CN109280651B

CN109280651B - 一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法

Info

Publication number: CN109280651B
Application number: CN201811069893.XA
Authority: CN
Inventors: 魏琪; 邱鹏; 蒋飞; 张骞; 王洪; 罗红
Original assignee: Sichuan Zihaoshidai Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Sichuan Zihaoshidai Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2018-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2038-09-13
Also published as: CN109280651A

Abstract

本发明涉及一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法。该发明依赖于遗传资源Lactobacillus bulgaricus的乳酸脱氢酶基因，在此基础上进行点突变并对基因序列进行密码子优化后，连接到表达载体上，构建重组质粒并导入大肠杆菌中，重组乳酸脱氢酶突变体在大肠杆菌中获得了可溶性高表达，离心收集的菌体经高压均质机破菌后，粗酶液可在低温下存放5天，活性无明显衰减。通过本方法制备的重组乳酸脱氢酶突变体与未进行突变及序列优化的重组乳酸脱氢酶相比，表达量提高了五倍以上，且在高pH值下的活性损失更小，有更广的pH值适用范围。本发明在乳酸发酵制备及NAD/NADH循环中有广阔的应用前景。

Description

一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法

技术领域

本发明属于基因重组发酵技术领域，具体涉及一种乳酸脱氢酶突变体基因lbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法。

背景技术

NADH依赖的乳酸脱氢酶(LDH)是一种乳酸菌发酵代谢中的一个关键酶，其以NADH作为辅酶，经过生化反应将丙酮酸还原成乳酸，同时将NADH氧化成NAD。由于乳酸脱氢酶和丙酮酸的价格十分便宜，性质相对稳定，所以可以用于生物转化体系中NAD的再生。

大约80％生物催化的氧化还原反应都需要NAD或者NADH作为辅酶，由于NAD和NADH价格十分昂贵，所以生物催化反应中的辅酶都需要进行循环再生，以减少体系中辅酶的用量并提高反应的经济性。辅酶再生有多种方法，包括酶法、化学法、基因工程法等，其中酶法由于具备最温和，最经济的优势，成为了目前的研究热点，所以其在工业生物催化反应中具有广阔的运用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种经优化后可以在大肠杆菌中高效可溶表达，且经过高压均质机处理后得到高酶活的粗酶液，用于生物催化反应中的辅酶再生。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种重组乳酸脱氢酶突变体，其特征在于：它是在将乳酸脱氢酶第63位谷氨酸突变为亮氨酸，将192位缬氨酸突变为蛋氨酸，将211位天冬氨酸突变为赖氨酸的突变体。

进一步地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述突变体由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码。

一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1，其特征在于：所述LbLDH1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

一种重组载体，其特征在于：它包括前述乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1；优选所述重组载体为重组pET-22b(+)载体、重组pET-28a(+)载体或重组pET-32a(+)载体。

一种重组菌，其特征在于：它包括前述的重组载体。

进一步地，所述重组菌为重组大肠杆菌；优选为重组E.coli DH5α、重组E.coliBL21(DE3)、重组E.coli Top10或重组E.coli JM109。

本发明还提供了一种前述重组菌发酵的方法：取重组菌的单克隆，接种到含有Kan的LB液体培养基中，于摇床中培养过夜，取菌液接种到含有Kan的LB液体培养基中，于摇床中扩大培养后，再加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达。培养完成后，收集菌体，按菌体湿重与破菌缓冲液1:3～1:10的比例混合，搅拌均匀后，用高压均质机进行菌体破碎，离心收集上清液即为粗酶液。

进一步地，所述摇床中培养过夜的温度37℃、转速160rpm；和/或，所述摇床中扩大培养的温度37℃、转速200rpm；和/或，所述IPTG的加入时间是OD值达到0.6时；和/或，所述诱导表达的条件是温度25℃、转速200rpm，时间12h；和/或，所述收集菌体的条件是压力5000g、温度4℃，时间5min；和/或，所述破菌缓冲液是磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液，破菌缓冲液pH值范围是pH 7.5～8.5，优选为8.0，浓度是10～100mM；和/或，所述高压均质机破菌压力为300-900bar，破菌次数2次。

本发明还提供了一种乳酸脱氢酶突变体的分离纯化方法，其特征在于：它是将重组菌发酵得到的粗酶液上样到2ml Ni Sepharose 6FF小预柱上，待上样完成后用缓冲液淋洗到没有杂蛋白洗脱为止，然后用缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白峰，再将收集到的目的蛋白上样到Superdex 75 10/300GL层析柱，用缓冲液进行分离，收集目的蛋白，用SDS-PAGE电泳检测为单一条带，与理论分子量一致，即完成纯化。

进一步地，所述Ni Sepharose 6FF小预柱需要预先用50mM pH8.0Tris平衡；和/或，所述淋洗用缓冲液为50mM Tris、500mM NaCl、20mM咪唑组成的pH8.0的混合液；和/或，所述梯度洗脱用缓冲液为50mM Tris、500mM NaCl、250mM咪唑组成的pH8.0的混合液；和/或，所述分离用缓冲液为50mM pH8.0Tris。

本发明重组乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1在大肠杆菌中可获得可溶性高表达，与未进行突变及序列优化的重组乳酸脱氢酶相比，表达量提高了五倍以上；在高pH值下的活性损失更小；低温下可存放5天，活性无明显衰减，在乳酸发酵制备及NAD/NADH循环中具有广阔的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。

附图说明

图1乳酸脱氢酶突变体纯化前后对比图(泳道1：Marker；泳道2：破菌上清液；泳道3：纯化后)

图2序列优化前后重组蛋白表达水平对比图(泳道1：Marker；泳道2：原有序列；泳道3：优化序列)

图3不同pH值条件下的相对酶活

具体实施方式

实施例1、重组乳酸脱氢酶突变体的制备

一、制备方法

1、乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1编码的重组乳酸脱氢酶突变体序列的设计

根据菌株Lactobacillus bulgaricus的基因组测序结果，对LbLDH1基因的序列进行点突变优化，将63位谷氨酸突变为亮氨酸，将192位缬氨酸突变为蛋氨酸，将211位天冬氨酸突变为赖氨酸，然后采用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子，优化后的序列如SEQ IDNO.1所示，表达得到的乳酸脱氢酶突变的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1

GAATTCATGACCAAAATTTTTGCGTATGCGATTCGTGAAGATGAAAAACCGTTCCTGAAAGAATGGGAAGATGCGCACAAAGATGTGGAAGTGGAATACACCGATAAACTGCTGACCCCGGAAACCGTGGCCCTGGCCAAAGGTGCCGATGGTGTTGTTGTTTACCAGCAGCTGGATTACACCGCGCTGACCCTGCAGGCGCTGGCAGATAACGGTATTACCAAAATGAGCCTGCGTAACGTGGGTGTGGATAACATTGATATGGCGAAAGCGAAAGAACTGGGTTTCCAGATTACCAACGTGCCGGTTTACAGCCCGAACGCGATTGCGGAACACGCCGCGATTCAGGCGGCCCGCATTCTGCGTCAGGATAAAGCCATGGATGAAAAAGTGGCCCGTCATGATCTGCGTTGGGCACCGACCATTGGCCGTGAAGTTCGCGATCAGGTGGTTGGTGTGATTGGTACCGGCCACATCGGCCAGGTTTTCATGCAGATTATGGAAGGCTTCGGCGCGAAAGTTATTGCGTATGATATTTTCCGCAACCCGGAACTGGAAAAGAAAGGCTATTACATGGACTCACTGGACGACCTGTACAAACAGGCGGACGTGATTAGCCTGCACGTTCCGAAAGTTCCGGCGAACGTTCACATGATCAACGACGAAAGCATCGCGAAAATGAAGCAGGACGTAGTTATCGTTAACGTAAGCCGTGGTCCGCTGGTTGACACCGACGCGGTTATCCGTGGTCTGGACAGCGGCAAGATCTTTGGTTACGCAATGGACGTTTACGAAGGTGAAGTTGGCATCTTTAACGAAGACTGGGAAGGCAAGGAGTTTCCGGACGCACGTCTGGCTGACCTGATCGCTCGTCCGAACGTTCTGGTGACCCCGCACACCGCTTTCTACACTACTCACGCCGTTCGCAACATGGTAGTTAAAGCCTTCGACAACAACCTGGAACTGGTTGAAGGCAAAGAAGCCGAAACTCCGGTTAAAGTTGGCTAACTCGAG

SEQ ID NO.2

EFMTKIFAYAIREDEKPFLKEWEDAHKDVEVEYTDKLLTPETVALAKGADGVVVYQQLDYTALTLQALADNGITKMSLRNVGVDNIDMAKAKELGFQITNVPVYSPNAIAEHAAIQAARILRQDKAMDEKVARHDLRWAPTIGREVRDQVVGVIGTGHIGQVFMQIMEGFGAKVIAYDIFRNPELEKKGYYMDSLDDLYKQADVISLHVPKVPANVHMINDESIAKMKQDVVIVNVSRGPLVDTDAVIRGLDSGKIFGYAMDVYEGEVGIFNEDWEGKEFPDARLADLIARPNVLVTPHTAFYTTHAVRNMVVKAFDNNLELVEGKEAETPVKVG

在优化后的LbLDH1序列的两端分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，将优化后的序列直接进行全基因合成，得目的片段。

2、乳酸脱氢酶突变体重组质粒的构建

将目的片段用EcoRⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切后，连接到同样用EcoRⅠ和XhoⅠ酶双酶切后的pET 28a(+)载体上，连接好的质粒导入到感受态大肠杆菌DH5α中，进行梯度稀释后涂平板，然后将平板放置到37℃培养箱过夜培养，次日挑取单克隆接种到5ml含有卡拉霉素(Kan)的LB培养基中，37℃、160rpm，培养过夜，提取质粒。将质粒送测序，测序正确的质粒命名为pET 28a-LbLDH1。

3、乳酸脱氢酶突变体重组基因工程菌的构建及诱导表达

将测序正确的重组质粒pET 28a-LbLDH1导入到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，进行梯度稀释后涂平板，然后将平板放置到37℃培养箱过夜培养，次日挑取单克隆接种到5ml含有Kan的LB培养基中，37℃、160rpm培养过夜，取1ml菌液接种到500ml含有Kan的LB培养基中，37℃、200rpm培养，待OD值达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃、200rpm诱导表达12h。培养完成后，5000g、4℃离心5min收集菌体。

取离心收集的菌体，称量湿重后，按照菌湿重与缓冲液1:10的比例加入50mMpH8.0的Tris缓冲液进行重悬，待液体搅拌均匀后，用高压匀质机800bar进行破菌2次，破菌液10000g离心10min，收集上清液即可得到粗酶液。

4、乳酸脱氢酶突变体的分离纯化

取破菌上清液5ml，上样到预先用50mM pH8.0Tris平衡好的2ml NiSepharose 6FF小预柱上，待上样完成后用50mM Tris 500mM NaCl 20mM咪唑pH8.0的缓冲液淋洗到没有杂蛋白洗脱为止，然后用50mM Tris 500mMNaCl 250mM咪唑pH8.0的缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白峰；将收集到的目的蛋白上样到Superdex 75 10/300GL层析柱进行分离，缓冲液为50mMpH8.0Tris，收集目的蛋白峰经过SDS-PAGE电泳检测为单一条带，与理论分子量一致，具体结果见图1。

以下通过实验例的方式验证本发明的有益效果：

实验例1乳酸脱氢酶及其突变体粗酶液活性测定和表达水平比较

1、原料

乳酸脱氢酶突变体粗酶液按照权利要求的方法制备；乳酸脱氢酶粗酶液的制备方法，除了乳酸脱氢酶未经过63位谷氨酸突变、192位缬氨酸突变和211位天冬氨酸突变以外，其余同实施例1。

乳酸脱氢酶的氨基酸如SEQ ID NO.3所示，其对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示

SEQ ID NO.3

EFMTKIFAYAIREDEKPFLKEWEDAHKDVEVEYTDKLLTPETVALAKGADGVVVYQQLDYTAETLQALADNGITKMSLRNVGVDNIDMAKAKELGFQITNVPVYSPNAIAEHAAIQAARILRQDKAMDEKVARHDLRWAPTIGREVRDQVVGVIGTGHIGQVFMQIMEGFGAKVIAYDIFRNPELEKKGYYVDSLDDLYKQADVISLHVPDVPANVHMINDESIAKMKQDVVIVNVSRGPLVDTDAVIRGLDSGKIFGYAMDVYEGEVGIFNEDWEGKEFPDARLADLIARPNVLVTPHTAFYTTHAVRNMVVKAFDNNLELVEGKEAETPVKVG

SEQ ID NO.4

GAATTCATGACTAAAATTTTTGCTTACGCAATTCGTGAAGATGAAAAGCCATTCTTGAAGGAATGGGAAGACGCTCACAAGGACGTCGAAGTTGAATACACTGACAAGCTTTTGACCCCAGAAACTGTTGCTTTGGCAAAGGGTGCTGACGGTGTTGTTGTTTACCAACAACTTGACTACACCGCTGAAACTCTGCAAGCTTTGGCAGACAACGGCATCACTAAGATGAGCCTGCGTAACGTTGGTGTTGACAACATCGACATGGCTAAGGCTAAGGAACTTGGCTTCCAAATCACCAACGTTCCAGTTTACTCACCAAACGCCATCGCAGAACACGCTGCTATCCAAGCTGCCCGCATCCTGCGTCAAGACAAGGCTATGGACGAAAAGGTTGCCCGTCACGACTTGCGTTGGGCACCAACTATCGGCCGTGAAGTTCGCGACCAAGTTGTTGGTGTTATAGGTACTGGCCACATCGGTCAAGTCTTCATGCAAATCATGGAAGGCTTCGGCGCTAAGGTTATCGCTTACGACATCTTCCGCAACCCAGAATTGGAAAAGAAGGGCTACTACGTAGACTCACTTGACGACCTGTACAAGCAAGCTGACGTTATTTCCCTGCACGTTCCTGACGTTCCAGCTAACGTTCACATGATCAACGACGAGTCAATCGCTAAAATGAAGCAAGACGTAGTTATCGTTAACGTATCACGTGGTCCATTGGTTGACACTGACGCGGTTATCCGTGGTTTGGACTCAGGCAAGATCTTCGGTTACGCAATGGACGTTTACGAAGGTGAAGTTGGCATCTTCAACGAAGACTGGGAAGGCAAGGAGTTCCCAGACGCACGTTTAGCTGACTTAATCGCTCGTCCAAACGTTCTGGTAACTCCACACACTGCTTTCTACACTACTCACGCTGTTCGCAACATGGTAGTTAAGGCCTTCGACAACAACCTTGAATTGGTTGAAGGCAAGGAAGCTGAAACTCCAGTTAAGGTTGGCTAACTCGAG

2、检测方法

酶活检测：取粗酶液用50mM pH8.0的Tris缓冲液稀释后，加入到混合均匀的总反应体系(50mM Tris缓冲液pH8.0，0.3mM NADH，8mM丙酮酸钠)中，于30℃反应，在340nm处检测反应体系的吸收值变化。

表达水平的检测：取粗酶液采用SDS-PAGE电泳进行检测，对比序列优化前后蛋白的表达水平。

3、检测结果

酶活结果见表1，其中酶活性单位(U)定义为：在上述条件下，每一分钟催化1μmolNADH所用的酶量即为1U，结果见表1。

表1按酶活检测体系及条件进行检测的比活性

酶	单位酶活	2-8℃存放5天后单位酶活
			原始序列	292U/ml	285U/ml
优化序列	1540U/ml	1507U/ml

结果显示：与未进行突变的重组乳酸脱氢酶相比，本发明突变的乳酸脱氢酶的酶活提高了五倍以上，且粗酶液在低温下可以存放5天，酶活无明显损失。

表达水平的结果如图2所示，本方法突变后的重组蛋白的表达水平明显优于未突变的蛋白的表达水平。

实施例2：乳酸脱氢酶及其突变体粗酶液在不同pH值范围下的活性检测

1、原料

2、检测方法

酶活检测的反应体系同实验例1，调节体系中Tris缓冲液至不同pH值以适应不同pH值条件下的酶活检测，在pH 6.0～7.5之间时，则将体系中的Tris替换为磷酸盐缓冲液。

3、检测结果

结果见图3。

由图3可以看出，对原有序列进行氨基酸突变后，其最适pH值提高了一个单位在pH值8.0附近，优化后的突变体对于高pH值有更好的耐受性，更有利于酶在偏碱性环境下的运用。

序列表

<110> 四川自豪时代药业有限公司

<120> 一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法

<130> GY003-18P1478

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1014

<212> DNA

<213> 目标蛋白的核苷酸序列(artificial)

<400> 1

gaattcatga ccaaaatttt tgcgtatgcg attcgtgaag atgaaaaacc gttcctgaaa 60

gaatgggaag atgcgcacaa agatgtggaa gtggaataca ccgataaact gctgaccccg 120

gaaaccgtgg ccctggccaa aggtgccgat ggtgttgttg tttaccagca gctggattac 180

accgcgctga ccctgcaggc gctggcagat aacggtatta ccaaaatgag cctgcgtaac 240

gtgggtgtgg ataacattga tatggcgaaa gcgaaagaac tgggtttcca gattaccaac 300

gtgccggttt acagcccgaa cgcgattgcg gaacacgccg cgattcaggc ggcccgcatt 360

ctgcgtcagg ataaagccat ggatgaaaaa gtggcccgtc atgatctgcg ttgggcaccg 420

accattggcc gtgaagttcg cgatcaggtg gttggtgtga ttggtaccgg ccacatcggc 480

caggttttca tgcagattat ggaaggcttc ggcgcgaaag ttattgcgta tgatattttc 540

cgcaacccgg aactggaaaa gaaaggctat tacatggact cactggacga cctgtacaaa 600

caggcggacg tgattagcct gcacgttccg aaagttccgg cgaacgttca catgatcaac 660

gacgaaagca tcgcgaaaat gaagcaggac gtagttatcg ttaacgtaag ccgtggtccg 720

ctggttgaca ccgacgcggt tatccgtggt ctggacagcg gcaagatctt tggttacgca 780

atggacgttt acgaaggtga agttggcatc tttaacgaag actgggaagg caaggagttt 840

ccggacgcac gtctggctga cctgatcgct cgtccgaacg ttctggtgac cccgcacacc 900

gctttctaca ctactcacgc cgttcgcaac atggtagtta aagccttcga caacaacctg 960

gaactggttg aaggcaaaga agccgaaact ccggttaaag ttggctaact cgag 1014

<210> 2

<211> 335

<212> PRT

<213> 目标蛋白的氨基酸序列(artificial)

<400> 2

Glu Phe Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys

1 5 10 15

Pro Phe Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu

20 25 30

Tyr Thr Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Val Ala Leu Ala Lys Gly

35 40 45

Ala Asp Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Leu Thr

50 55 60

Leu Gln Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn

65 70 75 80

Val Gly Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe

85 90 95

Gln Ile Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His

100 105 110

Ala Ala Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Asp Lys Ala Met Asp

115 120 125

Glu Lys Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg

130 135 140

Glu Val Arg Asp Gln Val Val Gly Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly

145 150 155 160

Gln Val Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala

165 170 175

Tyr Asp Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Met

180 185 190

Asp Ser Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His

195 200 205

Val Pro Lys Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Glu Ser Ile

210 215 220

Ala Lys Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Pro

225 230 235 240

Leu Val Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Ile

245 250 255

Phe Gly Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Ile Phe Asn

260 265 270

Glu Asp Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu

275 280 285

Ile Ala Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr

290 295 300

Thr His Ala Val Arg Asn Met Val Val Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu

305 310 315 320

Glu Leu Val Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Pro Val Lys Val Gly

325 330 335

<210> 3

<211> 335

<212> PRT

<213> 乳酸脱氢酶的氨基酸序列(Lactobacillaceae Lactobacillus)

<400> 3

Glu Phe Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys

1 5 10 15

Pro Phe Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu

20 25 30

Tyr Thr Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Val Ala Leu Ala Lys Gly

35 40 45

Ala Asp Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr

50 55 60

Leu Gln Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn

65 70 75 80

Val Gly Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe

85 90 95

Gln Ile Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His

100 105 110

Ala Ala Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Asp Lys Ala Met Asp

115 120 125

Glu Lys Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg

130 135 140

Glu Val Arg Asp Gln Val Val Gly Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly

145 150 155 160

Gln Val Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala

165 170 175

Tyr Asp Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val

180 185 190

Asp Ser Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His

195 200 205

Val Pro Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Glu Ser Ile

210 215 220

Ala Lys Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Pro

225 230 235 240

Leu Val Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Ile

245 250 255

Phe Gly Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Ile Phe Asn

260 265 270

Glu Asp Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu

275 280 285

Ile Ala Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr

290 295 300

Thr His Ala Val Arg Asn Met Val Val Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu

305 310 315 320

Glu Leu Val Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Pro Val Lys Val Gly

325 330 335

<210> 4

<211> 1014

<212> DNA

<213> 乳酸脱氢酶的核苷酸序列(Lactobacillaceae Lactobacillus)

<400> 4

gaattcatga ctaaaatttt tgcttacgca attcgtgaag atgaaaagcc attcttgaag 60

gaatgggaag acgctcacaa ggacgtcgaa gttgaataca ctgacaagct tttgacccca 120

gaaactgttg ctttggcaaa gggtgctgac ggtgttgttg tttaccaaca acttgactac 180

accgctgaaa ctctgcaagc tttggcagac aacggcatca ctaagatgag cctgcgtaac 240

gttggtgttg acaacatcga catggctaag gctaaggaac ttggcttcca aatcaccaac 300

gttccagttt actcaccaaa cgccatcgca gaacacgctg ctatccaagc tgcccgcatc 360

ctgcgtcaag acaaggctat ggacgaaaag gttgcccgtc acgacttgcg ttgggcacca 420

actatcggcc gtgaagttcg cgaccaagtt gttggtgtta taggtactgg ccacatcggt 480

caagtcttca tgcaaatcat ggaaggcttc ggcgctaagg ttatcgctta cgacatcttc 540

cgcaacccag aattggaaaa gaagggctac tacgtagact cacttgacga cctgtacaag 600

caagctgacg ttatttccct gcacgttcct gacgttccag ctaacgttca catgatcaac 660

gacgagtcaa tcgctaaaat gaagcaagac gtagttatcg ttaacgtatc acgtggtcca 720

ttggttgaca ctgacgcggt tatccgtggt ttggactcag gcaagatctt cggttacgca 780

atggacgttt acgaaggtga agttggcatc ttcaacgaag actgggaagg caaggagttc 840

ccagacgcac gtttagctga cttaatcgct cgtccaaacg ttctggtaac tccacacact 900

gctttctaca ctactcacgc tgttcgcaac atggtagtta aggccttcga caacaacctt 960

gaattggttg aaggcaagga agctgaaact ccagttaagg ttggctaact cgag 1014

Claims

1.一种重组乳酸脱氢酶突变体，其特征在于：它是在将乳酸脱氢酶的氨基酸序列第63位谷氨酸突变为亮氨酸，将192位缬氨酸突变为蛋氨酸，将211位天冬氨酸突变为赖氨酸的突变体；所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1，其特征在于：所述LbLDH1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

3.一种重组载体，其特征在于：它包括权利要求2所述的乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组pET-22b（+）载体、重组pET-28a（+）载体或重组pET-32a（+）载体。

5.一种重组菌，其特征在于：它包括权利要求3或4所述的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组E.coli DH5α、重组E.coli BL21(DE3)、重组E.coli Top10或重组E.coli JM109。

8.一种利用权利要求5-7任一项所述重组菌发酵的方法，其特征在于：取重组菌的单克隆，接种到含有Kan的LB液体培养基中，于摇床中培养过夜，取菌液接种到含有Kan的LB液体培养基中，于摇床中扩大培养后，再加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达；培养完成后，收集菌体，按菌体湿重与破菌缓冲液1:3~1:10的比例混合，搅拌均匀后，用高压均质机进行菌体破碎，压力为300-900bar，离心收集上清液即为粗酶液。

9.根据权利要求8所述的重组菌发酵的方法，其特征在于：所述摇床中培养过夜的温度37℃、转速160rpm；和/或，所述摇床中扩大培养的温度37℃、转速200rpm；和/或，所述IPTG的加入时间是OD值达到0.6时；和/或，所述诱导表达的条件是温度25℃、转速200rpm，时间12h；和/或，所述收集菌体的条件是5000g、温度4℃，离心5min；和/或，所述破菌缓冲液是磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，破菌缓冲液pH值范围是pH 7.5~8.5，浓度是10~100mM；和/或，所述高压均质机破菌压力为300-900bar，破菌次数2次。

10.根据权利要求9所述的重组菌发酵方法，其特征在于：破菌缓冲液pH值为8.0。

11.一种乳酸脱氢酶突变体的分离纯化方法，其特征在于：它是将权利要求8所得粗酶液上样到2ml Ni Sepharose 6 FF预柱上，待上样完成后用缓冲液淋洗到没有杂蛋白洗脱为止，然后用缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白峰，再将收集到的目的蛋白上样到Superdex75 10/300GL层析柱，用缓冲液进行分离，收集目的蛋白。

12.根据权利要求11所述的一种乳酸脱氢酶突变体的分离纯化方法，其特征在于：所述Ni Sepharose 6 FF预柱需要预先用50mM pH8.0 Tris平衡；和/或，淋洗采用的缓冲液为50mM Tris、 500mM NaCl、20mM咪唑组成的pH8.0的混合液；和/或，梯度洗脱采用的缓冲液为50mM Tris、 500mM NaCl、250mM咪唑组成的pH8.0的混合液；和/或，分离采用的缓冲液为50mM pH8.0 Tris。