CN102234624A - 一种表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的基因工程菌及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌：TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub，和其构建方法。构建的基因工程菌是携带有一种重组质粒的大肠杆菌E.coli TOP10菌株，所述的重组质粒是携带有枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)精氨酸酶基因(arg-Bsub)完整序列的pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub。该菌株可把98％的L-精氨酸转化成L-鸟氨酸。

Description

一种表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的基因工程菌及构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因工程菌，具体涉及一种高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法。 

背景技术

一、L-鸟氨酸的生理功能和医疗保健价值： 

L-鸟氨酸是一种非蛋白质氨基酸，是生物体合成精氨酸、脯氨酸等蛋白质氨基酸的前体材料。L-鸟氨酸又是生物合成多胺的材料，最普遍重要的多胺是腐胺，尸胺，亚精胺，精胺。它们有促进生物组织生长和维持膜的正常状态的重要作用。由于多胺的带正电荷氨基能和DNA或者RNA的带负电荷磷酸基结合，促进植物细胞以及动物细胞中DNA转录和mRNA的翻译；它们和膜蛋白质或磷脂结合，保持膜的稳定性。 

L-鸟氨酸在脲循环中起重要作用，在脲循环代谢中接受二个NH₄ ⁺离子和一分子的CO₂，形成一个L-精氨酸分子，在精氨酸酶的作用下，精氨酸被水解成鸟氨酸和尿素，尿素被排出生物体外起到排除血氨的重要生理功能，而鸟氨酸又可以接受血液中的两个NH₄ ⁺¹离子和一分子的CO₂，形成新的L-精氨酸分子，周而复始的行使排除血氨的功能。 

L-鸟氨酸是已经研究过的能够刺激脑垂体诱导释放生长激素的最有效能的氨基酸，生长激素能够促进脂肪代谢，肌肉生长和肝细胞的再生，有利皮肤和组织伤口的愈合和修复。研究显示，鸟氨酸能够促进胸腺、肝脏和心脏组织的再生、加强肌肉的生长，增强免疫系统的功能。 

临床应用研究表明L-鸟氨酸盐对外科手术、烧伤病人、普通感染性疾病和肿瘤癌症的治疗有明显好处，L-鸟氨酸制剂对急性病人的恢复、对肝脏疾病、肝硬化病人的治疗有积极意义。 

研究表明，运动员补充L-鸟氨酸制品，肌肉运动质量和强度在五周后会有显著提高。由于体育锻炼和剧烈体力活动产生较多血氨，引起肌体疲劳，而L-鸟氨酸能够吸收血氨抑制疲劳，从而成为运动员和体力劳动者的常用营养补充剂。 

长时间以来，国际医药市场上流行的保肝护肝药品——鸟氨酸天门冬氨酸复合盐注射液，具有一定的销售规模，L-鸟氨酸是制备各种鸟氨酸药品保健品的基本原料，其需求量稳定且年年都有-定幅度的上升。 

二、L-鸟氨酸盐酸盐的生产方法 

L-鸟氨酸的生产方法有微生物发酵法和L-精氨酸弱碱水解法以及L-精氨酸酶水解法。 

1931年，Vickery，H.B.，和CookC.A.，发表了实验室中利用肝脏精氨酸酶制备鸟氨酸的论文(J.Biol.Chem.，94，393(1931))。 

中国专利(申请[公开]号CN101323866A)公开了一种使用改造了的谷氨酸棒杆菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法，葡萄糖的转化率为33％，发酵时间56小时，产酸率可以达到5～7％，收率70～80％。 

中国专利(申请[公开]号CN100340542C)公开了一种使用弱碱法(石灰乳)水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸的方法，水解液中精氨酸的浓度为10％，产品的收率可以达到78～82％。 

中国专利(申请[公开]号CN1908177A)公开了一种使用微生物酶法(粪肠球菌精氨酸酶)水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸的方法，培养微生物时间36小时，发酵水解精氨酸时间44小时，水解液中精氨酸的浓度为12～15％，每升转化液中鸟氨酸的含量可以达到90～112克。 

由于我国是一个水解法生产胱氨酸和精氨酸的强国，精氨酸的成本低廉，利用L-精氨酸水解法生产L-鸟氨酸比起发酵法的生产成本更为经济，但是，化学水解法往往引起L-鸟氨酸消旋，采用弱碱水解法制备L-鸟氨酸，是用硫酸沉淀去除弱碱金属离子的，生成的硫酸盐往往过滤困难，而且会产生一定的固体废物。发酵法生产L-鸟氨酸盐酸盐的産酸率不高，且伴随着产生少量的其他氨基酸，而酶法生产L-鸟氨酸则可以克服化学水解法以及发酵法的弊端，且底物浓度高(15％)，不产生杂酸(其他 氨基酸)，更利于产物的回收和精制。 

发明内容

本发明目的是提供一种高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法。 

构建的大肠杆菌工程菌株保藏于中国典型培养物保藏中心， 

保藏编号CCTCC No.M2010358， 

保藏物名称：大肠杆菌TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub， 

拉丁语名称：Escherichia coli，TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub 

保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学 

保藏日期：2010年12月22日。 

本发明中的“TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub”，也可以按照“TOP10/pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub”来表示，其中的大小写的区别不会导致矛盾，它们之间可以互相更换 

该培养物的培养条件、检测存活性条件： 

培养基：含100μg/ml Amp LB培养基，pH 7.0，培养温度37℃。 

该培养物由如下方式得到：枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC No.93009)中的精氨酸酶编码基因序列(arg-Bsub)，与pBAD/Thio-TOPO载体连接后，转化大肠杆菌TOP10。 

保存该培养物最适宜的方法：冷冻真空干燥法 

该大肠杆菌工程菌能够有效的催化L-精氨酸转化为L-鸟氨酸。 

本发明提供的构建高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因工程菌的技术方案是：构建一种重组质粒(pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub)，该重组质粒携带枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因的编码序列(简写为arg-Bsub，注：精氨酸酶基因简写为arg，枯草杆菌，Bacillus Subtilis，简写为Bsub，精氨酸酶基因简写为arg-Bsub)。用该重组质粒转化大肠杆菌TOP10，通过抗生素筛选得到阳性转化菌株，测定阳性菌株的精氨酸酶的活性，筛选出精氨酸酶高表达菌株，利用高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌株催化L-精氨酸转化为L-鸟氨酸。 

具体步骤是构建所述的重组质粒(pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub)和转化宿主菌大肠杆菌TOP10。 

该培养物的培养条件和保存方法分别是： 

培养基：LB培养基，称取10g蛋白胨、5g酵母粉与10gNaCL溶于950ml的水中，调pH至7.0后，加水定容到1000ml，分装成100ml份的三角瓶备用： 

含100μg/ml Amp的3.5mlLB培养基试管：取分装有LB培养基的三角瓶，盖上瓶塞，121℃灭菌20min，待温度降至40℃以下时，加入5％的Amp储存液200μl，混匀后立即无菌分装3.5ml培养基到已灭好菌的玻璃试管，得到含100μg/ml Amp的3.5mlLB培养基试管，用于工程菌株的试管培养； 

含100μg/ml Amp的LB培养基玻璃平板：取分装有LB培养基的三角瓶，分别称取1.5g琼脂粉加进含100mlLB培养基的三角瓶中，盖上瓶塞，121℃灭菌20min，待温度降至45℃以下时，加入5％的Amp储存液200μl，混匀后立即分装15-18ml培养基到已灭好菌的玻璃平板中，待培养基凝固后，置于4℃的冰箱中保存备用； 

菌株培养条件和保存方法：把构建和筛选出来的工程菌株，涂布在含100μg/mlAmp的LB培养基的玻璃平板上，37℃培养，将平板上长出的单菌落接种到含100μg/mlAmp的3.5mlLB培养基试管中，pH7.0，37℃，225r/min，振荡培养过夜，9小时，用灭菌吸管吸取0.85ml细菌培养液，添加到灭菌的含有0.15ml甘油的试管中，混匀，低温保存； 

长期保存方法：冷冻真空干燥法。 

1.材料与试剂 

1.1.遗传资源 

感受态大肠杆菌TOP10菌种(Escherichia coli TOP10)，购自武汉天源生物技术公司。 

线性TA克隆载体pBAD/Thio-TOPO，购自武汉天源生物技术公司。 

枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)来自中国典型培养物保藏中心CCTCC(武汉大学)，保藏号CCTCC No.93009。 

登录GenBank，通过GeneID：937760获取枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)168 菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整编码序列。 

1.2其他材料与试剂 

提取枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC No.93009)细菌基因组DNA所用得的试剂，DNA molecular weight marker，缓冲液，溶菌酶，RNase，蛋白酶K等，购自基因有限公司。其它化学常规试剂均为分析纯试剂。 

TaqDNA聚合酶、反应缓冲液，购自武汉天源生物技术公司。 

2.构建基因工程菌大肠杆菌TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub的具体步骤： 

2.1.设计合成一对TA克隆引物 

登录GenBanK，通过Gene ID：937760获取枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)168菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整编码序列，据此，利用Primerer 5.0软件设计一对扩增888bp精氨酸酶基因DNA序列，用于pBAD/Thio-TOPO载体TA克隆所需的引物，p1、p2。(引物由英潍捷基[Invitrogen](上海)贸易有限公司合成。) 

p1：5′-GAAATGGATAAAACGATTTCGGTTAT-3′，共26bp。 

p2：5′-GGTCAGCAGCTTCTTCCCTAACA-3′，共23bp。 

2.2.提取枯草芽孢杆菌基因组DNA 

采用改进的Palva I等人的方法提取枯草芽孢杆菌基因组DNA。(Paiva，I.Molecular coloning of a-amylase gene from Bacillus amylolique faciens and its expression in B.subtilis[J].Gene，1982，19：81-87) 

(1).挑取枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC No.93009)菌株平板培养的单个菌落，接种到装有10ml牛肉膏，蛋白胨液体培养基的试管中，32℃振荡培养12小时。 

(2).5000rpm离心10min，得到菌体沉淀，STE洗涤1次，再次离心，菌体重悬于4mlTE溶液中。 

(3).加入50mg/ml溶菌酶溶液8μl(终浓度为100μg/ml)，37℃保温20min。再 加入RNase(10mg/ml)10μl，至终浓度25μg/ml，然后加入10％SDS溶液0.5ml，37℃保温30min。加入蛋白酶K(20mg/ml)10μl，终浓度为50μg/ml，37℃保温60min。 

(4).再加入等体积的水饱和酚，混匀，8000rpm离心5min，取上清于另一个离心管中。 

(5).上清液中加入等体积的酚∶氯仿(1∶1体积)混合液，混匀，8000rpm离心5min，取上清置于另一个离心管中。 

(6).加入1/5体积的3M醋酸铵，2倍体积无水乙醇，轻缓反转离心管，使溶液充分混匀，DNA形成丝状析出物。 

(7).8000rpm离心5min，沉淀DNA，吸弃所有的上清液。 

(8).向DNA沉淀中加入1ml的70％乙醇，颠倒试管使溶液充分接触试管所有内壁，以洗去残留的盐。8000rpm离心5min，沉淀DNA。吸弃所有的上清液。 

(9).敞开管口，室温下使乙醇尽可能挥发干净。 

(10).溶于0.5mlTE溶液中，测定OD260及OD280，A260/A280应在1.8～2.0。 

(11).提取后的基因组DNA通过0.9％琼脂糖凝胶电泳检测，DNA带应集中均匀，不含RNA。 

附：牛肉膏蛋白胨液体培养基的配制方法：牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g溶于1000ml纯净水中，pH7.0。 

2.3.PCR扩增枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因 

PCR反应所用试剂，Taq DNA聚合酶，反应缓冲液和dNTPs和无菌纯水均来自Invitrogen公司，PCR引物p1、p2由英潍捷基[Invitrogen](上海)贸易有限公司合成。 

以枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC No.93009)基因组DNA为模板，利用p1、p2引物进行PCR扩增精氨酸酶基因(argBsub)。PCR反应在50μl反应体系中进行，参照 

ThioFusion Expression Kit使用说明书的方法进行PCR，TOPO克隆，细胞转化和转化菌株筛选。 

(1).制备50μl反应体系。 

模板DNA，2μl(50ng)；10X PCR Buf，5μl；50mMdNTPs，0.5μl； 

引物p1和p2，各1μl(100ng)；Taq DNA polymerase(1单位/μl)，1μl；加无菌纯水至体积50μl。 

(2).PCR反应的程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min；共30个循环，最后72℃延伸10min。反应完毕后，置于冰中待用。 

(3).取PCR扩增产物2μl上样1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测为0.9KB大小的DNA片断(已知精氨酸酶基因是888个碱基对的DNA片断)，得到的DNA带轮廓应清楚，适用于直接进行TOPO-TA克隆反应。 

2.4.TOPO克隆连接反应(重组质粒的构建) 

为了获得精氨酸酶基因表达的产物的活性和质量最大化，表达产生的酶蛋白需要有正确的折叠和最大的可溶性，我们认为N-末端融合有HP-硫氧还蛋白引导肽，较有利于维持细菌细胞内部的氧化还原环境，有利于表达蛋白质的正确折叠和增大其可溶性，有利于增加目标蛋白质的表达量。另外，TA克隆技术具有操作简单、快速、重组效率高等优点。因此，我们选用TA克隆载体pBAD/Thio-TOPO构建重组质粒pBAD/Thio-TOPO-argBsub。所用pBAD/Thio-TOPO载体、盐溶液和无菌纯水均来自Invitrogen公司。 

(1).准备TOPO克隆反应体系： 

新鲜的PCR反应产物1μl，盐溶液1μl，pBAD/Thio-TOPO载体1μl，无菌纯水3μl，总体积6μl。在小试管中震动混匀，短暂离心，集中反应液至试管底部。 

(2).连接反应： 

把反应试管置室温(25℃)水浴进行TA连接反应15分钟。反应完成后，把反应试管置于冰中待用。 

2.5.转化大肠杆菌TOP10感受态细胞 

转化用受体大肠杆菌TOP10感受态细胞，系Invitrogen公司试剂套件提供的化学诱导的感受态受体菌株，商品名为“one TOP10 Chemically Competent  E.coli。 

(1).取TOPO克隆连接反应液2μl，加进一小瓶的(50μl)大肠杆菌TOP10感受态细胞中，振摇混匀，瞬间离心集中细菌至小瓶底部。 

(2).放到冰中，保持10分钟。 

(3).42℃热休克细胞30秒钟，无需振摇，立刻转移置放在冰中。 

(4).向转化细胞中加入250μl室温(25℃)的LB培养基，拧紧瓶盖，在37℃摇床上(225rpm)振摇1小时。 

(5).取50μl和200μl两个不同体积的转化液铺平板(含有100μg/mlAmp的LB培养基平板)两个。 

(6).37℃培养箱孵育平板，得到Amp抗性菌落，从中间筛选出酶活性最高的转化菌株，即是我们构建的大肠杆菌TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌株。 

2.6.阳性克隆的鉴定和筛选 

分别挑取20个Amp抗性的转化菌单个菌落，接入含有100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，225rpm培养6小时，按0.01％的终浓度向培养物添加阿拉伯糖后继续培养6小时，离心得到湿菌体，把0.1g湿菌体加入5ml pH9.0的5％精氨酸底物中，添加锰离子使终浓度成为10μmol/L，37℃温育60分钟，薄板层析检查鸟氨酸的生成量，从中筛选出精氨酸酶产量最高的转化菌——大肠杆菌基因工程菌株(TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub)。 

其中薄板层析所用的展层剂配比为： 

正丁醇∶丙酮∶浓氨水∶水＝10∶10∶5∶2 

2.7.插入DNA片断的序列分析 

(1).把菌株TOPO10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub接入含有100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，225rpm培养8-10小时，提取质粒，得到pBAD/Thio-TOPO-argBsub重组质粒DNA。 

(2).将提取的pBAD/Thio-TOPO-argBsub重组质粒DNA送英潍捷基[Invitrogen] (上海)贸易有限公司进行DNA序列分析。 

(3).依据pBAD/TOPO-ThioFusion表达试剂盒产品说明书提供的质粒DNA序列分析引物结合位点的序列信息，由英潍捷基[Invitrogen](上海)贸易有限公司，合成pBAD-正向引物pf，其序列是5’-ATGCCATAGCATTTTTATCC，合成pBAD-反向引物pr，其序列是5’-ATCTGTATCAGGCTGAAAATC。 

(4).利用正向引物pf，5’-ATGCCATAGCATTTTTATCC和pBAD/Thio-TOPO-argBsub重组质粒DNA为模板进行序列分析，解读出一段自载体DNA的第245位核苷酸起，至下游1073个核苷酸的DNA序列。 

(5).利用反向引物pr，5’-ATCTGTATCAGGCTGAAAATC和pBAD/Thio-TOPO-argBsub重组质粒DNA为模板进行序列分析，解读出一段至载体DNA的第834位核苷酸起，向上游延伸长1108个核苷酸的DNA序列。 

(6).通过拼接后，得到一段DNA片段的序列信息，共计1484个碱基对(见序列表<223>DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列<400>3)，内含TA克隆的插入序列长894个核苷酸(见序列表<223>插入的精氨酸酶基因核苷酸序列表<400>6)，从第4位A起，至891位的G，计888个核苷酸，其核苷酸序列和枯草芽孢杆菌168的精氨酸酶基因编码序列完全相同(编码296个氨基酸)。设计PCR引物时在该酶的N-末端增加一个三联体密码GAA，把天然的终止密码TAA修改为ACC，故插入序列为894(888+6)个碱基对(编码298个氨基酸)。 

3.DNA序列分析的结果 

(1).融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的完整编码序列是由1350个核苷酸组成的。自起始密码ATG开始，是为N-末端有着123个氨基酸残基的HP-硫氧还蛋白引导肽编码的核苷酸序列，接着而来的是为298个氨基酸残基编码的插入DNA序列，内含组成枯草芽孢杆菌精氨酸酶的296个氨基酸残基的核苷酸编码序列，再至为C-末端的V5-抗原决定部位和多组氨酸标签的28个氨基酸残基编码核苷酸，共有1347个核苷酸，给449个氨基酸残基编码，加上一个终止密码，该阅读框共有1350个核苷酸，其完整的DNA序列见序列表<223>融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白编码核苷酸序列<400>4。 

(2).由核苷酸序列推导的融合酶蛋白有449个氨基酸残基组成，自N-末端向C-末端方向排列，见序列表<223>融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列<400>6。由核苷酸序列推导的插入DNA片段编码肽链的298个氨基酸残基序列，自N-末端向C-末端方向排列，见序列表<223>插入DNA序列编码的氨基酸残基序列<400>7。除去首尾两个氨基酸残基以后的296个氨基酸残基序列，是天然的枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列。和GenBank公布的枯草芽孢杆菌168的精氨酸酶的氨基酸残基序列完全一致，见序列表<223>枯草芽孢杆菌精氨酸酶氨基酸残基序列<400>8。 

4.酶法转化L-精氨酸生成L-鸟氨酸 

本发明所述的菌株能够高效转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸，工艺过程如下： 

摇瓶培养，阿拉伯糖诱导条件下，每100ml培养物可以得到3克湿菌体，9克湿菌体在1L反应液中20小时可以催化150克精氨酸定量转化为鸟氨酸，转化率可达到98％。。 

工程菌摇瓶发酵和酶法转化精氨酸的过程： 

操作方法： 

(1).取-80℃保存的E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌接种到3.5mlLB(含100μg/ml Amp)培养基试管中，37℃，225r/min，振荡培养16小时。 

(2).取培养活化好的菌液3ml接种到25ml含100μg/ml Amp的2％玉米浆培养基中，37℃，225r/min，振荡培养，培养时间18小时。 

2％玉米浆培养基由下列营养成分组成： 

玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氢二钾10g/L、硫酸镁10g/L，pH7.0； 

(3).取培养好的菌种液15ml接种到100ml 2％玉米浆培养基(含100μg/ml Amp)中，37℃，225r/min，振荡培养，当细菌生长至OD₆₀₀＝4.0时(6小时)，降温至30℃，并加入L-阿拉伯糖至0.01％终浓度进行诱导，诱导10小时收集菌体。 

(4).将发酵好的菌液在4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，收集菌体。按菌体量的10倍比例，悬浮于pH7.0，0.01mol/L无菌的磷酸缓冲液中，混匀，所得的菌悬液即为精氨酸工程菌粗酶液。 

(5).把150克L-精氨酸溶解于800毫升纯水中，用6M的盐酸调pH9.0，再加入90毫升精氨酸酶工程菌粗酶液(相当于9克湿菌体)，加纯净水至1000毫升体积，加入Mn²⁺至终浓度为10μmol/L，在38℃的条件下反应20小时，取样，薄板层析检测残余精氨酸，溶液中的残余精氨酸≤2％，终止转化反应。 

其中薄板层析所用的展层剂配比为： 

正丁醇∶丙酮∶浓氨水∶水＝10∶10∶5∶2。 

(6).将精氨酸酶解液用6M的盐酸调节pH至5.0，加入活性炭23g，升温60℃，脱色30min后，过滤。滤液在80℃水浴、0.08Mpa的真空下，浓缩体积至380ml，再加入8g活性炭室温脱色30min后，过滤。滤液在80℃水浴、0.08Mpa的真空下，浓缩体积至230ml，加入140ml食用酒精，搅拌均匀，置4℃冰箱中过夜。次日，滤出盐酸鸟氨酸结晶，用20ml左右食用酒精洗涤产品，得湿重143g，70℃烘干后127.5g；本次产品收率85.0％，质量符合AJI92版(第七版)。 

本发明的优点是： 

1.目前使用的精氨酸酶多是来自高等动物肝脏的1型精氨酸酶，克隆表达动物肝脏来源的1型精氨酸酶时，需要由其mRNA反转录成cDNA，再行PCR扩增出精氨酸酶的基因才能和载体重组，手续繁杂，操作困难。而PCR细菌基因则简单方便得多，利用大肠杆菌基因工程菌表达枯草杆菌精氨酸酶，具有安全高效，手续简便的特点， 

2.所表达的融合蛋白不但保持了高效表达的特性，酶蛋白的表达量达到细菌总蛋白的30％。而且精氨酸酶融合蛋白得到正确的折叠，在融合蛋白的形态下，表现出很高的酶活性，可以满足工业生产的要求。 

发酵培养得到菌体不需要破壁处理即可以直接用于催化L-精氨酸转化生产L-鸟氨酸。 

4.用微生物产生的精氨酸酶代替动物来源的酶，不仅开辟了新酶源，而且能够减少动物传染疾病的机会，有利于产品出口。 

附图说明

图1：枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因PCR-TA克隆方案示意图 

序列表说明 

序列1引物P1的核苷酸序列                            26个核苷酸 

序列2引物P2的核苷酸序列                            23个核苷酸 

序列3DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列             1484个核苷酸 

序列4融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白编码核苷酸序列    1350个核苷酸 

序列5插入的精氨酸酶基因的核苷酸序列                894个核苷酸 

序列6融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列  449个氨基酸残基 

序列7插入DNA序列编码的氨基酸残基序列               298个氨基酸残基 

序列8枯草芽孢杆菌精氨酸酶氨基酸残基序列            296个氨基酸残基 

关于：序列3、4、5的关系的说明 

在DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列中，包含了枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列之前的部分，开始于第1个核苷酸，结束于第101个核苷酸 

在DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列中，包含了枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列，开始于第102个核苷酸，结束于第1451个核苷酸 

在DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列中，包含了枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列的插入序列，插入序列的开始位点，位于第471个核苷酸， 

                  *下游是插入序列，精氨酸酶的起始密码是ATG。 

“…..CTC GCC CTT * GAA ATG GAT……” 

              “T * G”分别是第470-471个核苷酸 

插入序列的结束位点，位于第1364个核苷酸 

                  *上游是插入序列， 

“…..CTG CTG ACC * AAG GGC GAG……” 

              “C * A”分别是第1364-1365个核苷酸 

在DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列中，包含了枯草芽孢杆菌精氨酸酶融合蛋白编码核苷酸序列之后的部分，开始于第1452个核苷酸，结束于第1484个核苷酸 

插入的精氨酸酶基因的核苷酸序列的说明 

内含TA克隆的插入序列长894个核苷酸，从第4位A起，至891位的G，计888个核苷酸，其核苷酸序列和枯草杆菌168的精氨酸酶基因编码序列完全相同(编码296个氨基酸)。设计PCR引物时在该酶的N-末端增加一个三联体密码GAA，把天然的终止密码TAA修改为ACC，故插入序列为894(888+6)个碱基对(编码298个氨基酸) 

具体实施例

实施例1 

设计合成一对TA克隆引物 

登录GenBanK，通过Gene ID：937760获取枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)168菌株精氨酸酶基因(argBsub)的完整编码序列，利用Primerer 5.0软件设计一对扩增枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因DNA序列，用于pBAD/Thio-TOPO载体TA克隆所需的引物，p1、p2。(由英潍捷基[Invitrogen](上海)贸易有限公司合成。) 

P1：5′-GAAATGGATAAAACGATTTCGGTTAT-3′，共26bp。 

P2：5′-GGTCAGCAGCTTCTTCCCTAACA-3′，共23bp。 

实施例2 

提取和测定枯草芽孢杆菌基因组DNA 

采用改进的Palva I等人的方法提取枯草芽孢杆菌基因组DNA。 

(1).挑取枯草芽孢杆菌(保藏号CCTCC No.93009)菌株平板培养的单个菌落，接种到装有10ml牛肉膏，蛋白胨液体培养基的试管中，32℃振荡培养14小时。 

(2).5000rpm离心10min，得到菌体沉淀，STE洗涤1次，再次离心，菌体重悬于4mlTE溶液中。 

(3).加入50mg/ml溶菌酶溶液8μl(终浓度为100μg/ml)，37℃保温20min。再加入RNase(10mg/ml)10μl，至终浓度25μg/ml，然后加入10％SDS溶液0.5ml，37℃保温30min。加入蛋白酶K(20mg/ml)10μl，终浓度为50μg/ml，37℃保温60min。 

(4).再加入等体积的酚，混匀，8000rpm离心5min，取上清于另一个离心管中。 

(5).上清液中加入等体积的酚∶氯仿(1∶1体积)混合物，混匀，8000rpm离心5min，取上清置于另一个离心管中。 

(6).加入1/5体积的3M醋酸铵，2倍体积无水乙醇，轻缓反转离心管，使溶液充分混匀，DNA形成丝状析出物。 

(7).8000rpm离心5min，沉淀DNA，吸弃所有的上清液。 

(8).向DNA沉淀中加入1ml的70％乙醇，颠倒试管使溶液充分接触试管所有内壁，以洗去残留的盐。8000rpm离心5min，沉淀DNA。吸弃所有的上清液。 

(9).敞开管口，室温下使乙醇尽可能挥发干净。 

(10).加入0.5mlTE溶液溶解DNA，测定OD260及OD280，A260/A280＝1.85。 

(11).提取后的基因组DNA通过0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测，DNA带集中均匀，不含RNA。 

实施例3 

PCR扩增枯草芽孢杆菌精氨酸酶基因 

1).制备50μl反应体系。 

模板DNA，2μl(50ng)；10X PCR Buf，5μl；50mMdNTPs，0.5μl； 

引物p1和p2，各1μl(100ng)；Taq DNA polymerase(1单位/μl)，1μl；加无菌纯水至体积50μl。 

PCR反应的程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min；共30个循环，最后72℃延伸10min。反应完毕后，暂存于冰中待用。 

2).取扩增产物2μl上样1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测到0.9KB大小的DNA片断，DNA带轮廓清楚，适用于直接进行TOPO-TA克隆反应。 

实施例4 

重组质粒的构建和转化宿主菌 

(1).准备TOPO克隆反应体系： 

新鲜的PCR反应产物1μl，盐溶液1μl，pBAD/Thio-TOPO载体1μl，无菌纯水3μl，总体积6μl。在小试管中震动混匀，短暂离心，集中反应液至试管底部。 

(2).连接反应： 

把反应管置室温(25℃)水浴进行TA连接反应15分钟。反应完成后，把反应试管置于冰中待用。 

(3).取TOPO克隆连接反应液2μl，仔细加进一小瓶的(50μl)大肠杆菌TOP10感受态细胞中，振摇混匀，瞬间离心集中细菌至小瓶底部。 

(4).放置冰中，保持10分钟。 

(5).42℃热休克细胞30秒钟，无需振摇，立刻转移置放在冰中。 

(5).向转化细胞中加入250μl室温(25℃)的培养基，拧紧瓶盖，在37℃摇床上(225rpm)振摇1小时。 

(6).取50μl和200μl两个不同体积的转化液铺平板(含有100μg/ml Amp的LB培养基两个)平板。 

(7).平板置于37℃培养箱培养，得到Amp抗性菌落，挑选20个菌落分析精氨酸酶活性，从中选出酶活性最高的转化菌株，得到基因工程菌大肠杆菌E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub菌株 

实施例5 

阳性克隆的鉴定和挑选 

分别挑取Amp抗性的转化菌菌落20个，接入含有100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，225rpm培养6小时，按0.01％的终浓度向培养物添加阿拉伯糖后继续培养6小时，离心得到湿菌体，把0.1g湿菌体加入5mlpH9.0的5％精氨酸底物中，添加锰离子使终浓度成为10μmol/L，37℃温育60分钟，薄板层析检查鸟氨酸的生成量，从中筛选出精氨酸酶活性最高的E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub大肠杆菌基因工程菌株。 

其中薄板层析所用的展层剂配比为： 

正丁醇∶丙酮∶浓氨水∶水＝10∶10∶5∶2 

实施例6 

测定插入DNA片断的序列 

(1).把菌株TOPO10/pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub接入含有100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，225rpm培养8-10小时，提取质粒，得到pBAD/Thio-TOPO-argBsub重组质粒DNA。 

(2).将提取的pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub重组质粒DNA送英潍捷基[Invitrogen](上海)贸易有限公司进行序列分析。 

(3).依据pBAD/TOPO-ThioFusion表达试剂盒产品说明书要求，由英潍捷基[Invitrogen](上海)贸易有限公司，合成pBAD-正向引物pf和反向引物pr。 

正向引物pf，5’-ATGCCATAGCATTTTTATCC 

反向引物pr，5’-ATCTGTATCAGGCTGAAAATC 

(4).通过序列分析得到一段共1484个碱基对的DNA序列信息，内含894个核苷酸 的插入序列，插入序列的上游部分是载体的470个核苷酸，下游部分是载体的120个核苷酸。序列测定结果见序列表<223>DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列<400>3)。 

(5).融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的完整编码序列(阅读框)计有1350个核苷酸，ATG密码起于载体质粒346位核苷酸，止于714位核苷酸，计369个核苷酸，组成123个三联体密码，编码N-末端连接的HP-硫氧还蛋白引导肽的123个氨基酸残基。插入序列计有894个核苷酸，编码肽链的298个氨基酸残基序列，除去首尾两个氨基酸残基以后的296个氨基酸残基序列，是天然的枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列。插入序列另一端连接载体的第715位核苷酸，延伸至载体的第801位核苷酸，计有87个核苷酸为融合蛋白羧末端的V5-抗原决定部位和多组氨酸标签(28个氨基酸残基)编码，加上TGA终止密码子，整个阅读框共有1350个核苷酸，组成450个三联体密码子，编码449个氨基酸残基。完整的阅读框序列见序列表<223>融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白编码核苷酸序列<400>4)。 

(6).由阅读框核苷酸序列推导的融合酶蛋白的449个氨基酸残基序列，自N-末端向C-末端方向排列。(见序列表<223>融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列<400>6)。 

(7).由核苷酸序列推导的插入DNA片段编码肽链的298个氨基酸残基序列，自N-末端向C-末端方向排列(见序列表<223>插入DNA序列编码的氨基酸残基序列<400>7)。除去首尾两个氨基酸以后的296个氨基酸残基序列，是天然的枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列。和GenBank公布的枯草芽孢杆菌168的精氨酸酶的氨基酸残基的序列完全一致(见序列表<223>枯草芽孢杆菌精氨酸酶氨基酸残基序列<400>8)。 

实施例7 

工程菌发酵-转化精氨酸的过程 

(1).取-80℃保存的E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌接种到3.5mlLB(含100μg/ml Amp)培养基试管中，37℃，225r/min，振荡培养16小时。 

(2).取培养活化好的菌液3ml接种到25ml含100μg/ml Amp的2％玉米浆培养基中，37℃，225r/min，振荡培养，培养时间18小时。 

2％玉米浆培养基由下列营养成分组成： 

玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氢二钾10g/L、硫酸镁10g/L，PH7.0； 

(3).取培养好的15ml菌种液接种到100ml 2％玉米浆培养基(含100μg/ml Amp)中，37℃，225r/min，振荡培养，当细菌生长至OD₆₀₀＝4时(6小时)，降温至30℃，并加入L-阿拉伯糖至0.01％终浓度进行诱导，诱导10小时收集菌体。 

(4).将发酵好的菌液在4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，收集菌体。按菌体量的10倍比例，悬于pH7.0，0.01mol/L无菌的磷酸缓冲液中，振荡混匀，所得的菌悬液即为精氨酸工程菌粗酶液 

(5).取175克精氨酸碱，加水约1000ml，用6M的盐酸调节溶液的pH至9.5，加入105毫升工程菌悬浮液(相当于10.5克湿菌体)，加入Mn²⁺至终浓度为10umol/L，再加入纯净水将溶液调整到至1200ml，水浴37℃保温搅拌进行酶解反应。酶解20小时，取样检测残余精氨酸，(薄板层析)，溶液中的残余精氨酸≤2％时，终止反应。 

其中薄板层析所用的展层剂配比为： 

正丁醇∶丙酮∶浓氨水∶水＝10∶10∶5∶2 

(6).将精氨酸酶解液用6M的盐酸调节PH至5.0，加入活性炭26g，升温80℃，脱色30min后，过滤。滤液在80℃水浴、0.08Mpa的真空下，浓缩体积至430ml，再加入10g活性炭室温脱色30min后，过滤。滤液在80℃水浴、0.08Mpa的真空下，浓缩体积至255ml，加入160ml食用酒精，搅拌均匀，置4℃冰箱中过夜。次日，滤出盐酸鸟氨酸结晶，用32ml左右食用酒精洗涤产品，得湿重182.7g，70℃烘干后150.3g；本次产品收率85.8％，质量符合AJI92版(第七版)。 

实施例8 

(1).取-80℃保存的E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌接种到3.5mlLB(含100μg/ml Amp)培养基试管中，37℃，225r/min，振荡培养16小时。 

(2).取培养活化好的菌液3ml接种到25ml含100μg/ml Amp的2％玉米浆培养基中，37℃，225r/min，振荡培养，培养时间18小时。 

2％玉米浆培养基由下列营养成分组成： 

玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氢二钾10g/L、硫酸镁10g/L，PH7.0；   (3).取培养好的15ml菌液接种到100ml 2％玉米浆培养基(含100μg/ml Amp)中，37℃，225r/min，振荡培养，当细菌生长至OD₆₀₀＝4时(6小时)，降温至30℃，并加入L-阿拉伯糖至0.01％终浓度进行诱导，诱导10小时收集菌体。 

(4).将发酵好的菌液在4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，收集菌体。按菌体量的10倍比例，悬于pH7.0，0.01mol/L无菌的磷酸缓冲液中，振荡混匀，所得的菌悬液即为精氨酸工程菌粗酶液 

(5)取135克精氨酸碱，加水约800ml，用6M盐酸溶液调pH9.0，再加入80毫升精氨酸酶工程菌粗酶液(相当于8克湿菌体)，加纯净水至900毫升体积，加入Mn²⁺至终浓度为10μmol/L，在38℃的条件下反应20小时，取样，薄板层析检测残余精氨酸，溶液中的残余精氨酸≤2％，终止转化反应。 

其中薄板层析所用的展层剂配比为： 

正丁醇∶丙酮∶浓氨水∶水＝10∶10∶5∶2 

(6).将精氨酸酶解液用6M的盐酸调节pH至5.0，加入活性炭21g，升温70℃，脱色30min后，过滤。滤液在80℃水浴、0.08Mpa的真空下，浓缩体积至320ml，再加入6g活性炭室温脱色30min后，过滤。滤液在80℃水浴、0.08Mpa的真空下，浓缩体积至200ml，加入130ml食用酒精，搅拌均匀，置4℃冰箱中过夜。次日，滤出盐酸鸟氨酸结晶，用15ml左右食用酒精洗涤产品，得湿重138.6g，70℃烘干后118.3g；本次产品收率87.6％，质量符合AJI92版(第七版)。 

实施例9 

(1).取-80℃保存的E.coli TOP10/pBAD/Thio-TOPO-argBsub基因工程菌接种到3.5mlLB(含100μg/ml Amp)培养基试管中，37℃，225r/min，振荡培养16小时。 

(2).取活化好的菌液3ml接种到25ml含100μg/ml Amp的2％玉米浆培养基中，37℃，225r/min，振荡培养，培养时间18小时。 

2％玉米浆液培养基由下列营养成分组成： 

玉米粉20g/L、味精15g/L、磷酸氢二钾10g/L、硫酸镁10g/L，PH7.0； 

(3).取培养好的3.5ml接种到100ml2％玉米浆培养基(含100μg/ml Amp)中，37℃，225r/min，振荡培养，当细菌生长至OD₆₀₀＝4时(6小时)，降温至30℃，并加入 L-阿拉伯糖至0.01％终浓度进行诱导，诱导10小时收集菌体。 

(4).将发酵好的菌液在4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，收集菌体。按菌体量的10倍比例，悬于pH7.0，0.01mol/L无菌的磷酸缓冲液中，振荡混匀，所得的菌悬液即为精氨酸工程菌粗酶液 

(5).取150克精氨酸碱，加水约900ml，用6M的盐酸调节溶液的pH至9.0，加入90毫升工程菌悬浮液(相当于9克湿菌体)，加入Mn²⁺至终浓度为10umol/L，再加入纯净水将溶液调整到至1000ml，水浴37℃保温并搅拌进行酶解反应。当酶解到20小时后，取样检测残余精氨酸，(薄板层析)，溶液中的残余精氨酸≤2％，进入下一工序。 

其中薄板层析所用的展层剂配比为： 

正丁醇∶丙酮∶浓氨水∶水＝10∶10∶5∶2 

(6).将精氨酸酶解液用6M的盐酸调节PH至5.0，加入活性炭23g，升温80℃，脱色30min后，过滤。滤液在80℃水浴、0.08Mpa的真空下，浓缩体积至380ml，再加入8g活性炭室温脱色30min后，过滤。滤液在80℃水浴、0.08Mpa的真空下，浓缩体积至230ml，加入140ml食用酒精，搅拌均匀，置4℃冰箱中过夜。次日，滤出盐酸鸟氨酸结晶，用20ml左右食用酒精洗涤产品，得湿重143g，70℃烘干后127.5g；本次产品收率85.0％，质量符合AJI92版(第七版)。 

实施例10 

薄层层析法测定精氨酸的转化率： 

薄层层析法分离鉴定氨基酸具有设备简单、操作方便、测定快速、斑点集中及显色灵敏度高等特点。薄层层析能够检测出0.2～0.5微克量的氨基酸。能够满足我们测定精氨酸转化率的需要。 

一、20x10展层薄板的铺制方法： 

1、配置0.6％的羧甲基纤维素钠水溶液。 

称取羧甲基纤维素钠4.5g(含水34％)，(用剪刀剪成细小粉末便于溶解)溶于500ml蒸馏水中，电炉上加热溶解羧甲基纤维素钠，抽滤得澄清滤液)。 

2、按硅胶粉的质量∶羧甲基纤维素钠水溶液＝1∶2.5的比例，即100ml羧甲基纤维素钠的水溶液中加入硅胶粉40g。在碾钵中搅拌研磨成均匀的糊状物， 

3、将糊状的硅胶粉混合液倒在洗净的20x10玻璃板上，用铺板器铺均匀后，放置于干净平整的桌面上自然凉干。 

二、层展精氨酸样品的制备 

1、取酶解20小时的精氨酸转化液1ml加入到2ml的H₂O中，使精氨酸的浓度为50μg/μl。 

2、精氨酸标准液的配置：称取0.1g精氨酸溶于90mlH₂O中，调pH9.0(pH8-9.5均行)后定容至100ml，精氨酸浓度为1μg/μl。 

三、薄板层析 

分别取1μg/μl的精氨酸标准液和50μg/μl的精氨酸转化液各1μl点在层析薄板上，待斑点吹干后，将薄板放入层析缸中展层，层析所用的展层剂配比为：正丁醇∶丙酮∶浓氨水∶水＝10∶10∶5∶2 

30-40℃展层3-4小时后，取出薄板进行茚三酮显色。若转化液中残余精氨酸的颜色跟标准精氨酸的颜色一样或者更浅，则说明溶液中精氨酸转化≥98％，可以进入下一工序。 

实施例11 

L-鸟氨酸盐酸盐的鉴别和检测 

鉴别：比较产品红外吸收图谱和标准红外吸收图谱。 

按照日本味之素公司氨基酸标准第七版提供的分析方法和质量标准进行分析。产品质量完全符合该版本要求。分析结果如下。 

序列表 

<110>武汉远大弘元股份有限公司， 

     武汉远大弘元药业有限公司 

<120>一种表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的基因工程菌及构建方法 

<160>3 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>26 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<223>引物P1 

<400>1 

gaaatggata aaacgatttc ggttat    26 

<210>2 

<211>23 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<223>引物P2 

<400>2 

ggtcagcagc ttcttcccta aca       23 

<210>3 

<211>1484 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<223>DNA序列测定得到的1484个核苷酸序列 

<400>3 

tacctgacgc tttttatcgc aactctctac tgtttctcca tacccgtttt tttgggctag    60 

aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatacc catgggatct gataaaatta   120 

ttcatctgac tgatgattct tttgatactg atgtacttaa ggcagatggt gcaatcctgg   180 

ttgatttctg ggcacactgg tgcggtccgt gcaaaatgat cgctccgatt ctggatgaaa   240 

tcgctgacga atatcagggc aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat cacaacccgg   300 

gcactgcgcc gaaatatggc atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg   360 

aagtggcggc aaccaaagtg ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg   420 

ctaacctggc cggctctgga tccggtgatg acgatgacaa gctcgccctt gaaatggata   480 

aaacgatttc ggttattgga atgccaatgg atttaggaca agcacgacgc ggagtggata   540 

tgggcccgag tgccatccgg tacgctcatc tgatcgagag gctgtcagac atggggtata   600 

cggttgaaga tctcggtgac attccgatca atcgcgaaaa aatcaaaaat gacgaggaac   660 

tgaaaaacct gaattccgtt ttggcgggaa atgaaaaact cgcgcaaaag gtcaacaaag   720 

tcattgaaga gaaaaaattc ccgcttgtcc tgggcggtga ccacagtatt gcgatcggca   780 

cgcttgcagg cacagcgaag cattacgata atctcggcgt catctggtat gacgcgcacg   840 

gcgatttgaa tacacttgaa acttcaccat cgggcaatat tcacggcatg ccgctcgcgg   900 

tcagcctagg cattggccac gagtcactgg ttaaccttga aggctacgcg cctaaaatca   960 

aaccggaaaa cgtcgtcatc attggcgccc ggtcacttga tgaaggggag cgcaagtaca  1020 

ttaaggaaag cggcatgaag gtgtacacaa tgcacgaaat cgatcgtctt ggcatgacaa  1080 

aggtcattga agaaaccctt gattatttat cagcatgtga tggcgtccat ctgagccttg  1140 

atctggacgg acttgatccg aacgacgcac cgggtgtcgg aacccctgtc gtcggcggca  1200 

tcagctaccg ggagagccat ttggctatgg aaatgctgta tgacgcaggc atcattacct  1260 

cagccgaatt cgttgaggtt aacccgatcc ttgatcacaa aaacaaaacg ggcaaaacag   1320 

cagtagagct cgtagaatcc ctgttaggga agaagctgct gaccaagggc gagcttgaag   1380 

gtaagcctat ccctaaccct ctcctcggtc tcgattctac gcgtaccggt catcatcacc   1440 

atcaccattg agtttaaacg gtctccagct tggctgtttt ggcg                    1484 

<210>4 

<211>1350 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<223>融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白编码核苷酸序列 

<400>4 

atgggatctg ataaaattat tcatctgact gatgattctt ttgatactga tgtacttaag     60 

gcagatggtg caatcctggt tgatttctgg gcacactggt gcggtccgtg caaaatgatc    120 

gctccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactgaccgt tgcaaaactg    180 

aacatcgatc acaacccggg cactgcgccg aaatatggca tccgtggtat cccgactctg    240 

ctgctgttca aaaacggtga agtggcggca accaaagtgg gtgcactgtc taaaggtcag    300 

ttgaaagagt tcctcgacgc taacctggcc ggctctggat ccggtgatga cgatgacaag    360 

ctcgcccttg aaatggataa aacgatttcg gttattggaa tgccaatgga tttaggacaa    420 

gcacgacgcg gagtggatat gggcccgagt gccatccggt acgctcatct gatcgagagg    480 

ctgtcagaca tggggtatac ggttgaagat ctcggtgaca ttccgatcaa tcgcgaaaaa    540 

atcaaaaatg acgaggaact gaaaaacctg aattccgttt tggcgggaaa tgaaaaactc    600 

gcgcaaaagg tcaacaaagt cattgaagag aaaaaattcc cgcttgtcct gggcggtgac    660 

cacagtattg cgatcggcac gcttgcaggc acagcgaagc attacgataa tctcggcgtc    720 

atctggtatg acgcgcacgg cgatttgaat acacttgaaa cttcaccatc gggcaatatt    780 

cacggcatgc cgctcgcggt cagcctaggc attggccacg agtcactggt taaccttgaa    840 

ggctacgcgc ctaaaatcaa accggaaaac gtcgtcatca ttggcgcccg gtcacttgat    900 

gaaggggagc gcaagtacat taaggaaagc ggcatgaagg tgtacacaat gcacgaaatc   960 

gatcgtcttg gcatgacaaa ggtcattgaa gaaacccttg attatttatc agcatgtgat  1020 

ggcgtccatc tgagccttga tctggacgga cttgatccga acgacgcacc gggtgtcgga  1080 

acccctgtcg tcggcggcat cagctaccgg gagagccatt tggctatgga aatgctgtat  1140 

gacgcaggca tcattacctc agccgaattc gttgaggtta acccgatcct tgatcacaaa  1200 

aacaaaacgg gcaaaacagc agtagagctc gtagaatccc tgttagggaa gaagctgctg  1260 

accaagggcg agcttgaagg taagcctatc cctaaccctc tcctcggtct cgattctacg  1320 

cgtaccggtc atcatcacca tcaccattga                                   1350 

<210>5 

<211>894 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<223>插入的精氨酸酶基因核苷酸序列 

<400>5 

gaaatggata aaacgatttc ggttattgga atgccaatgg atttaggaca agcacgacgc    60 

ggagtggata tgggcccgag tgccatccgg tacgctcatc tgatcgagag gctgtcagac   120 

atggggtata cggttgaaga tctcggtgac attccgatca atcgcgaaaa aatcaaaaat   180 

gacgaggaac tgaaaaacct gaattccgtt ttggcgggaa atgaaaaact cgcgcaaaag   240 

gtcaacaaag tcattgaaga gaaaaaattc ccgcttgtcc tgggcggtga ccacagtatt   300 

gcgatcggca cgcttgcagg cacagcgaag cattacgata atctcggcgt catctggtat   360 

gacgcgcacg gcgatttgaa tacacttgaa acttcaccat cgggcaatat tcacggcatg   420 

ccgctcgcgg tcagcctagg cattggccac gagtcactgg ttaaccttga aggctacgcg   480 

cctaaaatca aaccggaaaa cgtcgtcatc attggcgccc ggtcacttga tgaaggggag   540 

cgcaagtaca ttaaggaaag cggcatgaag gtgtacacaa tgcacgaaat cgatcgtctt   600 

ggcatgacaa aggtcattga agaaaccctt gattatttat cagcatgtga tggcgtccat    660 

ctgagccttg atctggacgg acttgatccg aacgacgcac cgggtgtcgg aacccctgtc    720 

gtcggcggca tcagctaccg ggagagccat ttggctatgg aaatgctgta tgacgcaggc    780 

atcattacct cagccgaatt cgttgaggtt aacccgatcc ttgatcacaa aaacaaaacg    840 

ggcaaaacag cagtagagct cgtagaatcc ctgttaggga agaagctgct gacc          894 

<210>6 

<211>449 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<223>融合枯草芽孢杆菌精氨酸酶蛋白的氨基酸残基序列 

<400>6 

MGSDKIIHLT DDSFDTDVLK ADGAILVDFW AHWCGPCKMA DEYIAPILDE IQGKLTVAKL     60 

NIDHNPGTAP KYGIRGIPTL LLFKNGEVAA TKVGALSKGQ LKEFLDANLA GSGSGDDDDK    120 

LALEMDKTIS GMPMVIDLGQ ARRGVDMGPS AIRYAHLIEK LSTVEDDMGY LGDIPINREK    180 

IKNDEELKNL NSVLAGNEKL AQKVNKVIEE KKFPLVLGGD HSIAIGTLAG TAKHYDNLGV    240 

IWYDAHGDLN TLETSPSGNI HGMPLAVTLG IGHESLVNLE GYALKIKPEN VVIIGARSLD    300 

EGERKYIKES GMKVYTMHEI DRLGMTKVIE ETLDYLSACD GVHLSLDLDG LDPNDAPGVG    360 

TLVVGGISYR ESHLAMEMLY DAGIITSAEF VEVNPILDHK NKTKTAVGEL VESLLGKKLL    420 

TKGELEGKPI PNPLLGLDST RTGHHHHHH                                      449 

<210>7 

<211>298 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<223>插入DNA序列编码的氨基酸残基序列 

<400>7 

EMDKTISGMP MVIDLGQARR GVDMGPSAIR YAHLIEKLST VEDDMGYLGD IPINREKIKN     60 

DEELKNLNSV LAGNEKLAQK VNKVIEEKKF PLVLGGDHSI AIGTLAGTAK HYDNLGVIWY    120 

DAHGDLNTLE TSPSGNIHGM PLAVTLGIGH ESLVNLEGYA LKIKPENVVI IGARSLDEGE    180 

RKYIKESGMK VYTMHEIDRL GMTKVIEETL DYLSACDGVH LSLDLDGLDP NDAPGVGTLV    240 

VGGISYRESH LAMEMLYDAG IITSAEFVEV NPILDHKNKT KTAVGELVES LLGKKLLT      298 

<210>8 

<211>296 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<223>枯草芽孢杆菌精氨酸酶氨基酸残基序列 

<400>8 

MDKTISGMPM VIDLGQARRG VDMGPSAIRY AHLIEKLSTV EDDMGYLGDI PINREKIKND     60 

EELKNLNSVL AGNEKLAQKV NKVIEEKKFP LVLGGDHSIA IGTLAGTAKH YDNLGVIWYD    120 

AHGDLNTLET SPSGNIHGMP LAVTLGIGHE SLVNLEGYAL KIKPENVVII GARSLDEGER    180 

KYIKESGMKV YTMHEIDRLG MTKVIEETLD YLSACDGVHL SLDLDGLDPN DAPGVGTLVV    240 

GGISYRESHL AMEMLYDAGI ITSAEFVEVN PILDHKNKTK TAVGELVESL LGKKLL        296 

序列表

Claims (7)

1.一种大肠杆菌基因工程菌株：TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO.M2010358。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：菌株是大肠杆菌E.coli TOP10菌株，携带有pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub重组质粒，能够高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶，所表达产生的精氨酸酶蛋白的N-末端连接着HP-硫氧还蛋白引导肽链，C-末端带有V5-抗原决定部位和多组氨酸标签。

3.根据权利要求1、2所述的大肠杆菌工程菌株，其构建方法包括以下步骤：

第一步：采用PCR技术把枯草芽孢杆菌，保藏号CCTCC No.93009，的精氨酸酶基因扩增出来，扩增的双链DNA的两条链的3’一端都具有一个突出的脱氧腺苷酸，A，扩增的DNA片断记作argBsub，把此DNA片断和质粒pBAD/Thio-TOPO进行TA连接，得到重组质粒pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub，

第二步：用重组质粒pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub转化大肠杆菌宿主菌E.coliTOP10，得到高水平表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的基因工程菌株：TOP10/pBAD/Thio-TOPO-arg-Bsub。

4.根据权利要求3所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于：精氨酸酶基因是来自枯草芽孢杆菌保藏号CCTCC No.93009的基因组DNA。

5.根据权利要求3所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于：构建重组质粒pBAD/Thio-TOPO-argBsub，其扩增基因时使用的两个引物的序列如下：

引物P1：5′-GAAATGGATAAAACGATTTCGGTTAT-3′，共26bp。

引物P2：5′-GGTCAGCAGCTTCTTCCCTAACA-3′，共23bp。

6.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：该菌株能够转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸。

7.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：该培养物的培养条件和保存方法分别是：

培养基：LB培养基，称取10g蛋白胨、5g酵母粉与10gNaCL溶于950ml的水中，调pH至7.0后，加水定容到1000ml，分装成100ml份的三角瓶备用：

含100μg/ml Amp的3.5mlLB培养基试管：取分装有LB培养基的三角瓶，盖上瓶塞，121℃灭菌20min，待温度降至40℃以下时，加入5％的Amp储存液200μl，混匀后立即无菌分装3.5ml培养基到已灭好菌的玻璃试管，得到含100μg/ml Amp的3.5mlLB培养基试管，用于工程菌株的试管培养；

含100μg/ml Amp的LB培养基玻璃平板：取分装有LB培养基的三角瓶，分别称取1.5g琼脂粉加进含100mlLB培养基的三角瓶中，盖上瓶塞，121℃灭菌20min，待温度降至45℃以下时，加入5％的Amp储存液200μl，混匀后立即分装15-18ml培养基到已灭好菌的玻璃平板中，待培养基凝固后，置于4℃的冰箱中保存备用；

菌株培养条件和保存方法：把构建和筛选出来的工程菌株，涂布在含100μg/mlAmp的LB培养基的玻璃平板上，37℃培养，将平板上长出的单菌落接种到含100μg/mlAmp的3.5mlLB培养基试管中，pH7.0，37℃，225r/min，振荡培养过夜，9小时，用灭菌吸管吸取0.85ml细菌培养液，添加到灭菌的含有0.15ml甘油的试管中，混匀，低温保存；

长期保存方法：冷冻真空干燥法。

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