt 240
actcatccaa attttaacgg taacactttg gataacgata ttatgttgat caagttgtcc 300
tccccagcta ccttgaactc cttggtcgct accgtttcct tgccttcttc ttgtgctgct 360
gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacaccg cttcctccgg ttcctcctac 420
ccatccttgt tgcagtgctt gaaggctcca gtcttgtctg actcctcctg caagtcttcc 480
tacccaggtc agatcactgg taacatgatc tgcgtcggtt tcttggaggg tggaaaggac 540
tcctgtcaag gtgattccgg tggtccagtc gtttgcaacg gtcaattgca gggtatcgtc 600
tcttggggtt acggatgtgc tcagaagaac aagccaggtg tctacaccaa ggtctgcaac 660
tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 19
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
atgttcccaa ctgacgatga cgacaagatt gtcggtggtt acacctgtgc cgccaactcc 60
atcccatacc aggtttcctt gaactccggt tcccacttct gtggtggttc cttgatcaac 120
tcccagtggg ttgtttccgc tgcccactgt tacaagtcca gaatccaggt cagattggga 180
gagcacaaca tcgacgtttt ggagggtaac gaacagttca ttaacgctgc taagattatt 240
actcatccaa attttaacgg taacactttg gataacgata ttatgttgat caagttgtcc 300
tccccagcta ccttgaactc cttggtcgct accgtttcct tgcctacctc ttgtgctgct 360
gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacaccg cttcctccgg ttcctcctac 420
ccatccttgt tgcagtgctt gaaggctcca gtcttgtctg actcctcctg caagtcttcc 480
tacccaggtc agatcactgg taacatgatc tgcgtcggtt tcttggaggg tggaaaggac 540
tcctgtcaag gtgattccgg tggtccagtc gtttgcaacg gtcaattgca gggtatcgtc 600
tcttggggtt acggatgtgc tcagaagaac aagccaggtg tctacaccaa ggtctgcaac 660
tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 20
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
atgttcccaa ctgacgatga cgacaagatt gtcggtggtt acacctgtgc cgccaactcc 60
atcccatacc aggtttcctt gaactccggt tcccacttct gtggtggttc cttgatcaac 120
tcccagtggg ttgtttccgc tgcccactgt tacaagtcca gaatccaggt cagattggga 180
gagcacaaca tcgacgtttt ggagggtaac gaacagttca ttaacgctgc taagattatt 240
actcatccaa attttaacgg taacactttg gataacgata ttatgttgat caagttgtcc 300
tccccagcta ccttgaactc cttggtcgct accgtttcct tgccttcttc ttgtgctgct 360
gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacacct tgtcctccgg ttcctcctac 420
ccatccttgt tgcagtgctt ggatgctcca gtcttgtctg actcctcctg caagtcttcc 480
tacccaggtc agatcactgg taacatgatc tgcgtcggtt tcttggaggg tggaaaggac 540
tcctgtcaag gtgattccgg tggtccagtc gtttgcaacg gtcaattgca gggtatcgtc 600
tcttggggtt acggatgtgc tcagaagaac aagccaggtg tctacaccaa ggtctgcaac 660
tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 21
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
atgttcccaa ctgacgatga cgacaagatt gtcggtggtt acacctgtgc cgccaactcc 60
atcccatacc aggtttcctt gaactccggt tcccacttct gtggtggttc cttgatcaac 120
tcccagtggg ttgtttccgc tgcccactgt tacaagtcca gaatccaggt cagattggga 180
gagcacaaca tcgacgtttt ggagggtaac gaacagttca ttaacgctgc taagattatt 240
actcatccaa attttaacgg taacactttg gataacgata ttatgttgat caagttgtcc 300
tccccagcta ccttgaactc cttggtcgct accgtttcct tgccttcttc ttgtgctgct 360
gctggtactg agtgcttgat ctctggttgg ggtaacacct tgtcctccgg ttcctcctac 420
ccatccttgt tgcagtgctt ggatgctcca gtcttgtctg actcctcctg cgagtcttcc 480
tacccaggtc agatcactgg taacatgatc tgcgtcggtt tcttggaggg tggaaaggac 540
tcctgtcaag gtgattccgg tggtccagtc gtttgcaacg gtcaattgca gggtatcgtc 600
tcttggggtt acggatgtgc tcagaagaac aagccaggtg tctacaccaa ggtctgcaac 660
tacgttaatt ggattcaaca aactattgct gctaactaa 699
<210> 22
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
atgtttccta ccgacgacga cgataagatc gtcggaggat acacttgtgc cgccaactct 60
atcccatacc aagtctctct taacagtgga tctcacttct gcggtggatc tcttattaac 120
tctcagtggg ttgtctctgc cgcccactgc tacaagagta ggatccaagt tagacttgga 180
gagcacaaca tcgacgtctt ggagggaaac gagcagttca tcaatgccgc caagatcatc 240
acccacccaa acttcaacgg taatactttg gataacgata ttatgcttat caaacttagt 300
agtccagcta ccttgaactc tttggtcgcc accgtttctc ttccatcttc ttgcgctgct 360
gctggaactg agtgcttgat cagtggttgg ggtaacaccg ccagttctgg aagtagttac 420
ccatctttgc ttcagtgcct tgacgcccca gttttgtctg acagttcttg cgagtctagt 480
tatcccggac agatcaccgg taacatgatc tgcgtcggat tcttggaggg aggaaaggac 540
tcttgccaag gtgattctgg aggaccagtc gtttgcaacg gacagcttca aggaatcgtc 600
agttggggat acggttgtgc tcaaccaaac gcccccggag tctacactaa ggtttgcaat 660
tatgttaact ggatccagca aaccatcgct gccaattga 699
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
cagctacctt gaactcccat gtcgctaccg tttccttgc 39
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
gcaaggaaac ggtagcgaca tgggagttca aggtagctg 39
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
cagctacctt gaactccttg gtcgctaccg tttccttgc 39
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
gcaaggaaac ggtagcgacc aaggagttca aggtagctg 39
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
gctaccgttt ccttgccttc ttcttgtgct gctgctggta c 41
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
gtaccagcag cagcacaaga agaaggcaag gaaacggtag c 41
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
ccgtttcctt gcctacctct tgtgctgctg ctg 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
cagcagcagc acaagaggta ggcaaggaaa cgg 33
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
ctggttgggg taacaccttg tcctccggtt cctcctac 38
<210> 32
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
gtaggaggaa ccggaggaca aggtgttacc ccaaccag 38
<210> 33
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
ctggttgggg taacaccgct tcctccggtt cctcctac 38
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
gtaggaggaa ccggaggaag cggtgttacc ccaaccag 38
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 35
cttgttgcag tgcttggatg ctccagtctt gtctg 35
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 36
cagacaagac tggagcatcc aagcactgca acaag 35
<210> 37
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
gtctgactcc tcctgcgagt cttcctaccc aggtc 35
<210> 38
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 38
gacctgggta ggaagactcg caggaggagt cagac 35
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
gttacggatg tgctcagcca aacaagccag gtgtctac 38
<210> 40
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 40
gtagacacct ggcttgtttg gctgagcaca tccgtaac 38
<210> 41
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 41
gatgtgctca gaagaacgct ccaggtgtct acaccaag 38
<210> 42
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
cttggtgtag acacctggag cgttcttctg agcacatc 38

Claims (7)

1.一种抗自切胰蛋白酶突变体，其特征在于，是在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基础上发生以下突变中的一种获得的：R107L/R115S/K133A/K147D、R107L/R115S/K133A/K147D/K157E、R107L/R115S/K133A/K147D/K157E/K208P/K210A。
2.权利要求1所述蛋白酶突变体的编码基因。
3.一种包含权利要求2所述基因的重组载体或重组菌株。
4.如权利要求3述的重组载体，其特征在于，表达载体为pPIC9K。
5.如权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，宿主细胞为毕赤酵母GS115。
6.采用权利要求5所述重组菌株生产胰蛋白酶的方法，其特征在于，具体如下：
（1）重组毕赤酵母摇瓶发酵
接种菌株在YPD液体培养基，28℃，200 rpm 培养24 h；以2%的接种量接种YPD液体培养基培养好的种子液至BMGY培养基，28℃，200 rpm 培养至菌液OD600为2-6，收集菌体；转移至BMMY培养基，添加甲醇至终浓度为0.5%；随后每12 h 添加终浓度为0.5%的甲醇诱导培养96h；
（2）胰蛋白酶原的激活
离心收集发酵液上清，调节pH至7.5，添加肠激酶，孵育以激活胰蛋白酶原；
（3）胰蛋白酶的纯化。
7.如权利要求1所述胰蛋白酶突变体在食品加工、皮革加工、医药领域非治疗目的的应用。
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