CN105087628A - 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法 - Google Patents
一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105087628A CN105087628A CN201510526225.5A CN201510526225A CN105087628A CN 105087628 A CN105087628 A CN 105087628A CN 201510526225 A CN201510526225 A CN 201510526225A CN 105087628 A CN105087628 A CN 105087628A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- orn
- argi
- ornithine
- recombinant
- arginase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 67
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 13
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 title abstract description 28
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 title abstract description 22
- 241000424760 Corynebacterium crenatum Species 0.000 title abstract description 4
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 title 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 18
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 18
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 11
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 229940075612 bacillus cereus Drugs 0.000 claims description 8
- 101150094408 argI gene Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 5
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 abstract 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 abstract 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N Acrolein Chemical compound C=CC=O HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical class [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 2
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000011091 sodium acetates Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- SLPUVFBNQHVEEU-WCCKRBBISA-N (2s)-2,5-diaminopentanoic acid;2-oxopentanedioic acid Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)CCC(=O)C(O)=O SLPUVFBNQHVEEU-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-SCSAIBSYSA-N D-Ornithine Chemical compound NCCC[C@@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N Ethyl hydrogen sulfate Chemical compound CCOS(O)(=O)=O KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IXHTVNGQTIZAFS-BYPYZUCNSA-N L-arginine hydroxamate Chemical compound ONC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IXHTVNGQTIZAFS-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940075858 ornithine alpha-ketoglutarate Drugs 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940049547 paraxin Drugs 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000004143 urea cycle Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
通过大肠杆菌和钝齿棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将来源于Bacillus？cereus的精氨酸酶成功在C.crenatum？SDNN403中表达。酶活测定结果表明，原始菌不具有精氨酸酶的活性，而重组工程菌的精氨酸酶酶活达到24.3U/mg。以此工程菌全细胞菌体作为生物催化剂，以L-精氨酸作为底物，同时基于精氨酸酶酶学性质，确定了最佳的反应温度为40℃和pH为9.0。将200ml？LBG培养的重组菌菌体重新悬浮于200ml的底物缓冲液中，在最佳的转化条件下进行转化法生产L-鸟氨酸。8h后可以得到149.2g/L的L-鸟氨酸，底物L-精氨酸的摩尔转化率达到99.5％。本发明方法生产L-鸟氨酸具有效率高，专一性强，能耗低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及到精氨酸酶基因的克隆表达获得重组工程菌，同时将该工程菌应用于L-鸟氨酸的生产，属于生物工程和生物技术领域。
技术背景
L-精氨酸酶(E.C.3.5.3.1)是尿素循环中的一种关键酶，其催化L-精氨酸形成L-鸟氨酸和尿素，精氨酸酶广泛存在于各种动植物和微生物体内，来源于Bacillusbrevis，Bacillussubtilis和Bacillusthuringiensis等微生物的精氨酸酶已经获得较好的研究。
鸟氨酸是一种碱性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有机溶剂。鸟氨酸接受二分子NH4 +和一分子CO2形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被水解成鸟氨酸和尿素。
L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，是精氨酸和脯氨酸合成的重要前体物质。同时L-鸟氨酸是人体内尿素循环的重要中间代谢产物，因此其对肝脏的解毒功能具有重要的保障作用。L-鸟氨酸能够刺激体内生长激素的分泌，促进蛋白质的合成以及糖类和脂质的分解代谢作用。L-鸟氨酸和其他氨基酸一起制成的复方氨基酸有很好的保肝护肝以及激发病态下肝脏的活力的作用。联合使用L-鸟氨酸和苯乙酸能有效治疗肝性脑病，特别是对于鸟氨酸循环障碍的患者，L-鸟氨酸能通过促进谷氨酰胺的合成和排泄来稳定的降低患者血氨浓度。鸟氨酸α-酮戊二酸盐是很好的临床营养剂，促进外科创伤病人的恢复，改善慢性营养不良，改善免疫功能。同时鸟氨酸和苹果酸盐和柠檬酸盐合用能够改善食品和饮料的口味，减少苦味。在欧洲、美国以及日本，L-鸟氨酸都是作为膳食药物来销售的。
工业上L-鸟氨酸的合成包括化学合成法、微生物发酵法和L-精氨酸水解法。化学合成作为早期L-鸟氨酸的生产方法，一般以丙烯醛、氰化氢、氨气、CO2为原料合成L-鸟氨酸。但效果并不是很理想，主要表现在于合成的步骤繁琐，产物得率低，而且得到的产物是L-鸟氨酸和D-鸟氨酸的混合物，为后期的分离纯化带来很大的困难。同时化学法合成L-鸟氨酸由于其环境的危害性，越来越不被现代工业所接受。生物合成法相对化学合成法具有生产成本较低，环境污染小等优点而受到重视。微生物发酵生产L-鸟氨酸主要是通过诱变或者基因工程的方法获得L-鸟氨酸高产菌株，以较为便宜的葡萄糖甚至是淀粉等最为初始原料合成L-鸟氨酸。在这方面日本起步较早，上世纪五六十年代就开始鸟氨酸生产的研究，主要以诱变筛选为主。1957年kinoshita等首先报道了利用谷氨酸棒状杆菌的瓜氨酸或精氨酸的突变株发酵生产鸟氨酸。此后，okumuraheShibuya等人在这方面也做了大量的工作总结出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌以及具有精氨酸和瓜氨酸，以及霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株用于工业生产中。国内陈宁、刘树庆等人在1999年开始研究鸟氨酸的生产，并以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过硫酸二乙酯和紫外线诱变定向选育出一种鸟氨酸生产菌，并通过发酵优化使得鸟氨酸产量达到9.85g/L。近几年，随着代谢工程技术的兴起，通过代谢工程改造的方法，鸟氨酸的发酵生产取得一定的进展，其中，中山大学蒋玲艳等人以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过表达异源的谷氨酸脱氢酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，增加代谢流中NADPH的含量，使得L-鸟氨酸产量得到提高，最终到14.8g/L，而后蒋又通过代谢进化和代谢工程的方法，最后得到鸟氨酸的产量为24.1g/L。通过发酵法进行鸟氨酸生产可以利用较简单的碳源，如葡萄糖等，成本非常低廉，适合于工业的发展，但发酵周期一般都相对较长，而且发酵的产量较低对于后期分离需要较高的技术需求。
L-精氨酸水解法生产L-鸟氨酸包括，碱水解法和酶水解法，特别是酶水解，由于其反应效率高，产物转专一性高而受到越来越多的重视。近几年，国内有人开始尝试以精氨酸为底物进行酶转化法生产L-鸟氨酸。北京化工大学徐焘，通过筛选得到一株精氨酸酶活力较高的苏云金芽孢杆菌，以此细胞作为生物催化剂，以L-精氨酸为底物进行L-鸟氨酸生产，并最终得到43.57g/LL-鸟氨酸。而后张涛等人提取苏云金芽孢杆菌的精氨酸酶，以精氨酸为底物，精氨酸酶纯酶作催化剂，并最终得到72.1g/L的精氨酸酶。宋伟等人构建表达外源精氨酸酶的E.coliBL21，并以重组细胞为催化剂，L-精氨酸为底物，最终得到112.3g/L的L-鸟氨酸
本发明通过表达载体pXMJ19，实现了将来源于Bacilluscereus的精氨酸酶基因argI成功在钝齿棒杆菌CorynebacteriumcrenatumSDNN403(该菌株为本课题组多年研究，产用传统诱变方法获得一株菌株，保藏编号CGMCC0890，专利号为：ZL03112896.3)中进行高效表达，并利用此基因工程菌的全细胞作为生物催化剂，以L-精氨酸为底物，实现了L-鸟氨酸的高效生产。
发明内容
本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自Bacilluscereus的精氨酸酶基因argI，构建重组表达载体pXMJ19-argI，并通过电转化方法将其转化至C.crenatumSDNN403中，成功构建了基因工程菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI。酶活力测定结果发现重组C.crenatumSDNN403工程菌的精氨酸酶活实现从无到有，比酶活达到24.3U/mg。基于获得的基因工程菌，对该菌株用于转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸进行了初步的研究。在8h内，L-鸟氨酸的产量为149.2g/L，精氨酸摩尔转化率达到99.5％。
本发明采取的技术方案：
精氨酸酶基因工程菌，是将出发菌株Bacilluscereus的精氨酸酶基因连接在表达载体pXMJ19上，并转化至C.crenatumSDNN403得到重组菌株。以该工程菌为基础，基于精氨酸酶酶学性质为基础，以L-精氨酸为底物，构建转化化法生产L-鸟氨酸的最佳转化体系，实现高效生产L-鸟氨酸的方法。
1.精氨酸酶引物设计
根据NCBI中Bacilluscereus全基因组核酸序列中argI基因序列，设计精氨酸酶基因的PCR引物P1和P2。
F：5’-ACCCGAAGCTTATGAAAAAAGAAATCTCAGTTATTGG-3’(HindIII)
R：5’-ACCGGGATCCTTATTTTAGTTTTTCACCGAATAAAG-3’(BamHI)
2.重组表达载体pXMJ19-argI的构建
参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与pMD18-Tvector过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamHI/hindIII酶切释放出大小为2.7kb和894bp的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-argI。
提取保存于E.coliJM109中的质粒pMD18-T-argI和pXMJ19，质粒pMD18-T-argI和pXMJ19经BamHI/hindIII双酶切，胶回收纯化，16℃过夜连接，将连接物热击转化E.coliJM109感受态细胞，用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，提取转化子质粒，重组质粒经BamHI/HindIII双酶切后释放出大小为6.6kb和894bp的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pXMJ19-argI。
3.重组质粒pXMJ19-argI转化模式菌株C.crenatumSDNN403
将经验证构建成功的重组质粒pMA5-argI通过电击转化法转化至模式菌株C.crenatumSDNN403中。
4.重组菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI阳性转化子的筛选
挑取在具有氯霉素抗性平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。
5.重组菌株酶活力测定
酶活测定方法：配制0.2M底物L-精氨酸(0.2M碳酸盐缓冲液，pH9.0)，取0.9ml底物溶液，加入0.1ml酶液，40℃反应10min。将酶反应液稀释相应的倍数，取1ml稀释后的反应液，用Chinard比色法测定反应液中L-鸟氨酸的含量。酶活定义单位为1min催化1umolL-精氨酸转化成L-鸟氨酸所需的酶量。
Chinard比色法：1ml标准液中依次加入1ml的冰醋酸，1ml混合酸(茚三酮溶液)，于沸水浴中反应1h，测定515nm下的吸光度值。
6.重组菌全细胞转化法生产L-鸟氨酸
以重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ-argI的微生物菌体为生物催化剂。以一定浓度的L-精氨酸为底物，在最佳转化体系下进行转化法生产L-鸟氨酸。用高效液相色谱法测定转化液中L-鸟氨酸和L-精氨酸的含量。
氨基酸分析色谱条件
(a)色谱柱：安捷伦色谱柱TC-C18250*4.6*5
(b)柱温：40℃
(C)流动相：A相：称取8.0克结晶乙酸钠于1000毫升烧杯中，加入1000毫升水搅拌至所有结晶水溶解，再加入225微升三乙胺，搅拌并滴加5％的醋酸，将PH调到7.20±0.05；加入5毫升四氢呋喃，混合后备用。
B相：称取12.0克结晶乙酸钠于800毫升烧杯中；加入400毫升水搅拌至所有结晶溶解；滴加5％醋酸将PH调到7.20±0.05；将此溶液加入800毫升乙腈和800毫升甲醇，混合后备用。
(d)检测器：紫外检测器338nm
本发明的优点和积极效果是：
(1)本发明首次在C.crenatumSDNN403中克隆表达了来源于Bacilluscereus的精氨酸酶基因argI。实现了精氨酸酶在C.crenatumSDNN403中的高效表达，重组菌中精氨酸的酶活的达到24.3U/mg
(2)本发明基于精氨酸酶基因在C.crenatumSDNN403中的高效表达，研究了了转化法产L-鸟氨酸，并在8h内获得了149.5g/L的L-鸟氨酸。精氨酸的摩尔转化率达到99.5％。本次发明采用转化法生产L-鸟氨酸，具有产物专一性强、转化效率高等优点。
具体实施方式
实施例1：精氨酸酶引物设计
根据NCBI中Bacilluscereus全基因组核酸序列中argI基因序列，设计精氨酸酶基因的PCR引物P1和P2。
F：5’-ACCCGAAGCTTATGAAAAAAGAAATCTCAGTTATTGG-3’(HindIII)
R：5’-ACCGGGATCCTTATTTTAGTTTTTCACCGAATAAAG-3’(BamHI)
实施例2：精氨酸酶基因的克隆
以Bacilluscereus总DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，45s，35个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTPMix4μL，10×ExTaqBuffer5μL，灭菌的双蒸水37μL，ExTaqDNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5ml的离心管中，-20℃冰箱保存备用。回收产物与pMD18-TVector连接，连接产物转化E.coilJM109，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-argI，经酶切验证连接成功后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏。
实施例3：重组质粒pXMJ19-argI的构建
提取保存于E.coliJM109中的质粒pMD18-T-argI和pXMJ19，并分别用BamHI和HindIII进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7μL，pXMJ19酶切产物1μL，T4DNA连接酶buffer1μL，T4DNA连接酶1μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pXMJ9-argI转化到感受态E.coilJM109，用LB氯霉素抗性培养基，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pXMJ9-argI，酶切验证正确后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏备用。
实施例4：重组质粒pXMJ9-argI转化C.crenatumSDNN403
感受态制备：挑取C.crenatumSDNN403接种于一支10mlLBG(LB+0.5％葡萄糖)液体培养基，30℃摇床培养过夜，取500μL过夜培养的菌液转接入含3％甘氨酸和0.1％吐温-80的50ml液体LB培养基中，使得初始细胞OD600达到0.3于30℃，200r/min培养到细胞OD600达到0.9。细胞培养结束后将菌液预冷15min，然后离心收集菌体。用预冷的10％甘油洗涤菌体4次，最后用0.2ml10％甘油重悬细胞，用1.5ml管分装，每管80ul直接用于电转化。
电转：1800V电转5ms，电转后加入800ulLB培养基30℃培养2-3h
重组菌获得：涂布于氯霉素抗性LBG培养基，30℃培养，挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，得到重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI。
实施例5：重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI精氨酸酶活力测定
将实施例4构建的重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI，与出发菌株C.crenatumSDNN403分别接种于10ml含氯霉素的LBG培养基中，30℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50mlLBG培养基中，30℃培养8h后至OD600为0.9时加入终浓度为0.7mM的IPTG，30℃诱导8h，取发酵液于4℃，10000r/min离心10min，pH7.0的Tris-HCl缓冲液清洗3次，最后用5mlpH7.0Tris-HCl缓冲液中。超声波破碎处理制备粗酶液。
配制0.2M底物L-精氨酸(pH9.0,0.2M碳酸盐缓冲液)，取0.9ml底物溶液，加入0.1ml酶液，40℃反应10min。将酶反应液稀释相应的倍数，取1ml稀释后的反应液，用Chinard比色法测定反应液中L-鸟氨酸的含量。酶活定义单位为1min催化1umolL-精氨酸转化成L-鸟氨酸所需的酶量。
Chinard比色法：1ml标准液中依次加入1ml的冰醋酸，1ml混合酸(茚三酮溶液)，于沸水浴中反应1h，测定515nm下的吸光度值。
结果表明重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI表达的精氨酸酶比酶活为24.3U/mg，而原始菌C.crenatumSDNN403并没有检测到精氨酸的酶活，从而实现了在C.crenatumSDNN403中精氨酸酶酶活力的从无到有。
实施例6：重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI全细胞转化法生产L-鸟氨酸
重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI接种于200mlLBG培养基中培养8h后加入终浓度为0.7mM的IPTG，30℃诱导8h后，获得细胞。pH7.0Tris-HCl洗涤两次后重悬于200ml底物缓冲液(0.2M磷酸盐缓冲液，200g/LL-精氨酸，0.5mMMn2+，pH9.0)，40℃转化8h后用高效液相色谱法(HPLC)测定转化液中L-鸟氨酸和L-精氨酸的含量。
结果表明，转化8h后，转化液中的L-鸟氨酸的含量的149.4g/L，L-精氨酸的摩尔转化率为99.5％。
Claims (5)
1.一种新型重组表达载体的构建，其特征是以Bacilluscereus基因组DNA为模板，扩增得到精氨酸基因argI，将其克隆到表达载体pXMJ19上，构建重组表达型质粒pXMJ19-argI。
2.一株具有较高精氨酸酶酶活的重组基因工程菌，其特征是将权利要求1中构建的重组载体pXMJ19-argI用电击转化法转化到C.crenatumSDNN403中，argI在IPTG诱导下能够高效的表达。
3.根据权利要求2所述的高精氨酸酶酶活的基因工程菌应用于全细胞转化法生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，以重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI全细胞作为生物催化剂，以L-精氨酸为底物进行转化法生产L-鸟氨酸。
4.权利要求3所述的生产L-鸟氨酸的方法，其特征是：重组菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI接种于10mLLBG培养基中，30℃振荡培养12h后，取2ml转接于200mlLBG(LB+0.5％葡萄糖)30℃培养8h后，添加终浓度为0.7mM的IPTG对重组菌的精氨酸酶进行诱导表达，诱导10h后离心收集重组菌细胞，重悬于200ml底物缓冲液，用于全细胞转化生产L-鸟氨酸。
5.权利要求2所述的菌株在权利要求4所述的菌体培养策略下在转化法生产L-鸟氨酸中的方法，其特征是：优选催化温度为40℃，优选转化pH为9.0，优选Mn2+添加浓度为0.5mM，200g/L底物L-精氨酸，以0.3M碳酸盐为缓冲液，转化合成L-鸟氨酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510526225.5A CN105087628A (zh) | 2015-08-25 | 2015-08-25 | 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510526225.5A CN105087628A (zh) | 2015-08-25 | 2015-08-25 | 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105087628A true CN105087628A (zh) | 2015-11-25 |
Family
ID=54568960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510526225.5A Pending CN105087628A (zh) | 2015-08-25 | 2015-08-25 | 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105087628A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522171A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-03-19 | 浙江中山化工集团股份有限公司 | 一种工程菌、含鸟氨酸溶液的处理方法及试剂盒 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1441055A (zh) * | 2003-02-25 | 2003-09-10 | 江南大学 | 一种生产l－精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l－精氨酸的方法 |
| CN102234624A (zh) * | 2011-04-25 | 2011-11-09 | 武汉远大弘元股份有限公司 | 一种表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的基因工程菌及构建方法 |
| CN102433288A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-05-02 | 江南大学 | 一种产鸟氨酸的菌株及用该菌株生物合成鸟氨酸的方法 |
| US20130309733A1 (en) * | 2012-05-21 | 2013-11-21 | Cathay R&D Center Co., Ltd. | Stabilized recombinant expression plasmid vector in hafnia alvei and applications thereof |
| CN103923936A (zh) * | 2013-12-05 | 2014-07-16 | 江南大学 | 一种产精氨酸酶工程菌的构建及应用该菌生产l-鸟氨酸 |
| CN103966151A (zh) * | 2013-01-29 | 2014-08-06 | 上海凯圣生物科技有限公司 | 产l-精氨酸的基因工程菌的构建方法及其用途 |
| CN104031933A (zh) * | 2014-05-08 | 2014-09-10 | 江南大学 | 一株l-鸟氨酸合成菌的构建及其应用方法 |
| CN104830922A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-08-12 | 南京大学 | L-鸟氨酸酶法转化制备方法 |
-
2015
- 2015-08-25 CN CN201510526225.5A patent/CN105087628A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1441055A (zh) * | 2003-02-25 | 2003-09-10 | 江南大学 | 一种生产l－精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l－精氨酸的方法 |
| CN102234624A (zh) * | 2011-04-25 | 2011-11-09 | 武汉远大弘元股份有限公司 | 一种表达产生枯草芽孢杆菌精氨酸酶的基因工程菌及构建方法 |
| CN102433288A (zh) * | 2012-01-16 | 2012-05-02 | 江南大学 | 一种产鸟氨酸的菌株及用该菌株生物合成鸟氨酸的方法 |
| US20130309733A1 (en) * | 2012-05-21 | 2013-11-21 | Cathay R&D Center Co., Ltd. | Stabilized recombinant expression plasmid vector in hafnia alvei and applications thereof |
| CN103966151A (zh) * | 2013-01-29 | 2014-08-06 | 上海凯圣生物科技有限公司 | 产l-精氨酸的基因工程菌的构建方法及其用途 |
| CN103923936A (zh) * | 2013-12-05 | 2014-07-16 | 江南大学 | 一种产精氨酸酶工程菌的构建及应用该菌生产l-鸟氨酸 |
| CN104031933A (zh) * | 2014-05-08 | 2014-09-10 | 江南大学 | 一株l-鸟氨酸合成菌的构建及其应用方法 |
| CN104830922A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-08-12 | 南京大学 | L-鸟氨酸酶法转化制备方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| CHEN XUE LAN等: "Expression and Characterization of ArgR, An Arginine Regulatory Protein in Corynebacterium crenatum", 《BIOMED ENVIRON SCI》 * |
| MEIJUAN XU等: "The Role of ARGR Repressor Regulation on L-arginine Production in Corynebacterium crenatum", 《APPL BIOCHEM BIOTECHNOL》 * |
| WEI SONG等: "Enzymatic production of l-ornithine from l-arginine withrecombinant thermophilic arginase", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 * |
| WENFANG DOU等: "Improvement of L-Arginine Production by Overexpression of a Bifunctional Ornithine Acetyltransferase in Corynebacterium crenatum", 《APPL BIOCHEM BIOTECHNOL》 * |
| 方建军等: "微生物法生产鸟氨酸的代谢工程研究进展", 《中国食品工业》 * |
| 赵芹芹等: "钝齿棒杆菌的代谢改造：L-鸟氨酸与L-瓜氨酸合成菌株的构建", 《微生物学报》 * |
| 黄仲华主编: "《中国调味食品技术实用手册》", 28 February 1991 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522171A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-03-19 | 浙江中山化工集团股份有限公司 | 一种工程菌、含鸟氨酸溶液的处理方法及试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI744639B (zh) | 從細菌發酵過程中獲得富含蛋白質的營養補充劑的方法 | |
| CN105062941A (zh) | 一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法 | |
| WO2019085445A1 (zh) | 生产l-赖氨酸的重组菌、其构建方法以及l-赖氨酸的生产方法 | |
| CN102154345B (zh) | 谷氨酸脱羧酶基因及其应用 | |
| CN113481185B (zh) | 一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用 | |
| WO2017080111A1 (zh) | 一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法 | |
| CN102154393A (zh) | 一种γ-氨基丁酸的生产方法及其生产菌株 | |
| WO2022174597A1 (zh) | 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用 | |
| CN112708589B (zh) | 一种基因工程菌及其构建方法与在发酵产5-羟基色氨酸上的应用 | |
| CN109321590A (zh) | 利用乙酸生产l-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN105238732A (zh) | 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-瓜氨酸的方法 | |
| CN104195190A (zh) | 一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5-氨基乙酰丙酸的方法 | |
| CN108504617A (zh) | 一种高产l-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法 | |
| CN104046586B (zh) | 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用 | |
| CN103205391A (zh) | 一种基因工程菌及其应用 | |
| CN105112437A (zh) | 一种利用重组钝齿棒杆菌一步发酵法生产l-鸟氨酸的方法 | |
| CN104278003A (zh) | 生产d-乳酸的重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN113151199B (zh) | 一种具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| CN103421734A (zh) | 一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用 | |
| CN105087628A (zh) | 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法 | |
| CN114921392B (zh) | 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法 | |
| CN105200075B (zh) | 用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法 | |
| CN107805621A (zh) | 一种利用大肠杆菌合成反式‑4‑羟基‑l‑脯氨酸的方法 | |
| CN106434611A (zh) | 一种以l‑精氨酸为原料的l‑鸟氨酸双酶耦合制备方法 | |
| CN107236753A (zh) | 异丁香酚单加氧酶活性聚集体的构建方法及转化异丁香酚生产香草醛的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Rao Zhiming Inventor after: Wang Meizhou Inventor after: Xu Meijuan Inventor after: Zhang Xian Inventor after: Yang Taowei Inventor after: Zhang Lele Inventor before: Rao Zhiming Inventor before: Wang Meizhou Inventor before: Xu Meijuan Inventor before: Zhang Xian Inventor before: Yang Taowei |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160206 Address after: 214122 Jiangsu Province, Wuxi City Lake Road No. 1800, Jiangnan University Applicant after: Jiangnan University Applicant after: Institute of food biotechnology, Jiangnan University (Rugao) Address before: 214122 Jiangsu Province, Wuxi City Lake Road No. 1800, Jiangnan University Applicant before: Jiangnan University Applicant before: Institute of food biotechnology, Jiangnan University (Rugao) Applicant before: RUGAO JIANGDA FOOD BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE CO., LTD. |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151125 |