CN103966151A - 产l-精氨酸的基因工程菌的构建方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产L-精氨酸的基因工程菌的构建方法和用途。本发明公开了一种新的生产L-精氨酸的基因工程菌菌株，为重组质粒pXMJ19-argH先后转化导入大肠杆菌和营养缺陷型黄色短杆菌AN78中，然后将含重组质粒的AN78中精氨酸琥珀酸酶过表达并且发酵生产L-精氨酸。本发明进一步公开了上述工程菌的构建方法及其用途。可以利用本发明构建的基因工程菌生产L-精氨酸，提高产量、降低生产成本。

Description

产L-精氨酸的基因工程菌的构建方法及其用途

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及生产L-精氨酸的基因工程菌，其构建方法及其用途。

背景技术

L-精氨酸（L-argnine，简称L-Arg）是一种含有胍基的碱性氨基酸，是人体代谢的一种重要氨基酸，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，在医药、食品和饲料添加剂等行业具有广泛的用途，临床上，除作为复方氨基酸输液的主要组分之一外，L-精氨酸及其盐类还广泛用于治疗各类肝昏迷忌用谷氨酸钠者和病毒性肝类谷丙转氨酶异常者，对病毒性肝炎疗效显著。对肠道溃疡、血栓形成和神经衰弱等症都有治疗效果。另外，L-精氨酸是运动营养饮料配方的重要组成部分，也是一种重要的饲料添加剂，在世界养殖业中有广泛地应用。

近年来，随着人民生活水平的逐步提高，人们对健康方面给于越来越多的关注，L-精氨酸的需求量也在逐年上升。目前全世界L-精氨酸年需求量达15000吨以上，实际年产量不到8000吨左右，主产地集中在日本和欧洲等国家和地区。我国目前实际年产量不到1200吨，产品主要出口到欧美等国家和地区，且其需求量每年以15%的速度递增。

L-精氨酸工业化生产的技术工艺主要有两条：即蛋白质水解提取技术工艺；生物发酵技术工艺。国际上著名的大公司如日本味之素、协和发酵和德国迪高沙主要采用生物发酵和基因工程技术进行大规模生产L-精氨酸产品。

由于L-精氨酸具有重要的应用价值,国内不少研究者正致力于L-精氨酸的开发研究,如高产菌的选育、工程菌的构建、发酵工艺条件的优化等。这些研究的成功将促进L-精氨酸水平的提高,有望彻底改变L-精氨酸依赖进口的被动局面,具有相当的经济效益和社会效益。

L-精氨酸的整个代谢途径如图1.所示。由图可知,从中间代谢产物谷氨酸到终产物精氨酸的代谢途径是一个没有分枝的合成途径,L-精氨酸是合成途径的最终产物,此段合成途径有八步反应。根据精氨酸的生物合成途径及代谢调节机制可知:精氨酸是非支路代谢途径的终产物,并且精氨酸本身是其合成代谢的调节因子,所以精氨酸发酵不能用阻断代谢流或选育营养缺陷型菌种发酵方法。

随着基因工程技术的发展，它在精氨酸高产菌选育中的应用有很多成功的例子。利用DNA 重组技术将精氨酸生物合成有关的酶基因片段插入质粒后再导入精氨酸产生菌,使目的基因拷贝数扩增,从而增加酶的合成量,提高精氨酸产量。1983 年,滕亦等将精氨酸生物合成有关的基因进行克隆。然后将含精氨酸生物合成酶系基因群及卡那霉素抗性基因的重组质粒 pEArg1导入到宿主谷氨酸棒杆菌ATCC 13032 ,哈库利棒杆菌ATCC 13868 及黄色短杆菌ATCC 14067 中,构建精氨酸工程菌, 经72 h 培养精氨酸产量分别为1.6 mg/ml、1.8 mg/ml、1.0 mg/ml。虽然利用基因工程构建L-精氨酸高产菌株是一种高效率、理性化的育种手段，但迄今为止，尚未有高产重组菌的报道。

黄色短杆菌属于革兰式阳性菌，是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株。从精氨酸在黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌利用循环途径由谷氨酸合成精氨酸（图1）可以看出，精氨酸是由瓜氨酸透过胞质酵素精氨基琥珀酸合成酶（AS）及精氨基琥珀酸裂解酶（AL）合成。精氨酸琥珀酸酶（Argininosuccinate E.C.4.3.2.1）（AL）是合成途径中的最后一个酶，催化底物精氨酸琥珀酸合成精氨酸，如果我们将精氨酸琥珀酸酶基因过表达，从瓜氨酸到精氨酸的转化可能就会加速或提高。按照这一思路，我们首先克隆来自于谷氨酸棒杆菌的精氨酸琥珀酸酶（AL）的编码基因argH， 与并在大肠杆菌BL21和黄色短杆菌AN78中高效表达。因此，构建了重组黄色短杆菌／pXMJ19-argH，在黄色短杆菌AN78中加强AL的本底表达，并对重组黄色短杆菌杆菌进行酶活和发酵产精氨酸初步分析。

发明内容

本发明的技术方案如下：

总体技术方案是克隆包括谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等谷氨酸棒杆菌精氨酸琥珀酸酶的基因，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建重组表达载体，将精氨酸琥珀酸酶基因克隆到合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、酵母、CHO 细胞、昆虫细胞等。

1. 基因模板提取：将待精氨酸琥珀酸酶基因的菌株在肉汁培养基等谷氨酸棒杆菌能够生长的培养基中，培养到合适的菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂盒方法提取菌体DNA，作为基因扩增的模板。

2. 精氨酸琥珀酸酶基因的克隆：根据出发菌株的碱基特征和精氨酸琥珀酸酶基因的保守序列，设计引物，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂个方法，通过PCR扩增精氨酸琥珀酸酶基因。

3. 转化载体的构建、转化和转化子筛选：按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可与从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。

4. 重组菌的摇瓶发酵：按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、方法，按照文献进行摇瓶发酵，紫外分光光度法检测L-精氨酸的含量.

发明效果

利用本技术方案涉及的方法，构建了基于精氨酸琥珀酸酶与pXMJ19的重组质粒，再将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21和筛选的高产突变株AN78中，诱导表达重组酶，以及摇瓶发酵的产L-精氨酸，以期实现高产菌株-黄色短杆菌AN78的重组菌中L-精氨酸产量的提高。

附图说明

图1 精氨酸生物合成途径。

图2 精氨酸琥珀酸酶的系统进化。利用已有的精氨酸琥珀酸酶序列和软件clustalxl.83的treeTop 程序（www.genebee.msu.su/genebee.html）进行比对（分支距离（X轴）代表利用 BLOSUM62）取代矩阵获得的亲缘关系。

图3 PCR产物1.2%琼脂糖凝胶电泳分析：1，2泳道是以AN78基因组为模板PCR产物；3泳道是以13032基因组为模板的PCR产物；4泳道是Marker，从上到下2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；5，6泳道是阴性对照。

图4 重组质粒pXMJ19-argH双酶切检测：1泳道是Marker，从上到下分别为，10000 bp，7000 bp，4000 bp，2000 bp，1000 bp，500 bp，250 bp；2泳道为EcoR I单酶切的质粒pXMJ19-argH；3泳道为BamH I单酶切的质粒pXMJ19-argH；4泳道为抽提的质粒，5泳道为EcoR I 和BamH I双酶切重组质粒pXMJ19-argH。

图5 SDS-PAGE分析诱导表达精氨酸琥珀酸酶：1泳道是BL21诱导破碎后上清分析蛋白；2泳道是未诱导BL21破碎后上清分析蛋白；3泳道是低蛋白Marker，从上到下是97.2kD，66.4 kD，44.3 kD，29 kD，20.1 kD，14.3 kD；4泳道是重组的AN78诱导后破碎上清分析；5泳道是重组AN78未诱导后破碎上清分析。

图6 L-精氨酸测定标准曲线。

具体实施方式

1. 材料与方法

1.1 菌株与质粒

黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）属于革兰式阳性菌，是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株，该细菌是营养缺陷型菌株，以下简称营养缺陷型AN78菌；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）菌株均为本实验室保藏；含穿梭载体pXMJ119的大肠杆菌DH10B，购于北大工学院绍兴技术研究院；谷氨酸棒杆菌ATCC 13032购自上海复祥生物科技有限公司。

1.2 试剂和材料

试验试剂：Taq DNA Ploymerase， DNA marker III和marker DL2000 购自宝生物工程（大连）有限公司； DNA 纯化试剂盒购自北京鼎国生物技术有限公司；限制性内切酶（ EcoR I 和BamH I），T4 DNA 连接酶和dNTP 购自Takara 公司； IPTG 购自北京鼎国生物技术有限公司； 氯霉素购自Genview公司；L-精氨酸购自sigma公司，其余化学试剂为分析纯，均可通过商业途径获得。

1.2.1 基因组的抽提，

谷氨酸棒杆菌基因组抽提使用的是TaKaRa 公司基因组抽提试剂盒，按照Kits 说明书进行操作。基因组DNA 溶于TE Buffer（PH 8.0）中。

1.2.2 质粒pXMJ19和pXMJ19-argH抽提

从大肠杆菌DH10B中抽提pXMJ19质粒使用的是北京鼎国生物技术有限公司的试剂盒。重组菌构建成功后抽提质粒的试剂盒产自OMEGA公司的革兰氏阳性菌抽提试剂盒。按照试剂盒操作说明书进行操作。质粒DNA 溶于TE Buffer（PH8.0）中。

1.2.3 目的基因argH 编码序列的扩增

根据GeneBank 登录的 ATCC13032 argH编码序列（GeneID：GenbankBA000036）设计一对引物（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）——P2，P3，序列以及酶切位点如下：

P ₂ ：5′-CGCGGATCCTTATCGACGTACCCCCGC-3′ BamH I 27bp

P ₃ ：5′-CGCGAATTCATGGAACAGCACGGAACC3′ EcoR I 27bp

PCR反应体系（25μl）：

10×PCR Buffer（含Mg²⁺）2.5 μl； 引物P₂/P₃(10μM)各1μl，模板2 μl，Taq 0.2 μl；

PCR 反应条件：

94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min；35个循环；72 ℃，10 min；1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测及纯化PCR 产物。

1.2.4目的基因在大肠杆菌DH5α克隆与鉴定

用EcoR I和BamH I双酶切PCR 产物和pXMJ19 载体（37℃），琼脂糖凝胶电泳纯化，回收酶切的基因片段和载体，然后T₄ DNA 连接酶16℃连接过夜，产物转化E.coli BL21（热激法）涂布于LB平板（含30μg/ml 的氯霉素）上，37℃培养。挑取阳性克隆培养并抽提质粒，PCR 和酶切鉴定重组质粒。将获得的重组质粒pXMJ19-argH送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.5重组pXMJ19-argH在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达表达

挑取重组菌BL21(pXMJ19 -argH)接种于含有氯霉素的LB培养基中，37 ℃震荡培养过夜。将过夜培养物接种于新鲜的含有氯霉素的LB中，接种量4%，振荡培养至OD₆₀₀=0.53，30℃下 IPTG诱导（终浓度0.5mM ）2 h后离心收集细胞；Buffer A 重悬细胞，超声破菌，离心分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE 分析菌体，上清和沉淀。带有pXMJ19空载体的BL21 作对照。

1.2.6重组蛋白纯化

按照优化的表达条件，培养600 ml 的argH表达菌液；离心（10000 rpm，5 min）收集菌体；Buffer A 重悬细胞沉淀，冰浴中超声波破碎菌体，4 ℃离心（10000 rpm，10 min），收集上清。上清液上样于预先Buffer A 平衡的Ni sepherose上，流苏0.5 ml/min；Buffer A冲洗柱子，收集杂蛋白；Buffer B 和Buffer C 梯度洗脱并收集目的蛋白，4度保存；取经SDS-PAGE 分离得到的重组argH条带，-20℃保存。

1.2.7 摇瓶发酵产L-精氨酸。

1.2.7.1种子培养基配方（%）

葡萄糖 3.0 g，尿素 0.3g，玉米浆粉 2.5g，KH₂PO₄ 0.15g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.04g，（NH₄）₂SO₄ 0.25g，His 0.003 g，生物素0.00001g。PH 7.11，115℃，15min。

1.2.7.2发酵培养基配方（%）：

葡萄糖 5g，（NH4）₂SO₄3 g（文献中描述是4-7g），玉米浆粉 2.5g，KH₂PO₄ 0.10g，MgSO₄·7H₂O 0.04g，尿素 0.1g，生物素：0.00001g，His： 0.0003g，CaCO₃：1.0g，酚红：0.002g。PH 7.0，115 ℃，15min。

1.2.7.3摇瓶发酵

从斜面上挑取一环菌苔接种于种子培养基（200×30mm的试管，其内装有30ml培养基）中，转速为，115rpm，30℃，培养24小时，10%接种量转接于发酵培养基（250ml喇叭口三角瓶，两瓶，其内装各50 ml培养基）中，转速115rpm，30℃，培养4天（96小时）。离心收集上清液，百里酚法检测L-精氨酸的含量。

1.2.7.4 L-精氨酸的检测

1.2.7.4.1 显色剂的配制

百里酚：称取一定量的百里酚。溶于4%的氢氧化钠中，配制成0.03%溶液

次溴酸钠：准确吸取0.68ml纯溴水溶于100ml 5%的氢氧化钠溶液的，配制成2%的次溴酸钠溶液。装入棕色瓶4℃冷藏，用时以5%氢氧化钠稀释至合适的浓度（次溴酸钠浓度为0.7%，反应在冰水浴中进行）。

尿素溶液（40%）：称取40g尿素溶解在100ml纯水中制成。

标准液的配制：

母液： 准确吸取L-精氨酸100mg，用纯水定容至100ml。L-精氨酸的浓度为1000μg/ml。

100μg/ml标准储存液：精确吸取母液10ml加水定容至100ml。

标准液的配制：精确吸取储存液加水配制成8μg/ml，12μg/ml，16ug/ml，20μg/ml，24μg/ml的精氨酸标准液。

标准曲线的绘制

准确吸取标准液和对照（水）各5ml分置于已编号的比色管中，加入2ml 0.03%百里酚溶液，摇匀，置于冰水浴中20min后加入1ml冰水浴中的次溴酸钠溶液，迅速摇匀，溶液呈黄色，30s内加入1ml 40%尿素用力震荡，使之混合均匀，置于冰水浴中反应1-2min，此后在470nm处测吸光度，制作标准曲线。

发酵液L-精氨酸含量的测定

发酵液过滤的滤液，纯水稀释至一定浓度（8-24μg/ml）。准确吸取稀释的发酵液5ml，分置于比色管中加入2ml 0.03%百里酚液，对照管中加入2ml 4%氢氧化钠溶液，摇匀，置于冰水浴中20min，加入1ml 0.7%的次溴酸钠迅速摇匀，溶液呈黄色。计算：

。

2. 结果

2.1 用热启动PCR 法获得argH编码序列

根据谷氨酸棒杆菌argH的编码序列设计一对PCR 引物，以谷氨酸棒杆菌的基因组为模板，PCR 扩增得到约1400bp大小的DNA片段（图 3），结果与理论1434bp 相符。

2.2 重组质粒的构建和鉴定

pXMJ19 是一个T7表达载体，大小是6601bp，含有抗氯霉素基因。pXMJ19经EcoR I /BamH I双酶切后，取大片段与EcoR I /BamH I 双酶切的PCR产物连接后转化大肠杆菌BL21，37℃培养过夜，挑选能在含有氯霉素的LB平板上生长的菌株，抽提质粒进行双酶切和PCR检测，均得到一个1400bp左右的片段（见附图4）。由于构建重组质粒采用的是两个不同的酶切位点，所以不需要进行克隆插入方向的验证。由此得到了插入片段大小和方向均正确的重组克隆。以pXMJ19 载体的测序通用引物对pXMJ19-argH的插入片段进行测序（由生工生物工程（上海）股份有限公司完成）。经分析软件vector NTI 9.0 比较，重组质粒argH-PXMJ19 的测序结果与GenBank中的谷氨酸棒杆菌ATCC13032编码序列一致，未发现碱基突变，说明重组质粒P argH-PXMJ19 构建成功。

2.3 重组蛋白的表达

重组质粒pXMJ19-argH 在大肠杆菌BL21 和重组黄色短杆菌AN78中的诱导表达产物经SD-PAGE电泳，在大约50 kD 处出现清晰的蛋白条带（图.5），即为重组argH；诱导后的菌体经超声波破碎后取上清进行SDS-PAGE电泳，结果表明有一个50kD左右的蛋白条带出现（见附图5），可见该重组蛋白在上清存在。用Buffer A 重悬收集的适当培养的重组菌，经超声波破碎后，离心收集上清液，用Ni sepharose 对上清中的重组蛋白进行纯化，收集到的与Ni sepharose 特异结合蛋白。对纯化蛋白进行SDS-PAGE分析，单一的50kD 重组蛋白条带。

2.4 摇瓶发酵产L-精氨酸

分别培养的营养缺陷型AN78和营养缺陷型AN78重组菌（pXMJ19-argH），在发酵培养基上培养4天后，5000rpm离心10min收集上清液，分光光度法检测L-精氨酸的含量，标准曲线的绘制见附图6。

通过紫外分光光度计法检测营养缺陷型AN78和AN78重组菌（含质粒pXMJ19-argH ）发酵液中L-精氨酸的含量，营养缺陷型AN78中L-精氨酸的含量20.1g，而重组菌AN78 中L-精氨酸的含量21.8g，结果表明含重组质粒pXMJ19-argH的基因工程菌AN78（A-H）比原始菌种L-精氨酸的产量提高了9%。

Claims (8)

1.一种生产L-精氨酸的基因工程菌株，其特征在于，该菌株为用重组基因工程质粒pXMJ19-argH转化的营养缺陷型黄色短杆菌AN78(p-argH)。

2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其中大肠杆菌选自BL21、DH5α，营养缺陷型黄色短杆菌AN78、谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032之一。

3.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，重组基因工程质粒pXMJ19-argH含有谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032中的精氨酸琥珀酸酶基因核苷酸序列。

4.如权利要求1-3 中任一权利要求所述的基因工程菌株的构建方法，包括下列步骤：

a）以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组为模板，PCR扩增获得编码精氨酸琥珀酸酶基因argH，利用穿梭质粒pXMJ19表达载体构建重组质粒p XMJ19-argH；

b）将pXMJ19-argH转化导入大肠杆菌DH5α和BL21中，鉴定重组质粒的正确性；

c）再将重组质粒pXMJ19-agH转化导入营养缺陷型黄色短杆菌AN78中，鉴定重组质粒的正确性以及含有重组质粒的黄色短杆菌AN78中质粒遗传的稳定性。

5.如权利要求1-4所述的任一权利要求所述基因工程菌主要用于生产L-精氨酸。

6.如权利要求1-5所述的基因工程菌构建方法，其特征在于，其中PCR扩增编码精氨酸琥珀酸酶基因argH所用的引物为：

P2：5′-CGCGGATCCTTATCGACGTACCCCCGC-3′ BamH I 27bp

P3：5′-CGCGAATTCATGGAACAGCACGGAACC3′ EcoR I 27bp。

7.如权利要求1-4中任一权利要求所述基因工程菌株主要用于生产L-精氨酸。

8.用权利要求1-4中任一权利要求所述基因工程菌株生产L-精氨酸方法，包括下列步骤：

a）其出发菌株为权利要求1-4中任一权利要求所述黄色短杆菌AN78基因工程菌株；

b）摇瓶培养发酵：摇床转速为100-300转/分钟，温度为30℃，培养时间3-4天。