CN111394331A

CN111394331A - 一种谷氨酰胺转氨酶及其编码基因、表达载体及重组菌

Info

Publication number: CN111394331A
Application number: CN202010372970.XA
Authority: CN
Inventors: 史劲松; 龚劲松; 商玉婷; 许正宏; 钱建瑛
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2040-05-06
Also published as: CN111394331B

Abstract

本发明公开了一种谷氨酰胺转氨酶及其编码基因、表达载体及重组菌，属于基因工程技术领域。本发明通过密码子优化技术进行基因改造，以毕赤酵母为宿主，选择分泌型表达载体，转入改造后与枯草芽孢杆菌来源基因同源性为70.6％的谷氨酰胺转氨酶基因，直接分泌表达目的蛋白，得到高拷贝数的重组工程菌，该重组工程菌最适pH偏好性向酸性发生偏移，由pH7变为6，在50℃下水浴30min后相对酶活由71.4％增加为89.7％，这促进了谷氨酰胺转氨酶未来的工业化生产和在各领域的广泛应用。

Description

一种谷氨酰胺转氨酶及其编码基因、表达载体及重组菌

技术领域

本发明涉及一种谷氨酰胺转氨酶及其编码基因、表达载体及重组菌，属于基因工程技术领域。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(TGase)是一种催化酰基转移的酶，其可催化肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基(酰基供体)与酰基受体之间进行酰基转移，形成异肽键。谷氨酰胺转氨酶具有植物、动物、微生物等不同来源，其中微生物来源的TGase酶多存在于链霉菌属(Streptomyces spp.)和芽孢杆菌属(Bacillus spp.)。微生物发酵生产的谷氨酰胺转氨酶相较于其它来源可以直接从发酵液中分离得到，生产周期短，成本优势显著，具有研究价值与潜力。不同微生物来源及表达方法的谷氨酰胺转氨酶具有不同酶学性质。

谷氨酰胺转氨酶在食品、医药、生物技术等领域前景广阔。通过该酶独特、安全的交联作用，连接不同蛋白质中的限制性氨基酸，产生优势互补的作用，提高蛋白质的营养价值。在生物技术领域，由于谷氨酰胺转氨酶对蛋白质的特殊交联作用，可以应用于生化检测。蛋白质可以通过谷氨酰胺转氨酶的作用与氨基化的DNA连接，进行特异性修饰。糖基化反应可以将糖类物质交联到蛋白质中，使其兼具蛋白质大分子和糖类物质亲水性的特性，可以有效的改善蛋白质的功能性质，通过谷氨酰胺转氨酶的催化酰基转移反应进行蛋白质的酶法改性，具有反应条件温和、高效专一、安全可靠等独特的优势。因此，使用谷氨酰胺转氨酶催化蛋白质糖基化反应是有效且具有前景的糖基化修饰途径。对谷氨酰胺转氨酶交联作用的研究具有理论与应用价值，符合目前生物医药行业的发展趋势。未来，谷氨酰胺转氨酶将作为良好的生物交联剂广泛地应用与食品、生物等领域，带来巨大的社会与经济利益。

目前，已报道的绝大部分微生物来源的，尤其是芽孢杆菌来源的谷氨酰胺转氨酶都是中性酶，最适pH为7.0，并且热稳定性水平仍不算高，未改造前较少能在50℃下30min内保持较高活性，如链霉菌在50℃下水浴10min内相对酶活为74％。然而在工业生产时高温和酸性环境居多，所以需要寻找能在高温与酸性条件下进行稳定生产的谷氨酰胺转氨酶。此外，谷氨酰胺转氨酶生产菌株在自然状态下分泌的酶活性和产量都很低，很难得到直接分泌的谷氨酰胺转氨酶。通过传统的筛选菌种和优化发酵条件对于提高谷氨酰胺转氨的产量十分有限，远不能满足市场需求。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过密码子优化技术进行基因改造，以毕赤酵母为宿主，选择分泌型表达载体，转入改造后与枯草芽孢杆菌来源基因同源性为70.6％的谷氨酰胺转氨酶基因，直接分泌表达目的蛋白，得到高拷贝数的重组工程菌，该重组工程菌最适pH偏好性向酸性发生偏移，由pH7变为6，在50℃下水浴30min后相对酶活由71.4％增加为89.7％，这促进了谷氨酰胺转氨酶未来的工业化生产和在各领域的广泛应用。

本发明的第一个目的是提供一种谷氨酰胺转氨酶，所述的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供所述的谷氨酰胺转氨酶的编码基因。

进一步地，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述编码基因的表达载体。

进一步地，所述的表达载体采用的质粒为pPIC9K。

本发明的第四个目的是提供表达所述的谷氨酰胺转氨酶的重组菌。

进一步地，所述的重组菌是以毕赤酵母GS115为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述的重组菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的方法，包括如下步骤：以10-15％的接种量将重组菌的种子液接种至BMGY培养基中，在25-35℃、150-250rpm培养20-30h，低温低速离心，收集菌体后，倒掉上清，用无菌水重悬菌体，重复上述操作，最后用BMMY培养基重悬菌体，25-35℃、150-250rpm培养，每隔24h补加终浓度为0.3-1.0％甲醇，诱导40-100h。

进一步地，所述的重组菌的种子液是将重组菌单菌落接入YPD培养基中，在25-35℃、150-250rpm过夜培养获得。

本发明的第六个目的是提供所述的谷氨酰胺转氨酶在生产糖基化交联酪蛋白中的应用。

进一步地，所述的应用是以谷氨酰胺转氨酶为催化剂，催化酪蛋白与D-氨基葡萄糖进行糖基化交联反应。

本发明的有益效果：

本发明通过密码子优化技术进行基因改造，以毕赤酵母为宿主，选择分泌型表达载体，转入改造后与枯草芽孢杆菌来源基因同源性为70.6％的谷氨酰胺转氨酶基因，直接分泌表达目的蛋白，得到高拷贝数的重组工程菌，该重组工程菌最适pH偏好性向酸性发生偏移，由pH7变为6，在50℃下水浴30min后相对酶活由71.4％增加为89.7％，这促进了谷氨酰胺转氨酶未来的工业化生产和在各领域的广泛应用。

附图说明

图1为PCR扩增TG基因电泳图，其中：1、泳道M：DL10000 marker；2、泳道1-3：PCR扩增产物；

图2为重组质粒pPIC9K-TG电泳图，其中：1、泳道M：DL10000 marker；2、泳道1-4：重组质粒pPIC9k-TG；

图3为重组质粒酶切线性化电泳图，其中：1、泳道M：DL10000 marker；2、泳道1-4：重组质粒线性化产物；

图4为重组转化子菌落PCR验证图，其中：1、泳道M：DL10000 marker；泳道1-3；2、质粒多克隆位点上下游引物PCR验证；3、泳道4-6：目的基因上下游引物PCR验证；

图5为发酵上清液SDS-PAGE电泳图，其中：1、泳道M：Marker；2、泳道1-4：重组酵母菌24h、48h、72h、96h发酵液上清；3、泳道5-6：pPIC9K/GS115对照24h、48h发酵上清液；

图6为改造前后谷氨酰胺转氨酶的最适pH图，其中纵坐标为相对酶活，横坐标为不同pH条件，三角图标为改造前的出发菌株，圆形图标为重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115；

图7为改造前后谷氨酰胺转氨酶的热稳定性图，其中纵坐标为相对酶活，横坐标为不同温度条件，三角图标为改造前的出发菌株，圆形图标为重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115；

图8为酪蛋白与糖基化交联产物的SDS-PAGE电泳图，其中：1、泳道M：Marker；2、泳道1-4：酪蛋白、谷氨酰胺转氨酶、交联酪蛋白、糖基化交联酪蛋白；

图9为交联酪蛋白与糖基化酪蛋白的冻干图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

(1)用比色法测定谷氨酰胺转氨酶的酶活，1个单位谷氨酰胺转氨酶酶活定义为：以N-α-CBZ-GLN-GLY为作用底物，37℃，pH为6.0时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ-单羟胺酸的酶量(U/mL)。

①底物试剂A：100mg的Nα-CBZ-GLN-GLY溶解于2mL 0.2mol/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/L pH 6.0的Tris-HCl缓冲液4mL，0.1mol/L羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0；

②终止试剂B：3mol/L的HCl，12％TCA，5％FeCl₃等比例混合；

③标准曲线的绘制：分别配置5mmol/mL、10mmol/mL、15mmol/mL、20mmol/mL、25mmol/mL、30mmol/mL、35mmol/mL、40mmol/mL的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液.取1mL试剂A与0.4mL不同浓度的标准溶液混合，37℃水浴10min。加0.4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活.酶活计算公式如下：

酶活(U/mL)＝[(E_s-E_b-C_s)*稀释倍数]/X_s

式中：

E_s——样品吸光度

E_b——空白吸光度

C_s——标准曲线常数

X_s——标准曲线系数

(2)最适pH测定。配制pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8等7个不同梯度的磷酸盐缓冲液，用不同pH的缓冲液进行稀释，然后在上述7个不同pH条件下测定改造前后谷氨酰胺转氨酶的活力，具体测定方法参照(1)，确定出最适反应pH。

(3)热稳定性测定。在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下水浴30min后测定改造前后谷氨酰胺转氨酶的相对活力，具体测定方法参照(1)，绘制热稳定性曲线。

(4)制备酪蛋白的糖基化交联修饰产物，在50-200g/L的酪蛋白溶液中加入浓度为100-600mmol/L的D-氨基葡萄糖后混匀。按照15-25U/mg酪蛋白的添加量加入谷氨酰胺转氨酶，用NaOH溶液调节pH至中性，30-40℃反应3-9h后灭去酶活，再将pH调至3.0-5.0，在6000rpm下离心10min，再用相同pH的去离子水洗除未反应的D-氨基葡萄糖，得到酪蛋白的糖基化交联修饰产物。

(5)测定酪蛋白糖基化交联修饰产物的性能。将糖基化交联修饰产物和酪蛋白溶液离心后加入TCA(三氯乙酸)终止溶液，再次离心，送测游离氨基酸含量。取冻干后的酪蛋白糖基化交联修饰产物分别置于5-15mL 20-30℃水和常温食用油中，反应5-10min后，取出测定湿重，减去干重，得到吸附的重量。

实施例1：谷氨酰胺转氨酶基因扩增

通过宏基因筛选技术得到一段谷氨酰胺转氨酶基因，对其进行密码子优化改造，如SEQ ID NO.2所示，根据优化后的谷氨酰胺转氨酶基因序列设计特异性引物，Bs-1和Bs-2，以及pPIC9K质粒多克隆位点上下游的引物3’AOX1、5’AOX1，加粗部分为引入的酶切位点。

Bs-1(SEQ ID NO.3)：5’-CCGGAATTCATGATTATTGTTTCTGGTCA-3’(SnaB I)

Bs-2(SEQ ID NO.4)：5’-ATTTGCGGCCGCTTATCTAACAATTCTAAAC-3’(Not I)

3’AOX1(SEQ ID NO.5)：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’

5’AOX1(SEQ ID NO.6)：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’

以密码子优化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis来源的谷氨酰胺转氨酶基因为模板，Bs-1、Bs-2为上下游引物进行PCR扩增，扩增体系为：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O 22μL，PrimeSTAR 25μL，总体积为50μL；扩增条件为：95℃预变性5min后开始循环：95℃变性30s，59.6℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸5min。PCR反应结束后，将得到的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行验证(如图1所示)并用胶回收试剂盒进行纯化回收。

实施例2：重组表达质粒pPIC9K-TG的构建

胶回收的PCR扩增产物和pPIC9K质粒载体用SnaB I和Not I限制性内切酶37℃酶切4h，酶切反应后经1％琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收，将酶切后的目的片段和载体按照7：1的摩尔比例进行连接反应，16℃金属浴，过夜连接。将连接产物于采用热击法转入大肠杆菌E.coli JM109，涂布于含Kan^r的平板，37℃倒置培养12h。挑取转化子，进行菌落PCR验证，扩增反应在10μL体系中进行，反应体系中加入5μL Ex TaqMix，20μL ddH₂O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性5min后开始循环：94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸10min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR反应结束后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析(如图2所示)，取PCR验证正确的转化子培养过夜后提取质粒送测验证，将测序结果在DNAMAN上进行比对。

实施例3：重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115的构建

用Sac I酶线性化验证正确的重组质粒，37℃水浴，2h。反应结束后，以1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证(如图3所示)，并且用胶回收试剂盒进行回收，在最后一步洗脱时用ddH₂O进行洗脱，以降低离子浓度，提高电转效率。取已经线性化的质粒(DNA小于5μg)，加入到预冷的毕赤酵母感受态细胞中，用枪头轻缓混匀，将上述混合物转移到预冷的0.2cm电转杯中，擦干电转杯，放置到电转仪中，以2000V，5ms电击一次，电击结束后，立即往电转杯中加入1mL冰浴的山梨醇溶液，将杯底的菌液轻轻吹吸起来，电转杯中的液体全部转移到1.5mL的Ep管中，在30℃、220rpm的摇床上培养2h，将菌液以6000rpm离心1min，吸出上清，留100μL悬浮菌体后涂布在MD培养基上，在30℃恒温培养箱倒置培养72h。取MD平板上长出的转化子分别点种在含有3mg/mL、4mg/mL的遗传霉素G418的固体YPD平板上，于30℃恒温培养箱倒置培养60h，至平板上长出菌落。

实施例4：重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115的验证

选取能够在高浓度G418平板上生长的转化子接种于10mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm培养过夜，在每个EP管加入1mL菌液，12000rpm低温离心1min弃上清，加入等量玻璃珠和200μL STES溶液，再在通风橱里加入200μL氯仿/异戊醇(比例为24:1)，振荡EP管5min，加入200μL TE混匀，12000rpm低温离心10min，吸上清到新EP管，加入35μL 3M NaAc、700μL无水乙醇，于-80℃冰箱醇沉20min以上，后12000rpm低温离心10min，弃上清，加入75％乙醇500μL，弃上清，55℃烘干30min，加入30μL 200μg/mL RNase水，55℃消化30min后使用核算定量仪测定浓度，得到酵母转化子的基因组DNA。将平板上长出的能够耐受高G418浓度的酵母转化子的基因组用质粒多克隆位点上下游的引物以及目的基因的上下游引物进行两轮PCR验证，反应结束后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析(如图4所示)，成功构建出高拷贝数的重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115。

第一轮PCR验证体系：

第一轮PCR验证程序：

第二轮PCR验证体系：

第二轮PCR验证程序：

实施例5：重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115的发酵产酶

将PCR验证正确的pPIC9K-TG/GS115菌株接入10mL YPD培养基中30℃、200rpm过夜培养，以10％的接种量接种至BMGY培养基中30℃、200rpm培养24h，以4℃、5000rpm离心10min收集菌体后，倒掉上清，用10mL无菌水重悬菌体，重复上述操作，最后用10mL BMMY培养基重悬菌体，30℃、200rpm培养，每隔24h补加终浓度为0.5％甲醇，诱导培养96h。

取pPIC9K-TG/GS115和pPIC9K/GS115的发酵液上清进行SDS-PAGE分析，如图5所示，酵母细胞内未见明显的目的蛋白，发酵液上清中可见清晰的条带，重组蛋白大小位于25-35kDa之间，约在28kDa处，诱导表达了目的蛋白，并且从诱导24h开始，随着诱导时间的延长，谷氨酰胺转氨酶的表达量也在增加。

实施例6：重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115的体外复性及酶活检测

将发酵液于12000rpm下离心10min，弃上清后将沉淀置于8M尿素(50mM pH 7.5磷酸盐缓冲液、20mM DTT、1mM EDTA)中于37℃反应2h。再加入10M HCl将上述溶解液pH调节至5.5，用pH为5.5的8M尿素将其稀释至约5mg/ml。用含有50mM(pH5.5)磷酸盐缓冲液将其快速稀释16倍，于12000rpm下离心10min，除去不溶物质后将其冻干，将冻干的菌体溶解于变性缓冲液(8M尿素、20mM磷酸盐、20mM DTT、1mM EDTA，pH 7.5)，并在37℃下水浴2h。加入10MHCl将其pH调节至4.0，然后用50mM乙酸盐缓冲液将其快速稀释50倍，并将溶液温度保持在4℃，稀释2h后，用4M NaOH将其pH从4.0调节至6.0。将经过体外重折叠的重组谷氨酰胺转氨酶进行比色法酶活检测，测定525nm下的吸光值后根据标准曲线换算，得到重组菌最高酶活为0.6513U/mL。

实施例7：重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115的最适pH

配制pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8等7个不同梯度的磷酸缓冲液，用不同pH的缓冲液进行稀释，然后测定改造前后谷氨酰胺转氨酶的活力，如图6所示，重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115的最适pH由密码子改造前的7变为6。

实施例8：重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115的热稳定性

取改造前后的谷氨酰胺转氨酶在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下分别水浴30min后测定的相对活力，以20℃下的剩余酶活为100％，如图7所示，重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115在50℃下的相对酶活为89.7％，对比改造前的71.4％，热稳定性得到提高。

实施例9：重组毕赤酵母菌株pPIC9K-TG/GS115的交联应用能力

在100g/L的酪蛋白溶液中加入浓度为300mmol/L的D-氨基葡萄糖，混匀后加入谷氨酰胺转氨酶，添加量为25U/mg酪蛋白，用0.2M的NaOH溶液调节pH至中性，于37℃反应5h，再置于100℃水浴3min灭去酶活，将pH调至3.5，6000rpm离心10min，再用相同pH的去离子水多次洗除或透析剩余的D-氨基葡萄糖，得到酪蛋白的糖基化交联修饰产物。

分别取酪蛋白、谷氨酰胺转氨酶、交联酪蛋白、糖基化交联酪蛋白进行SDS-PAGE分析，如图8所示，糖基化交联酪蛋白产生了分子量约为150kDa的蛋白物质，且糖基化交联产物的泳道亚基谱带明显少于酪蛋白泳道，表明在谷氨酰胺转氨酶的作用下，酪蛋白与D-氨基葡萄糖发生了糖基化交联反应，生成了分子量大于150kDa的大分子蛋白聚合物，并且在相同的条件下，酪蛋白自身并未发生交联。

实施例10：表征糖基化交联酪蛋白交联效果

取1mL酪蛋白和糖基化交联酪蛋白溶液于4℃6000rpm离心5min，吸取1mL上清加入200μL 15％TCA(三氯乙酸)溶液，混匀后再次4℃6000rpm离心5min，吸取1mL上清送测。糖基化交联酪蛋白溶液与未进行交联的酪蛋白溶液相比赖氨酸含量降低了0.132mg/mL，因为在谷氨酰胺转胺酶的催化作用下，酪蛋白中的赖氨酸残基发生了特殊的蛋白质交联作用，以异肽键的形式紧密结合，也因此糖基化交联的酪蛋白结构更为紧密，有着较强的交联效果。

实施例11：糖基化交联酪蛋白吸附性能的测试

将糖基化交联酪蛋白溶液于﹣80℃预冷后置入冻干机冻干10天(如图9所示)。用镊子撕取表层的糖基化交联酪蛋白约0.3g，分别浸泡于10mL 20-30℃水和常温食用油中，以探究糖基化交联酪蛋白吸附水相和油相的能力。在反应10min后，取出吸附水/油的糖基化交联酪蛋白，测定反应前后质量差，质量差越大说明吸附效果越好。由测定结果可知反应前后质量差分别约为5.90g、0.48g，为自身质量的19.6和1.6倍，可以看出糖基化交联酪蛋白对水有着较强的吸附能力。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种谷氨酰胺转氨酶及其编码基因、表达载体及重组菌

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 245

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Ile Ile Val Ser Gly Gln Asp Leu Ile Ile Gln Asp Ile Glu Asn

1 5 10 15

Trp Gln Ile Glu Gln Asp Leu Asn Pro Leu Met Lys Glu Met Pro Glu

20 25 30

Thr Pro Val Gln Phe Asp Tyr His Ser Ile Ala Glu Leu Met Phe Glu

35 40 45

Leu Lys Leu Arg Leu Asn Ile Val Ala Ala Ala Lys Thr Leu His Phe

50 55 60

Ser Gly Ala Lys Phe Ala Thr Lys Leu Lys Thr Tyr Gly Asn Thr Thr

65 70 75 80

Tyr Trp Arg Ile Ser Pro Glu Phe Ala Leu Glu Leu Lys Tyr Arg Met

85 90 95

Pro Pro Ser Lys Asp Ile Arg Thr Ile Ala Glu Asn Gly Pro Phe Tyr

100 105 110

Ala Phe Glu Cys Ala Thr Ala Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Tyr Ala Leu

115 120 125

Ile Asp Thr Ile Gly Glu Asp Lys Phe Asn Ala Ser Phe Asp Arg Ile

130 135 140

Ile Leu Tyr Asp Trp His Tyr Glu Lys Leu Pro Ile Tyr Thr Glu Ala

145 150 155 160

Gly His His Phe Thr Leu Gly Asp Cys Leu Tyr Phe Lys Asn Pro Glu

165 170 175

Phe Asp Pro Gln Lys His Phe Trp Ser Gly Glu Asn Val Ile Leu Leu

180 185 190

Gly Glu Asp Lys Tyr Gln Ala Ala Gly Leu Gly Ile Leu Asn Gly Lys

195 200 205

Gln Ile Ile Asp Lys Leu Asn Gly Phe Arg Lys Lys Gly Ala Leu Gln

210 215 220

Ser Ala Ser Ile Phe Asn Gln Ala Thr Arg Leu Asp Val Pro Ser Leu

225 230 235 240

Phe Arg Ile Val Arg

245

<210> 2

<211> 738

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgattattg tttctggtca agagatgatt attcaagata ttgaaaactg gcaaattgtt 60

caagatttga acccattgtt gaaggaaatg ccagaaactc cagttcaatt tgattaccat 120

tctattgctg aattgataca tgaattgaag ttgagaatgg ttattgttgc tgctgctaag 180

actttgcata attttggtgc taagtttgct actttgtcga agacttacgg taacactact 240

tactggagaa tttctccaga atttgctttg gaattgaagt acagaatgcc accatctaag 300

gatattagag ctggtgctga aaacggtcca ttttacgctt ttgaatgtgc tactgctatt 360

gctattattt acttgtacgc tttgattgat actattggtg aagataagtt taacgcttct 420

tttgatagaa ttattttgta cgattggcat tacgaaaagt tgccaattta cactgaaact 480

attcatcatt ttactttggg tgattgtttg tactttaaga acccagaatt tgatccacaa 540

aaggctggtg cgagttttga aaacgttatt ttgttgggtg aagataagta cttatgtcat 600

catttgggta ttttgaacgg taagcaaatt attgataagt tgaactcagg tagaaagaag 660

ggtgctttgc aatctgcttc cattttcaat caagctacta gattggatgt tccatctttg 720

tttagaattg ttagataa 738

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

ccggaattca tgattattgt ttctggtca 29

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

atttgcggcc gcttatctaa caattctaaa c 31

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

gcaaatggca ttctgacatc c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

gactggttcc aattgacaag c 21

Claims

1.一种谷氨酰胺转氨酶，其特征在于，所述的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

4.一种携带权利要求2所述的编码基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体采用的质粒为pPIC9K。

6.一种表达权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶的重组菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以毕赤酵母GS115为宿主。

8.一种权利要求7所述的重组菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：以10-15％的接种量将重组菌的种子液接种至BMGY培养基中，在25-35℃、150-250rpm培养20-30h，低温低速离心，收集菌体后，倒掉上清，用无菌水重悬菌体，重复上述操作，最后用BMMY培养基重悬菌体，25-35℃、150-250rpm培养，每隔24h补加终浓度为0.3-1.0％甲醇，诱导40-100h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的重组菌的种子液是将重组菌单菌落接入YPD培养基中，在25-35℃、150-250rpm过夜培养获得。

10.权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶在生产糖基化交联酪蛋白中的应用。