CN106520870B - 外源表达破伤风毒素受体结合区Hc的高密度发酵方法 - Google Patents

外源表达破伤风毒素受体结合区Hc的高密度发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种外源高表达破伤风毒素受体结合区Hc的发酵方法，步骤如下：(1)取含有破伤风毒素受体结合区Hc核苷酸序列的工程菌，培养至OD600值为3.0‑5.0，得种子液；(2)取种子液，加入发酵培养基中培养，至溶氧值及pH值快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min、溶氧值大于10％/min时，补料；(3)当OD600值为17时进行诱导表达，加入终浓度为0.2mM的IPTG，降温至28℃，继续补料，培养至OD600值为40‑50。本发明方可以高表达获得可溶性的破伤风毒素受体结合区Hc，且发酵工艺简便，成本低廉，可应用于大规模生产制备破伤风Hc亚单位疫苗，应用前景良好。

Description

外源表达破伤风毒素受体结合区Hc的高密度发酵方法
技术领域
本发明涉及外源表达破伤风毒素受体结合区Hc的高密度发酵方法。
背景技术
破伤风是一种严重危害人类生命健康的疾病，它是由破伤风梭菌感染伤口后，在缺氧的条件下繁殖并产生破伤风神经毒素，毒素大部分进入血液系统，经机体吸收进入神经系统，并作用于中枢神经系统，抑制神经递质的释放，阻断神经与肌肉间信息的传递，导致呼吸功能紊乱，进而发生循环障碍和血液动力学的扰乱，出现脱水、酸中毒。破伤风毒素的毒性非常强烈，约100ng的破伤风毒素便可以致人死亡。据估计，世界上每年约有100万病例发生，死亡率在50％左右。在发展中国家，新生儿破伤风死亡率高达90％。寻找高效、安全的破伤风预防和治疗药物是各国致力的方向。
破伤风毒素可被蛋白酶裂解成由二硫键连接的轻链和重链，根据毒素在体内的作用，可将其分为A、B、C，3个部分(每部分分子量均为50kD)，分别起到结合、导入和麻痹的作用，从而抑制神经递质的释放。天然C片段(Hc)是重链的C端，保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质，免疫效价与毒素相当，过敏原性低，可用于制备亚单位疫苗。
传统的破伤风类毒素疫苗是破伤风毒素经甲醛脱毒、精制而成的，而接种类毒素后有一定的副反应发生，甲醛处理类毒素容易造成污染，处理后的类毒素还可能发生毒性逆转。因此，现有的类毒素疫苗还需进一步改进和发展。开发新型的基因工程疫苗是方向之一。国内外许多研究中对破伤风Hc段的表达进行了改进，利用大肠杆菌已经获得了重组Hc蛋白的可溶性表达产物，如，申请号为200910135972的专利申请公开了体外表达破伤风毒素亚单位疫苗Hc的重组菌以及重组表达方法，但是，表达水平低，其可溶性目的蛋白表达量仅300mg/L。
高密度发酵培养是提高表达量的一种方式，但是由于发酵的过程非常复杂，受到许多因素的影响，如微生物生长所需营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶解氧浓度及补料方式等，因此，要通过高密度发酵实现高表达目标蛋白并不容易。目前Hc蛋白的基因工程菌的高密度发酵培养研究却一直没有进展，仍达不到大规模生产的需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种外源高表达破伤风毒素受体结合区Hc的高密度发酵方法。
本发明外源高表达破伤风毒素受体结合区Hc的发酵方法，步骤如下：
(1)取含有破伤风毒素受体结合区Hc核苷酸序列的工程菌，培养至OD600值为3.0-5.0，得种子液；
(2)取种子液，加入发酵培养基中培养，至溶氧值及pH值快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min、溶氧值大于10％/min时，补料；
(3)当OD600值为17时进行诱导表达，加入终浓度为0.2mM的IPTG，降温至28℃，继续补料，培养至OD600值为40-50。
步骤(1)中，所述工程菌是含有SEQ ID NO.1的所示DNA序列的大肠杆菌。本发明表达破伤风毒素亚单位疫苗Hc的大肠杆菌BL21(DE3)，是公开号为101880675A的专利申请实施例二中转化有pET32a-Tet-Hc质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)，其含有SEQ ID NO.1的所示用于编码破伤风毒素受体结合区Hc的DNA序列，按照该专利申请的实施例一和实施例二的方法制备。
SEQ ID NO.1的所示DNA序列如下：
步骤(1)中，培养基为LB培养基。
步骤(2)中，所述发酵培养基每1L含有如下组分：
Tryptone 8～10g
Yeast Extract 2.5～5g
NaCl 0.5～1.0g
Na2HPO4·12H2O 14～16g
KH2PO4 3～4g
NH4Cl 1.8～2.0g
泡敌 0.35～0.4ml，
其余为水。
步骤(2)中，所述种子液按照1:30的比例加入发酵培养基中；所述培养在温度为37℃、pH为7.00、溶氧值为40％的条件下培养。
步骤(2)中，补料的初始补料速度7.5ml/min，一小时后补料速度为9.75ml/min，两小时后补料速度为12.6ml/min，三小时后补料速度为16.4ml/min，四小时后补料速度为21.3ml/min，五小时后补料速度为27.7ml/min，六小时后补料速度为36ml/min。
步骤(3)中，继续补料的速度为：从步骤(2)开始补料的时间计算，一小时后的补料速度为7.5ml/min，两小时后补料速度为9.75ml/min，三小时后补料速度为12.6ml/min，四小时后补料速度为16.4ml/min，五小时后补料速度为21.3ml/min，六小时后补料速度为27.7ml/min，七小时后补料速度为36ml/min。
步骤(2)和(3)中，所述补料用的培养基每1L含有如下组分：
无水葡萄糖 490～500g
MgSO4·7H2O 22～25g
ZnCl2 0.05～0.075g
FeCl3·6H2O 0.675～1.012g
CuSO4·5H2O 0.05～0.071g
Na2MoO4·2H2O 0.05～0.075g
CaCl2 0.05～0.075g
H3BO3 0.015～0.02g
CoCl2·6H2O 0.05～0.075g
MnSO4·H2O 0.08～0.095g
盐酸 3.5～3.8ml
维生素B1 0.003～0.004g
核黄素 0.008～0.016g
泛酸 0.05～0.075g
烟酸 0.15～0.225g
吡哆醇 0.045～0.053g
生物素 0.002～0.003g
叶酸 0.001～0.002g
NaOH 0.165～0.25g。
本发明还提供了前述破伤风毒素受体结合区Hc的制备方法，取前述方法制备得到的发酵液，离心，收集菌体，破菌，取上清，纯化，即可。
其中，所述纯化的方法是：将上清液过QFF柱进行阴离子交换，用20mM Tris-HCl缓冲液平衡后，用含0-0.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱；含有目的蛋白的洗脱液加入终浓度为0.5M的(NH4)2SO4后，过苯基疏水柱进行下一步纯化；目的蛋白用含浓度0.5-0M的(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱；含有目的蛋白的洗脱液用脱盐柱置换缓冲液为20mM NaAc(pH4.0)后，过SP柱进行阳离子交换，目的蛋白用含0-0.5M NaCl的20mM NaAc(pH 4.0)缓冲液进行梯度洗脱，即可。
本发明方法通过特定的补料方式以及其他条件的配合，可以高表达获得可溶性的破伤风毒素受体结合区Hc，且发酵工艺简便，成本低廉，可应用于大规模生产制备破伤风Hc亚单位疫苗，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为纯化后破伤风毒素受体结合区Hc蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳图。其中1为对比例1中BL21(DE3)菌表达的Hc；2为实施例1中BL21(DE3)菌表达的Hc蛋白稀释6倍进行电泳；3为实施例1中BL21(DE3)菌表达的Hc蛋白；4为对比例2中恒速补料对照BL21(DE3)菌表达的Hc蛋白；M为蛋白分子量标准。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规操作，例如程丽娟、薛泉宏主编的《微生物学实验技术》。
本发明使用的培养基如下：
表1.LB培养基配方
组分 浓度
Tryptone 10g/L
Yeast Extract 5g/L
NaCl 10g/L
其余为水
表2.基础培养基配方
组分 含量
Tryptone 8～10g/L
Yeast Extract 2.5～5g/L
NaCl 0.5～1.0g/L
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 14～16g/L
KH<sub>2</sub>PO4 3～4g/L
NH<sub>4</sub>Cl 1.8～2.0g/L
泡敌 0.35～0.4ml/L
其余为水
表3.补料的培养基配方
组分 含量
无水葡萄糖 490～500g/L
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 22～25g/L
ZnCl<sub>2</sub> 0.05～0.075g/L
FeCl<sub>3</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.675～1.012g/L
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.05～0.071g/L
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.05～0.075g/L
CaCl<sub>2</sub> 0.05～0.075g/L
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 0.015～0.02g/L
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.05～0.075g/L
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 0.08～0.095g/L
盐酸 3.5～3.8ml/L
维生素B1 0.003～0.004g/L
核黄素 0.008～0.016g/L
泛酸 0.05～0.075g/L
烟酸 0.15～0.225g/L
吡哆醇 0.045～0.053g/L
生物素 0.002～0.003g/L
叶酸 0.001～0.002g/L
NaOH 0.165～0.25g/L
其余为水
实施例1本发明破伤风毒素亚单位疫苗Hc的大肠杆菌高密度发酵
一、发酵方法
1.种子的活化
本发明表达破伤风毒素亚单位疫苗Hc的大肠杆菌BL21(DE3)，是公开号为101880675A的专利申请实施例二中转化有pET32a-Tet-Hc质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)，其含有SEQ ID NO.1的所示DNA序列，按照该专利申请的实施例一和实施例二的方法制备。
配制50ml LB培养基装于250ml三角瓶中。121℃灭菌30min，冷却。取出冻存的工作种子一支解冻。使用无菌操作，先往已灭菌的50ml LB培养基加入氨苄青霉素溶液使其终浓度为100mg/ml，然后接入整支工作种子。温度37℃，摇速220rpm，培养8-12小时。次日使用无菌操作取样，显微镜检查如无杂菌则可用于下一步操作。
从一级种子中取出20mL按照1:50的比例接入活化后的种子。开启摇床调整温度至37℃，摇速220rpm，培养8-12小时，生物量达到OD600值为3.0-5.0时作为二级种子。
2.发酵罐培养
按照1:30的比例将种子培养液转入发酵罐30L基础培养基中培养，控制温度为37℃，pH为7.00，溶氧值为40％。其中，pH用氨水来控制；溶氧值通过调节搅拌转速和空气流量来提高，初始搅拌转速为150rpm，最大转速可达400rpm，初始空气流量为1L/min，最大空气流量可达6L/min。
发酵刚开始不补料，当溶氧及pH值快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min，溶氧值大于10％/min时，开始补料。补料工艺：初始补料一个小时以内的补料速度7.5ml/min，一小时后补料速度为9.75ml/min，两小时后补料速度为12.6ml/min，三小时后补料速度为16.4ml/min，四小时后补料速度为21.3ml/min，五小时后补料速度为27.7ml/min，六小时后补料速度为36ml/min。
3.诱导表达外源蛋白
当OD600值为17时进行诱导表达，加入终浓度为0.2mM的IPTG，降温至28℃，继续补料，培养至OD600值为40-50，结束发酵。
开始诱导后的细胞消耗能源物质速率会降低一些，因此继续补料速度需下调一级，例如诱导是在补料开始的第二小时，此时补料速度为9.75ml/min，降温后应将补料速度调整为7.5ml/min，一小时后补料速度增大为9.75ml/min，如果在初始补料一小时以内进入诱导阶段，则初始补料一个小时以内的补料速度仍然为7.5ml/min。
也就是说，诱导表达后的补料工艺为：从初始补料开始计算，初始补料一小时内的补料速度为7.5ml/min，一小时后的补料速度为7.5ml/min，两小时后补料速度为9.75ml/min，三小时后补料速度为12.6ml/min，四小时后补料速度为16.4ml/min，五小时后补料速度为21.3ml/min，六小时后补料速度为27.7ml/min，七小时后补料速度为36ml/min。
4、纯化
诱导结束后的发酵液经10,000g，4℃离心收集菌体，菌体用20mMTris-HCl缓冲液(pH 8.5)重悬后匀浆碎菌。12,000g，4℃离心收集上清。上清液过QFF柱进行阴离子交换，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)平衡后，用含0-0.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱。含有目的蛋白的洗脱液加入终浓度为0.5M的(NH4)2SO4后，过苯基疏水柱进行下一步纯化。目的蛋白用含浓度0.5-0M的(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱。含有目的蛋白的洗脱液用脱盐柱置换缓冲液为20mM NaAc(pH4.0)后，过SP柱进行阳离子交换，目的蛋白用含0-0.5M NaCl的20mM NaAc(pH 4.0)缓冲液进行梯度洗脱。经QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步纯化后，即得纯度大于95％以上的目标蛋白：破伤风毒素亚单位疫苗Hc。
二、检测
经过检测诱导结束后的发酵液经10,000g，4℃离心收集菌体，菌体湿重为86g/L，经过进一步纯化后得到的目标蛋白的得率为0.8g/L(图1)。
对比例1破伤风毒素亚单位疫苗Hc的普通发酵
一、发酵方法
1.种子的活化
活化方法同实施例1。
2.发酵罐培养
按照1:30的比例将种子培养液转入发酵罐30L基础培养基中培养，控制温度为37℃，pH为7.00，溶氧值为40％。其中，pH用氨水来控制；搅拌转速一直维持为400rpm，空气流量维持在6L/min。本发酵方法不补料。
3.诱导表达外源蛋白
当OD600值生长约为17时进行诱导，加入终浓度为0.2mM的IPTG，降温至28℃，继续培养6h。
二、检测
菌体收集以及纯化方法同实施例1。经检测，离心收集菌体湿重为8g/L。纯化结果显示可溶性目的蛋白的得率为0.15g/L。
对比例2破伤风毒素亚单位疫苗Hc的间歇补料分批发酵
一、发酵方法
1.种子的活化
活化方法同实施例1。
2.发酵罐培养
按照1:30的比例将种子培养液转入发酵罐30L基础培养基中培养，控制温度为37℃，pH为7.00，溶氧值为40％。其中，pH用氨水来控制；溶氧值通过调节搅拌转速和空气流量来提高，初始搅拌转速为150rpm，最大转速可达400rpm，初始空气流量为1L/min,最大空气流量可达6L/min。
发酵刚开始不补料，当溶氧及pH值不可逆转的快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min，溶氧值大于10％/min时，开始补料。采用间歇定量流加方式继续培养，每间隔1h，每次流加450ml的补料液，共流加6-7次。
3.诱导表达外源蛋白
诱导方法同对比例1。
二、检测
菌体收集以及纯化方法同实施例1。经检测，离心收集菌体湿重为29g/L。纯化结果显示可溶性目的蛋白的得率为0.4g/L。
实验结果说明，只有采用本发明特定的发酵方式，才能高表达得到目标产物，而采用其他补料方式或者不补料，则产量较低，本发明方法的产量高，成本低，工业应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川自豪时代药业有限公司
中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120> 外源表达破伤风毒素受体结合区Hc的高密度发酵方法
<130> GY003-16P1604
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1353
<212> DNA
<213> 编码破伤风毒素受体结合区Hc的DNA 序列
<400> 1
aaaaaccttg attgttgggt cgacaacgaa gaagacatcg atgttatcct gaaaaagtct 60
accattctga acttggacat caacaacgat attatctccg acatctctgg tttcaactcc 120
tctgttatca catatccaga tgctcaattg gtgccgggca tcaacggcaa agctatccac 180
ctggttaaca acgaatcttc tgaagttatc gtgcacaagg ccatggacat cgaatacaac 240
gacatgttca acaacttcac cgttagcttc tggctgcgcg ttccgaaagt ttctgcttcc 300
cacctggaac agtacgacac taacgagtac tccatcatca gctctatgaa gaaatactcc 360
ctgtccatcg gctctggttg gtctgtttcc ctgaagggta acaacctgat ctggactctg 420
aaagactccg cgggcgaagt tcgtcagatc actttccgcg acctgtctga caagttcaac 480
gcgtacctgg ctaacaaatg ggttttcatc actatcacta acgatcgtct gtcttctgct 540
aacctgtaca tcaacggcgt tctgatgggc tccgctgaaa tcactggtct gggcgctatc 600
cgtgaggaca acaacatcac tcttaagctg gaccgttgca acaacaacaa ccagtacgta 660
tccatcgaca agttccgtat cttctgcaaa gcactgaacc cgaaagagat cgaaaaactg 720
tataccagct acctgtctat caccttcctg cgtgacttct ggggtaaccc gctgcgttac 780
gacaccgaat attacctgat cccggtagct tacagctcta aagacgttca gctgaaaaac 840
atcactgact acatgtacct gaccaacgcg ccgtcctaca ctaacggtaa actgaacatc 900
tactaccgac gtctgtacag cggcctgaaa ttcatcatca aacgctacac tccgaacaac 960
gaaatcgatt ctttcgttcg ctctggtgac ttcatcaaac tgtacgtttc ttacaacaac 1020
aacgaacaca tcgttggtta cccgaaagac ggtaacgctt tcaacaacct ggacagaatc 1080
ctaagagtag gttacaacgc tccgggtatc ccgctgtaca aaaaaatgga agctgttaaa 1140
ctgcgtgacc tgaaaaccta ctctgttcag ctgaaactgt acgacgacaa agatgcttct 1200
ctgggtctgg ttggcaccca caacggtcag atcggtaacg acccgaaccg tgacatcctg 1260
atcgcttcta actggtactt caaccacctg aaagacaaaa ccctgacctg cgactggtac 1320
ttcgttccga ccgatgaagg ttggaccaac gac 1353

Claims (6)

1.一种外源高表达破伤风毒素受体结合区Hc的发酵方法，其特征在于：步骤如下：
（1）取含有SEQ ID NO.1 的所示DNA 序列的大肠杆菌，培养至OD600值为3.0-5.0，得种子液；
（2）取种子液，加入发酵培养基中培养，至溶氧值及pH值快速上升，且pH的上升幅度大于0.2/min、溶氧值大于10%/min时，补料；补料的初始补料速度7.5ml/min，一小时后补料速度为9.75ml/min，两小时后补料速度为12.6ml/min，三小时后补料速度为16.4ml/min，四小时后补料速度为21.3ml/min，五小时后补料速度为27.7ml/min，六小时后补料速度为36ml/min；
（3）当OD600值为17时进行诱导表达，加入终浓度为0.2mM的IPTG，降温至28℃，继续补料，培养至 OD600值为40-50；继续补料的速度为：从初始补料开始计算，一小时内的补料速度为7.5ml/min，一小时后的补料速度为7.5ml/min，两小时后补料速度为9.75ml/min，三小时后补料速度为12.6ml/min，四小时后补料速度为16.4ml/min，五小时后补料速度为21.3ml/min，六小时后补料速度为27.7ml/min，七小时后补料速度为36ml/min；
步骤（2）和（3）中，所述补料用的培养基每1L含有如下组分：
无水葡萄糖 490-500g
MgSO4•7H2O 22-25g
ZnCl2 0.05-0.075g
FeCl3•6H2O 0.675-1.012g
CuSO4•5H2O 0.05-0.071g
Na2MoO4•2H2O 0.05-0.075g
CaCl2 0.05-0.075g
H3BO3 0.015-0.02g
CoCl2•6H2O 0.05-0.075g
MnSO4•H2O 0.08-0.095g
盐酸 3.5-3.8ml
维生素B1 0.003-0.004g
核黄素 0.008-0.016g
泛酸 0.05-0.075g
烟酸 0.15-0.225g
吡哆醇 0.045-0.053g
生物素 0.002-0.003g
叶酸 0.001-0.002g
NaOH 0.165-0.25g。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤（1）中，培养基为LB培养基。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤（2）中，所述发酵培养基每1L含有如下组分：
Tryptone 8-10g
Yeast Extract 2.5-5g
NaCl 0.5-1.0g
Na2HPO4•12H2O 14-16g
KH2PO4 3-4g
NH4Cl 1.8-2.0g
泡敌 0.35-0.4ml，
其余为水。
4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤（2）中，所述种子液按照1:30的比例加入发酵培养基中；所述培养在温度为37℃、pH为7.00、溶氧值为40%的条件下培养。
5.一种制备破伤风毒素受体结合区Hc的方法，其特征在于：取权利要求1-4任一项所述方法制备得到的发酵液，离心，收集菌体，破菌，取上清，纯化，即可。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述纯化的方法是：将上清液过QFF 柱进行阴离子交换，用20mM Tris-HCl缓冲液平衡后，用含0-0.5M NaCl的Tris-HCl 缓冲液进行梯度洗脱；含有目的蛋白的洗脱液加入终浓度为0.5M 的(NH4)2SO4 后，过苯基疏水柱进行下一步纯化；目的蛋白用含浓度0.5-0M 的(NH4)2SO4的Tris-HCl 缓冲液进行梯度洗脱；含有目的蛋白的洗脱液用脱盐柱置换缓冲液为20mM NaAcpH4.0 后，过SP 柱进行阳离子交换，目的蛋白用含0-0.5M NaCl 的20mM NaAcpH 4.0缓冲液进行梯度洗脱，即可。
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