CN106636042B - 一种热稳定性和催化活力提高的角蛋白酶突变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种热稳定性和催化活力提高的角蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明的突变体为Y198F，Y291V，Y319F，A322G和A322S；其中A322S在70℃表现出最高酶活力，比P1C2T2增加将近40％。所有突变体的半衰期均大于野生型角蛋白酶KerSMD，其中A322S热稳定性最强，半衰期达到185min。本发明获得四种胞外酶催化活力明显提升的定点突变体198Y198F，Y319F，A322G和A322S，其中Y319F催化活力为最大值1558U/ml，是出发突变体P1C2T2菌株的3倍。比酶活提升明显的角蛋白酶主要有198Y198F、Y319F。因此，本发明的角蛋白酶突变体A322G的热稳定性和胞外角蛋白酶催化活力都获得明显提升，比野生型角蛋白酶更具有应用的价值和潜力。

Description

一种热稳定性和催化活力提高的角蛋白酶突变体

技术领域

本发明涉及一种热稳定性和催化活力提高的角蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

角蛋白酶(keratinase)，是一种由微生物产生，可以降解角蛋白类底物(例如羽毛，羊毛，牛羊角等)的特异性蛋白酶。角蛋白酶作为一种底物专一性宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，在工业化应用中具有很大的潜力，可以替代传统蛋白酶，用于羽毛降解、皮革纺织、饲料添加剂、有机化肥和洗涤剂等方面。此外，角蛋白酶还可效降解引起绵羊瘙痒症和疯牛病的阮病毒。随着工业化的发展，野生菌所产角蛋白酶性能和产量远远不能满足市场需求。目前筛选得到的产角蛋白酶野生菌大多集中在枯草杆菌属，其胞外分泌的酶种类多，底物作用专一性差，而且产酶不稳定，不利于工业化生产。采用基因工程菌，强化基因转录和翻译，达到高效表达和活性分泌，可以有效提高角蛋白酶生产强度。重组角蛋白酶一般经过性能改造，胞外酶活单一，简化了发酵下游的纯化工作。另外，工业化应用上对酶的要求苛刻，如高温环境会很大程度影响角蛋白酶活性。为减省生产成本，必须实现角蛋白酶重复利用，另外还需要催化活力高，底物专一性强的角蛋白酶进行精细化学的催化。人们从自然界筛选分离地角蛋白酶已经远远不能满足工业化需求，所以通过分子改造技术寻求新型角蛋白酶将是一个新的研究手段。

发明人前期对来源于嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophiliaBBE11-1)的角蛋白酶KerSMD进行了异源表达和结构域互换改造，获得了热稳定性提高的角蛋白酶突变体P1C2T2(一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法；申请号：CN201410276309.3)。但在大肠杆菌的胞外表达中，胞外催化活力低。为了进一步提高酶的应用性能，有必要进一步提高角蛋白酶的热稳定性和催化效率。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种角蛋白酶突变体，突变体与野生型角蛋白酶相比有更好的热稳定性和/或催化活力。

本发明的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是在SEQ IDNO.1的角蛋白酶P1C2T2的氨基酸序列的基础上，将第198位的酪氨酸突变成苯丙氨酸(命名为Y198F)、将第291位的酪氨酸突变成缬氨酸(命名为Y291V)、将第319位的酪氨酸突变成苯丙氨酸(命名为Y319F)、将第322位的丙氨酸突变成甘氨酸(命名为A322G)或者将第322位的丙氨酸突变成丝氨酸(命名为A322S)。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶P1C2T2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述角蛋白酶突变体的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述突变体的氨基酸序列的重组质粒载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒载体是在pET系列、pGEX系列、pPICZ系列、pAN系列或pUB中的任意一种质粒的基础上构建得到的。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌，是细菌、酵母或者其他真菌。

本发明还要求保护所述角蛋白酶突变体在羽毛降解、饲料添加剂、皮革处理以及纺织工艺等方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明构建了多个热稳定性或者催化活力得到了提高的角蛋白酶突变体，具体如下：

(1)热稳定性：定点突变体Y198F、A322G和A322S在60℃环境下的比酶活大于出发型突变体P1C2T2以及其他突变体，其中A322S在70℃表现出最高酶活力，比P1C2T2增加将近40％。所有突变体的半衰期均大于野生型角蛋白酶KerSMD，其中突变体A322G和A322S的热稳定明显提升，A322S热稳定性最强，半衰期达到185min。

(2)催化效率：本发明获得四种胞外角蛋白酶催化活力明显提升的定点突变体，分别是Y198F，Y319F和A322G，其中Y319F催化活力为最大值1558U/ml，是出发突变体P1C2T2菌株的3倍。比酶活提升明显的角蛋白酶主要有Y198F和Y319F以及A322G。

此外，本发明还获得了胞外角蛋白酶催化活力和热稳定性都获得明显提高的新型角蛋白酶突变体A322G，比野生型角蛋白酶更具有应用的价值和潜力。

附图说明

图1：角蛋白酶P1C2T2的三维模拟结构；

图2：角蛋白酶突变体的大肠杆菌发酵液上清SDS-PAGE凝胶电泳；其中，M代表蛋白分子量标准，不同泳道名称代表不同的突变蛋白，箭头指示目的蛋白条带位置；

图3：角蛋白酶酶活测定标准曲线；

图4：不同角蛋白酶突变体的大肠杆菌发酵液酶催化活力；

图5：不同角蛋白酶突变体的最适反应温度；

图6：不同角蛋白酶突变体的半衰期和比酶活。

具体实施方式

实施例1：角蛋白酶定点突变体的构建

(1)角蛋白酶P1C2T2突变位点的选择

以本实验以往专利(CN201410276309.3)中的角蛋白酶突变体P1C2T2为基础，构建五种定点突变体。

本发明中，以相似度最高的枯草蛋白酶BprV的晶体结构(PDB ID：3TI7)为模板，通过Modeller V9.11软件构建角蛋白酶P1C2T2成熟蛋白的三维模拟结构(图1)。通过氨基酸一级序列比对发现，枯草蛋白酶BprV和角蛋白酶P1C2T2达到47％的相似度，虽然使用Modeller软件构建获得的模型可以很大程度上满足理性设计要求，但是仍然需要进一步的优化。本发明采用NAMD分子动力学软件对初步构建的模型进行分子动力学计算，来获得能量平衡和最低的模型为角蛋白酶最终三维模型结构。具体分子动力学计算条件如下：CHARMM力场，水盒形状的周期边界条件(periodic boundary condition)，PME(ParticleMesh Ewald)运算法则，设定固定动力学温度310K，1个大气压，以及1纳秒的步骤时长，通过释放整个系统运行获得最低能量值。对于整个蛋白模型结构是否合理的验证，采用网上在线工具SAVES的PROCHECK和ERRAT功能(http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)，当立体空间值大于95％，则视为成功的能量优化模型。

以前导肽C端末尾的4个氨基酸肽链(-Met-Ala-Arg-Thr-)为底物，与角蛋白酶P1C2T2进行分子对接(图1)，定义Thr对应的结合口袋为S1底物结合口袋，Arg对应的是S2底物结合口袋，Ala对应的是S3口袋，Met对应的是S4口袋。AutoDock软件的计算结果显示，影响S1口袋的氨基酸位点是第319位的酪氨酸，影响S2口袋的是第198位酪氨酸，影响S4口袋的是第291位的酪氨酸，以上几个位点都为带电荷的酪氨酸，可能会抵抗具有疏水性的角蛋白底物，抑制底物催化活力。而第322位的丙氨酸靠近S1口袋，其电荷性质可能影响口袋结构的稳定性，造成角蛋白酶热稳定性变化。所以本发明以减少底物结合口袋的疏水性和增强口袋稳定性出发，进行以下五种突变体的构建：Y198F，Y291V，Y319F，A322G和A322S。

(2)五种角蛋白酶P1C2T2定点突变体的构建

根据P1C2T2的序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，分别设计定点突变的引物(表1)，对携带角蛋白酶P1C2T2基因的质粒P1C2T2/pET-22b(+)进行定点突变PCR获得目的突变体质粒，转导感受态大肠杆菌E.coli中进行表达，得到5种角蛋白酶定点突变体。具体如下：

表1不同角蛋白酶定点突变体的引物序列

采用大连宝生物的primeSTAR HS DNA扩增酶，PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变性5min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸7min；最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

PCR产物纯化后，加入限制性内切酶DpnI，37℃，水浴1h，降解模板质粒，之后转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，LB液体培养基培养8-10h，保甘油管，送去测序。测序正确的突变体，从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到能够表达突变体Y198F，Y291V，Y319F，A322G和A322S的五种重组菌株。

实施例2：角蛋白酶突变体的表达和纯化

挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性单克隆于LB液体培养基(含80μg/ml氨苄卡那抗生素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB液体培养基(含含80μg/ml氨苄卡那抗生素)；大肠杆菌在37℃摇床培养2h，至OD₆₀₀＝1.2左右，加入0.2mM终浓度的IPTG诱导细胞进行胞外表达角蛋白酶，并在20℃摇床继续培养发酵48h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心15min除菌体，收集离心发酵上清液，进行SDS-PAGE分析。发现胞外蛋白条带单一，定点突变体的分子量大小接近P1C2T2的46kDa(图2)，另外还发现不同定点突变体的胞外表达量不同，其中突变体Y198F，Y291V，Y319F，A322G和A322S均大于P1C2T2，说明胞外表达量的增加。

采用AKTAavant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化，整个纯化过程温度控制为4℃。由于不同角蛋白酶突变体都含有组氨酸标签，所以可以镍离子亲和层析纯化柱进行分离纯化，具体步骤如下：(1)平衡：用5倍体积的50mmol/LpH 7.2Tris-HCl缓冲液平衡纯化柱；(2)上样：预先处理好的样品以0.5ml/min的流速上样，上样体积一般不超过柱体积的5倍；(3)洗脱：包括洗脱未吸附物质、杂蛋白和目的蛋白，流速1.0ml/min，洗脱液为含有300mM咪唑的50mmol/LpH 7.2Tris-HCl缓冲液，进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分批收集含角蛋白酶酶活的洗脱液；洗脱过程只出现一个目的蛋白洗脱峰，后续测酶活及SDS-PAGE蛋白电泳发现，无论是野生型，还是突变体，峰顶收集的酶液为最纯的部分。

实施例3：酶活分析方法

1)酶活测定方法

角蛋白酶酶活力的测定采用福林-酚试剂显色方法测定。角蛋白酶在一定条件下，水解角蛋白底物释放出酪氨酸。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，而角蛋白底物经过水解，释放游离的酪氨酸为酚类物质，发生显色反应，可以在一定范围内其颜色的深浅与酪氨酸的释放量成正比，故可以在660nm的波长下进行比色，计算酶活。酶活单位定义：在上述条件下，以未反应的样品作为空白对照，将每分钟催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸的每毫升酶量定义为一个酶活单位。

酶活力测定步骤：

A.酶解反应：取适当稀释的发酵液上清200μl和含有2％(w/v)角蛋白的Gly-NaOH缓冲液(50mM,pH 9.0)300μl混合均匀，在50℃下反应10分钟后迅速加入500μl 5％(w/v)三氯乙酸溶液终止反应。使用高速离心机离心10分钟去除沉淀，获得酶解反应液上清。

B.显色反应：取200μl酶解上清液到浓度为5％(w/v)的1ml碳酸钠溶液中，混合均匀后再加入200μl福林-酚试剂(上海生工公司)，50℃下反应显色10分钟后以0μg/ml的酪氨酸标准液作为空白对照测定660nm处的吸光度，根据吸光度值对应的酪氨酸浓度标准曲线计算酪氨酸释放量(图3)。

测定角蛋白酶P1C2T2、五种定点突变体Y198F，Y291V，Y319F，A322G和A322S在大肠杆菌异源表达中，实施例2得到的发酵液的角蛋白酶催化活力(图4)。结果显示，突变体Y198F，Y291V，Y319F，A322G和A322S的胞外酶催化活力分别为1416U/ml、619.2U/ml、1558U/ml、1295U/ml、714.4U/ml，与P1C2T2的560U/ml相比，分别提高了153％、11％、178％、131％、28％。其中Y319F催化活力为最大，是出发突变体P1C2T2菌株的3倍，另外突变体Y198F和A322G的胞外角蛋白酶催化活力也提高明显。

实施例4：角蛋白酶突变体的最适温度和热稳定性

以pH 7.0的Tris-HCl(50mM)为缓冲液，在40到70℃温度范围测定不同纯化的角蛋白酶及突变体的最适反应催化温度。如图5所示，所有角蛋白酶突变体的最适反应温度都为60℃，但是定点突变体Y198F、A322G和A322S在60℃环境下的酶活百分比分别为105％、115％和115％，大于出发型突变体P1C2T2以及其他突变体，其中A322S在70℃表现出最高酶活百分比102％，比P1C2T2的58％增加大于40％，说明突变体Y198F、A322G和A322S都是嗜热性角蛋白酶突变体。

将纯化的角蛋白酶和突变体用50mM pH 7.0Tris-HCl缓冲液稀释至蛋白含量为0.5mg/ml，且pH为7.0，置于60℃恒温水浴中，每隔20min取样一次，测其残留酶活，比较其稳定性，如图6所示。以野生型角蛋白酶KerSMD(NCBI编号：KC814180)和本发明出发型突变体P1C2T2为比较对象，观察不同突变体的半衰期(t_1/2)和比酶活。本发明中所有突变体的半衰期均大于野生型角蛋白酶KerSMD的41min，其中A322S热稳定性最强，半衰期达到185min，是野生型的4.5倍。其他突变体Y198F、Y291V，Y319F和A322G的半衰期分别为76min，92min，90min和160min。而比酶活提升明显的角蛋白酶主要有Y198F、Y319F和A322G，分别为5664U/mg、4933U/mg和3700U/mg，比野生型KerSMD的3409U/mg分别提高了66％、45％和9％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的角蛋白酶P1C2T2的氨基酸序列的基础上，将第198位的酪氨酸突变成苯丙氨酸、将第291位的酪氨酸突变成缬氨酸、将第319位的酪氨酸突变成苯丙氨酸、将第322位的丙氨酸突变成甘氨酸或者将第322位的丙氨酸突变成丝氨酸。

2.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，编码所述角蛋白酶P1C2T2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.编码权利要求1所述角蛋白酶突变体的核苷酸序列。

4.含有权利要求3所述核苷酸序列的重组质粒载体。

5.根据权利要求4所述的重组质粒载体，其特征在于，所述重组质粒载体是在pET系列、pGEX系列、pPICZ系列或pUB中的任意一种质粒的基础上构建得到的。

6.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是细菌或酵母菌。

8.权利要求1所述角蛋白酶突变体的应用，其特征在于，所述应用是应用于羽毛降解、饲料添加剂、皮革处理或者纺织工艺领域。